Protocol
Alle anvendelser dyr er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Boston Børnehospital.
1. Prøvefremstilling
- Tidsindstillet parring
- Placer en C57BL6 vildtype mand og en kvinde sammen i samme bur.
- Check for dannelsen af en parring stik tidligt næste morgen. Den parring stik (aka, vaginal eller samleje stik) er en hærdet gelatinøse deposition, der blokerer vagina.
- Indstil plug dato som embryonisk dag 0,5 (e0.5).
- Isolering af musefostre
- Afliv drægtige hunner ved CO 2 kvælning.
- Sætte mus liggende på en absorberende pude og spray abdominal region med 70% ethanol.
- Løft huden og foretage en indledende indsnit 5 mm ved caudale maveregionen anvendelse af kirurgiske sakse. Skærer og fjerner den abdominale hud til fuldt ud afsløre de indre organer
- Skær nær vagina at fjerne hele livmoderen.
- Skåret mellem implantationssteder langs uterine horn. Hvert segment eller fosteret bør kun have én foster inde.
- Hold uterine segmenter i 1x iskoldt phosphatbufret saltvand (PBS).
- Embryo dissektion
- Placer hver conceptus i en separat skål med iskoldt PBS under et stereoskop.
- Fjern livmodervæv, placenta og derefter fosterhinder sekventielt med fint Dissecting pincet.
- Overfør det dissekerede embryo til et 50 ml rør med 1x iskold PBS under anvendelse af en stor overførsel pipette. Undgå picking up foster direkte med pincet for at minimere vævsskader.
- fiksering
- Fastgør dissekerede embryoner i 10% neutral pufret formalin opløsning ved 4 ° C i mere end 24 timer med mindst 10 prøvevolumener fikseringsopløsning.
- forbehandling
- Forbered Clearing Løsning: 4M urinstof, 10% glycerol, 4% natriumdodecylsulfat (SDS) i dobbelt destilleret vand.
- Udskift fiksativ med Clearing Solution.
- Drej forsigtigt prøven på en rocker ved stuetemperatur i 1 - 2 uger. Udskift Clearing Solution én gang på den anden og den tredje dag. Prøven bliver langsomt klar og gennemskinnelig.
- Udskift Clearing Solution med 10% formalin og efterlade på en rocker i 2 dage.
- Dehydrering
- Vask de forbehandlede prøver med 1x PBS 3 gange i 5 minutter hver.
- Dehydrer prøver i en stigende ethanol serie ved stuetemperatur på en blid rocker. For E15.5 embryoer, brug en stigende ethanol serier, herunder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% og 100% ethanol, 2 timer hvert trin. For ældre fostre, skal øges inkubationstiden.
- Farvning
- Forbered Farvning Løsning: tilføje 0.1375 gram Eosin Y dinatriumsalt og 0,0275 g acridin orange hemi (zinkchlorid) salt til 50 ml 100% ethanol. Der omrøres i 2 timer. Filter med et filtrerpapir. Opbevar ved stuetemperatur og undgå lys ved at dække med aluminiumsfolie.
- Overfør prøven til Farvning løsning i 1 time.
- Udskift med frisk Farvning Solution og pletten natten over.
- Infiltration
- Forbered Infiltration Løsning: kombinere 100 ml opløsning A i JB-4 indlejring kit, 1,25 g katalysator C, 0,275 g Eosin Y dinatriumsalt og 0,055 g Acridin Orange hemi (zinkchlorid) salt. Stir at blande (200 rpm) i en ice bucket i 2 timer, og derefter filtreres med filterpapir.
- Opbevar Infiltration Solution ved 4 ° C og undgå lys ved at dække med aluminiumfolie.
- Overfør embryoner til infiltration Løsning: farvningsopløsning (1: 1), og der inkuberes i mindst 3 timer på en rocker ved 4 ° C.
- Overfør embryoner til infiltration Løsning og inkuberes i 3 timerr på en rocker i et koldt rum.
- Udskift Infiltration Solution gang hver dag, og efterlade i et koldt rum på en blid rocker for yderligere tre dage.
2. Indlejring
- Hold Løsning B og Infiltration Solution på is.
- Gør Embedding Solution (01:25 af opløsning B og Infiltration Solution) umiddelbart før indlejring.
- Orient modellen i en indlejring mug, derefter hælde koldt Embedding Løsning til indlejring mug forsigtigt. Re-orientere med en nål, hvis nødvendigt.
- Brug en nål til at undersøge, om Indlejring Solution er størknet. Skub for at prøven blokken, og trimme det, hvis nødvendigt.
- Drej prøven blok ved hjælp af separate støbeform for at opnå et kryds orientering.
- Sætte en blok holder oven på indlejring mug. Forsigtigt hæld Embedding Solution i formen, indtil formen og indehaveren af blokken er oversvømmet af Indlejring Solution.
- Hold prøven i en sekundær beholder og lad detpå is i 3 - 4 timer i et stinkskab.
- Opbevar størknede prøver i en 4 ° C.
- Skræl væk indlejring mug. Sæt blokken under stereomikroskop med skrå belysning at inspicere position modellen i blokken. På blokken ansigtet, Mark gitterlinjer omkring prøven.
- Trim blokken til at fjerne adgangen mængde indlejring materiale ved hjælp af de markerede gitterlinjer som referencer.
3. Image Acquisition
- Spænd prøven blok til mikrotomen og få en frisk snitflade. Indstil sektion tykkelse (f.eks e9.5-10.5, 1,5 um, e11.5-12.5, 2,0 um, e13.5-15.5, 2,5 um, E16.5-ældre, 3 pm). Hold prøven / blok i udgangspositionen af mikrotom.
- Monter stereo zoom mikroskop vandret mod blokken overflade prøve.
- Tænd for computeren og mikroskopet, og start billede erhvervelse software.
- Visualisere og fokusere optikken til blokken ansigtunder "live view" form for imaging software.
- Juster mikroskop og mikrotom, hvis nødvendigt, således at blokken ansigt er i centrum af søgeren.
- Juster zoom, så hele blokken-ansigt er i søgeren.
- Vælg grønt fluorescerende protein (GFP) filter (excitation 470 ± 20 nm, dikroisk 495 nm, emission 525 ± 25 nm) og målrette hvis nødvendigt.
- Mål og indstille eksponeringen tid manuelt (f.eks 80-400 mini sek).
- Anskaf billeder af blokken ansigt efter hver friske afskårne og gemme billeder automatisk, hvis det er muligt.
- Optag vigtige parametre, herunder opløsning, afsnit tykkelse og zoom.
- Efter afslutning af hele prøven, eksport og konvertere alle billedfiler til JPEG-format, hvis det er nødvendigt.
- Vend alle originale billeder ved hjælp af en imaging forarbejdning software, og justere lysstyrke og kontrast.
- Gem alle de behandlede billeder i en separat mappe.
4. 3DVisualisering
- Upload alle de forarbejdede billeder til en 3D-visualisering software følge anvisningerne.
- Input opløsning og § tykkelse til at konvertere alle billeder til volumetriske data (dvs. voxel størrelse) og gemme 3D-filen.
- Juster alle billeder ved hjælp af den automatiske funktion. Juster individuelle billeder manuelt, hvis det er nødvendigt.
- Gem det justeret billede til et nyt filnavn.
- Analyser morfometriske funktioner i prøven ved hjælp af 3D-visualisering software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har rapporteret høj kvalitet HREM billeder af musefostre mellem E9.5 og E13.5 8. Billedkvaliteten af de sene iscenesat embryoner er imidlertid signifikant kompromitteret på grund af den begrænsede vævspenetration af det fluorescerende farvestof eosin. For at forøge farvningen effektivitet, har vi testet flere forbehandling metoder, der er kompatible med fluorescerende billeddannelse 11. Specifikt blev de E15.5 musefostre behandlet med enten SCA / e A2 12 eller hele kroppen CUBIC 13. Vi har også testet den forenklede formel, Clearing Solution (4 M urinstof, 10% glycerol og 4% natriumdodecylsulfat). Alle metoder forbehandling forøget farvning effektivitet. Embryoner blev gennemskinnelig efter 1 uges behandling med Clearing Solution. Synlige skader væv blev påvist efter behandlingen. De forbehandlede embryoner blev bearbejdet gennem trin, herunder dehydrering, farvning og infiltration før de embedded i plastik indlejring medier. HREM billeder blev erhvervet fra de indlejrede prøven som beskrevet ovenfor i afsnit 3 (Image Acquisition) og vises ved hjælp af en 3D-visualisering software. Et eksempel på hele mount overflade visning af E15.5 embryo demonstrerede detaljerede morfologiske træk i huden, herunder whiskers pads og udviklingslande hårsækkene (figur 1). Opløsning af den virtuelle snitbillede var sammenlignelig med histologisk snit (figur 2).
Figur 1:. 3D Surface View af E15.5 embryo Den viser de detaljerede morfologiske træk i huden. Udviklingslandene hårsækkene (små hvide prikker) er synlige, demonstrerer høj opløsning af billedet. Klik her for at se et større version af dette tal.
Figur 2:. Virtual sektion Udsigt over Midline Udsnit af E15.5 Embryo De interne strukturer, herunder hjerte, lever, tarm og blære er klart synlige. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenteres en modificeret protokol ved at anvende rutine laboratorieudstyr at erhverve serielle HREM billeder, der er kompatible til hurtig 3D visualisering og morfometrisk analyse af komplekse strukturer. Fordi billeder med høj opløsning er taget direkte fra blokken ansigt i stedet for enkelte afsnit, er de fine morfologiske træk bevaret og hurtigt rekonstrueret digitalt i en 3D-visualisering program.
3D billedbehandling giver betydelige fordele i at visualisere og forstå komplekse morfologiske træk. De fleste 3D imaging teknologier afhænger af specialudstyr 1-4. I modsætning hertil EFIC og HREM imaging kun udnytte standard laboratorieudstyr, herunder et stereomikroskop udstyret med et digitalt kamera og en mikrotom 14. Funktionel kobling mellem mikroskop og mikrotom muliggør automatisering af erhvervelse billede muliggør automatisering af hele købet billedet processen. Vi har imidlertid vist, atfunktionelle kobling ikke er obligatorisk 8. I stedet vi simpelthen montere stereomikroskop horisontalt, således at den vender direkte til blokken ansigtet af en standard mikrotom på den hvilende stop. Den største begrænsning i denne enkle opsætning er, at HREM billederne skal tages manuelt. Vi har estimeret, at det tager ca. 5 sek per billede i gennemsnit. En anden begrænsning er, at de enkelte billede kan skifte fra den ene position til en anden, men dette er ikke et problem, fordi de let bliver udrettet under 3D-rekonstruktion.
Ved hjælp af HREM teknologi, har vi analyseret en række 3D-billeder af mus embryoner fra E9.5 til E13.5, og afsløret en ny mekanisme, som den ensomme embryonale kloak forvandler i to separate strukturer, den distale fordøjelseskanalen og den nedre urin skrifter 8. Kvaliteten af HREM billeder af sent iscenesat embryoner er begrænset på grund af ineffektiv indtrængning af eosin (data ikke vist). For at øge væv penetration af E15.5 og e18.5 embryoner, har vi brugt to forskellige forbehandling metoder, der er kompatible med fluorescerende billeddannelse 11 og afprøvet en ny formel, Clearing Solution (4 M urinstof, 10% glycerol og 4% SDS). Alle disse metoder har vist en betydelig forbedring af vævspenetration og eosin-farvning. En vigtig overvejelse før og efter forbehandling er, at prøven er udsat for hævelser i huden eller krympning på grund af osmotisk tryk. For at begrænse den pludselige ændring af osmotisk tryk dermed reducere væv deformation, anbefaler vi en gradvis udveksling af løsningen. Desuden fandt vi, at inddragelse af ethanol hjælper betydeligt (trin 1.5.4). Under infiltration og indlejring trin, er det vigtigt at holde prøven mod lys og ved 4 ˚C.
Kollektivt, dette protokollen bruger rutine laboratorieudstyr til at erhverve HREM billeder, som er kompatibel til høj opløsning 3D-visualisering og morfometrisk analyse. Protokollen should let tilpasses i enhver standard laboratorium indstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
- Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
- Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
- Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
- Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
- Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).
