Protocol
Alle dyr bruker er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Boston Children Hospital.
1. Prøvepreparering
- Tidsbestemt parring
- Plasser en C57BL6 villtype mannlig og en kvinnelig sammen i samme bur.
- Sjekk for dannelsen av en parring plugg tidlig neste morgen. Parings plugg (aka, vaginal eller copulation plugg) er en herdet geléaktig avsetning som blokkerer skjeden.
- Sett pluggen dato som embryonale dag 0,5 (e0.5).
- Isolering av mus embryoer
- Avlive gravide kvinner med CO 2 kvelning.
- Sett mus liggende på en absorberende pute og spray mageregionen med 70% etanol.
- Løft huden og gjøre en innledende 5 mm snitt ved halemageregionen ved hjelp av kirurgisk saks. Kutt og fjern abdominal huden til fullt avsløre de indre organer
- Skjær nær vagina å fjerne hele livmoren.
- Skjær mellom implantasjoner langs livmor horn. Hvert segment eller Conceptus bør ha bare ett embryo inne.
- Hold uterine segmentene i 1x iskald fosfatbufret saltløsning (PBS).
- embryo disseksjon
- Plasser hver Conceptus i en egen rett med iskald PBS under et stereoskop.
- Fjern livmor vev, morkake og deretter fosterhinnene sekvensielt med lekkert dissecting pinsett.
- Overfør dissekert embryoet til et 50 ml rør med 1x iskald PBS ved anvendelse av en stor overføring pipette. Unngå å plukke opp embryo direkte med tang for å minimere vevskader.
- Fiksering
- Fest dissekert embryoer i 10% nøytral bufret formalin løsning ved 4 ° C i mer enn 24 timer med minst 10 prøvevolumer på fiksativ.
- forbehandling
- Klargjør Clearing Løsning: 4M urea, 10% glycerol, 4% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) i dobbeltdestillert vann.
- Bytt fiksativ med Clearing Solution.
- Forsiktig rotere prøven på en rocker i romtemperatur i 1 - 2 uker. Utveksle Clearing Solution gang på den andre og den tredje dagen. Prøven blir langsomt klar og gjennomsiktig.
- Bytt Clearing Solution med 10% formalin og la på en rocker i 2 dager.
- dehydrering
- Vask de forbehandlede prøver med 1 x PBS 3 ganger i 5 minutter hver.
- Dehydrere prøver i en stigende etanol serien ved romtemperatur på en svak rocker. For E15.5 embryoer, bruke en stigende etanol serier som 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% og 100% etanol, 2 timers hvert trinn. For eldre embryoer, må inkubasjonstid økes.
- farging
- Forbered Farging Løsning: legge 0.1375 gram Eosin Y Disodium Salt og 0,0275 g av akridinoransje hemi (sinkklorid) salt til 50 ml 100% etanol. Omrør i 2 timer. Filter med filterpapir. Oppbevar ved romtemperatur og unngå lys ved å dekke med aluminiumsfolie.
- Overføre prøven til fargeløsning i 1 time.
- Erstatt med frisk Farging Solution og flekken over natten.
- Infiltrasjon
- Forbered Infiltrasjon Løsning: Kombiner 100 ml Løsning A av JB-4 forankring kit, 1,25 g av katalysator C, 0,275 g Eosin Y dinatriumsalt og 0,055 g av akridinoransje hemi (sinkklorid) salt. Rør for å blande (200 rpm) i en isen bøtte for 2 timer, og deretter filtrere med filterpapiret.
- Oppbevar Infiltrasjon Solution ved 4 ° C og unngå lys ved å dekke med aluminiumsfolie.
- Overfør embryoene til infiltrering Løsning: fargeløsning (1: 1), og inkuberes i minst 3 timer på et vippe ved 4 ° C.
- Overfør embryoene til infiltrasjon Solution og inkuberes i 3 timerr på en rocker i et kaldt rom.
- Bytt Infiltrasjon løsning en gang hver dag, og la i et kaldt rom på en svak rocker i tre dager.
2. Inkludering
- Hold Løsning B og infiltrasjon løsning på is.
- Gjør Inkludering Solution (01:25 av løsning B og infiltrasjon Solution) umiddelbart før innstøping.
- Orientere prøven i en embedding mold, deretter helle kaldt Embedding Solution inn i embedding mold forsiktig. Re-orientere med en pinne om nødvendig.
- Bruk en nål for å undersøke om Inkludering Solution er stivnet. Trykk ut prøveblokken, og trimme den om nødvendig.
- Snu prøveblokken ved bruk av egen mold å få et kors orientering.
- Sett en blokk holder på toppen av innebygging mugg. Forsiktig helle Embedding Solution i formen til formen og blokkholderen er nedsenket ved å bygge inn Solution.
- Hold prøven i en sekundær beholder og la denpå is i 3-4 timer i en avtrekkshette.
- Oppbevar det størknede prøvestykkene i et 4 ° C.
- Skrelle bort embedding mold. Sett blokken under stereomikroskop med skrå belysning for å inspisere posisjonen til prøven i blokken. På blokken ansiktet, mark rutenettlinjer rundt prøven.
- Trim blokken for å fjerne tilgangen mengde embedding materiale ved bruk av de merkede rutenettlinjene som referanse.
3. Image Acquisition
- Fast prøveblokken til mikrotom og få en frisk snittflaten. Sett snittykkelse (f.eks e9.5-10.5, 1,5 mikrometer, e11.5-12.5, 2,0 mikrometer, e13.5-15.5, 2,5 mikrometer; e16.5-eldre, tre mikrometer). Hold prøven / blokk i utgangsposisjon av mikrotom.
- Monter stereo zoom mikroskop horisontalt mot blokken overflaten av prøven.
- Slå på datamaskinen og mikroskop, og starte bildeinnlastingen programvare.
- Visualisere og fokusere optikken til blokken ansiktunder "live view" modus for bildebehandling.
- Rett mikroskop og mikrotom om nødvendig, slik at blokken-ansikt er i sentrum av søkeren.
- Juster zoomnivået slik at hele blokken ansikt er i søkeren.
- Velg grønt fluorescerende protein (GFP) filter (eksitasjon 470 ± 20 nm, dichroic 495 nm, emisjon 525 ± 25 nm) og refokusere hvis nødvendig.
- Mål og juster eksponeringstiden manuelt (f.eks 80-400 mini sek).
- Hente bilder av blokken ansikt etter hvert frisk klipp og lagre bilder automatisk hvis mulig.
- Rekord viktige parametere inkludert oppløsning, seksjon tykkelse og zoom.
- Etter endt hele prøven, eksport og konvertere alle bildefiler til JPEG-format ved behov.
- Snu alle originale bilder ved hjelp av et bildebehandlingsprogramvare, og justere lysstyrke og kontrast.
- Lagre alle behandlede bilder i en egen mappe.
4. 3Dvisualisering
- Last opp alle de behandlede bilder til en 3D-visualisering programvare følge instruksjonene.
- Input oppløsning og § tykkelse for å konvertere alle bilder til volumetriske data (dvs. voxel størrelse) og lagre 3D-filen.
- Juster alle bilder ved hjelp av automatisk modus. Juster enkeltbilder manuelt om nødvendig.
- Lagre justert bildet til et nytt filnavn.
- Analyser morfometriske funksjoner i prøven ved hjelp av 3D-visualisering programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har rapportert høy kvalitet HREM bilder av mus embryoer mellom e9.5 og e13.5 8. Bildekvalitet av sen trinnvis embryoer, men er betydelig svekket på grunn av begrenset vevspenetrering av det fluorescerende fargestoff eosin. For å øke fargingen effektivitet, har vi testet flere forbehandling metoder som er kompatible med fluoriserende bildebehandling 11. Spesielt de e15.5 museembryoer ble behandlet med enten Sca / e A2 12 eller hele kroppen CUBIC 13. Vi har også testet den forenklede formel, Clearing løsning (4 M urea, 10% glycerol og 4% natriumdodecylsulfat). Alle forbehandling metoder økt farging effektivitet. Embryoet ble gjennomsiktig etter en ukes behandling med Clearing Solution. Ingen åpenbar skade vev ble oppdaget etter behandlingen. De forbehandlet embryoene ble behandlet gjennom trinnene inkludert dehydrering, farging og infiltrasjon før å embedded i plastinnebygging media. HREM bildene ble kjøpt fra den innebygde prøven som beskrevet ovenfor i avsnitt 3 (Image Acquisition) og vises ved hjelp av en 3D-visualisering programvare. Et eksempel på hele mount overflaten utsikt over e15.5 embryo viste detaljerte morfologiske trekk av huden, inkludert whiskers pads og utviklings hårsekkene (figur 1). Oppløsning av den virtuelle snittriss var sammenlignbare med histologiske seksjonen (figur 2).
Figur 1:. 3D Surface View of the e15.5 Embryo Det viser de detaljerte morfologiske egenskaper i huden. Utviklings hårsekkene (små hvite prikker) er åpenbar, viser høy oppløsning på bildet. Klikk her for å se et større version av dette tallet.
Figur 2:. Virtual Section View of Midline Seksjon for e15.5 Embryo De interne strukturer, inkludert hjerte, lever, tarm og blære er godt synlig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en modifisert protokollen ved hjelp av rutinemessig laboratorieutstyr for å skaffe serie HREM bilder som er kompatible for rask 3D-visualisering og morfometrisk analyse av komplekse strukturer. Fordi høyoppløselige bildene er tatt direkte fra blokken ansiktet i stedet for individuelle seksjoner, er de fine morfologiske trekk bevart og raskt rekonstruert digitalt i en 3D-visualisering program.
3D avbildning gir betydelige fordeler i å visualisere og forstå komplekse morfologiske egenskaper. De fleste 3D-bildeteknologi avhenge spesialisert utstyr 1-4. I kontrast, EFIC og HREM bildebehandling kun benytte standard laboratorieutstyr inkludert et stereomikroskop utstyrt med et digitalt kamera og en mikrotom 14. Funksjonell kobling mellom mikroskop og mikrotom muliggjør automatisering av bildet oppkjøpet muliggjør automatisering av hele bildet anskaffelsesprosessen. Vi har imidlertid vist atfunksjonell kobling er ikke obligatorisk 8. I stedet, vi bare montere stereo horisontalt slik at den vender direkte til blokken ansiktet av en standard mikrotom på hvilestoppstilling. Den store begrensning av denne enkle oppsettet er at HREM bildene må tas manuelt. Vi har beregnet at det tar ca 5 sek per bilde i gjennomsnitt. En annen begrensning er at enkeltbilde kan skifte fra en posisjon til en annen, men dette er ikke et problem fordi de er lett realigned under 3D-rekonstruksjon.
Ved hjelp av HREM teknologi, har vi analysert en rekke 3D bilder av mus embryo fra e9.5 til e13.5, og avdekket en ny mekanisme ved hjelp av hvilken ensom embryonale cloaca transformeres inn i to separate strukturer, den distale fordøyelseskanalen og den nedre urin traktater 8. Kvaliteten på HREM bilder av sent iscenesatt embryoer er begrenset på grunn av ineffektiv penetrasjon av eosin (data ikke vist). For å øke vev penetrasjon av e15.5 og e18.5 embryoer, har vi brukt to forskjellige forbehandling metoder som er kompatible med fluorescerende avbildning 11 og testet en ny formel, Clearing Solution (4 M urea, 10% glyserol og 4% SDS). Alle disse metodene har vist betydelig forbedring av vevspenetrering og eosin-farging. En viktig betraktning før og etter forbehandling er at prøven er utsatt for hud svelling eller krymping på grunn av osmotisk trykk. For å begrense den plutselige forandring av det osmotiske trykk for derved å redusere vev deformasjon, anbefaler gradvis utveksling av løsningen. I tillegg fant vi at inkludering av etanol bidrar signifikant (trinn 1.5.4). Under infiltrasjon og innebygging trinn, er det viktig å holde prøven fra lys og ved 4 ° C.
Samlet bruker denne protokollen rutinemessig laboratorieutstyr for å skaffe HREM bilder, som er kompatibelt for høyoppløselig 3D-visualisering og morfometrisk analyse. Protokollen should lett tilpasses på hvilken som helst standard laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
- Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
- Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
- Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
- Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
- Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).
