Protocol
Tutti gli usi animali sono approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali all'ospedale dei bambini Boston.
Preparazione 1. Esempio
- accoppiamento temporizzata
- Inserire un C57Bl6 tipo selvaggio maschio e una femmina insieme nella stessa gabbia.
- Controllare per la formazione di una spina di accoppiamento mattina successiva. La spina di accoppiamento (aka, vaginale o la spina copula) è una deposizione gelatinosa indurito che blocca la vagina.
- Impostare la data presa come giorno embrionale 0,5 (E0.5).
- Isolamento di embrioni di topo
- Eutanasia femmine gravide da CO 2 asfissia.
- Mettere topi supina su un tampone assorbente e spruzzare regione addominale con il 70% di etanolo.
- Sollevare la pelle e rendere una prima incisione 5 mm per la regione addominale caudale con le forbici chirurgiche. Tagliare e rimuovere la pelle addominale per esporre completamente gli organi interni
- Tagliare vicino vagina per rimuovere l'intero utero.
- Tagliare tra i siti di impianto lungo il corno uterino. Ogni segmento o concepito dovrebbe avere un solo embrione dentro.
- Mantenere i segmenti uterine a 1x fosfato ghiacciata salina tamponata (PBS).
- embrione dissezione
- Luogo ogni conceptus in un piatto a parte con PBS ghiacciato sotto uno stereoscopio.
- Rimuovere i tessuti uterini, placenta e poi membrane fetali in modo sequenziale utilizzando dissettore sottili.
- Trasferire l'embrione sezionato ad un tubo da 50 ml con 1x freddo ghiaccio PBS utilizzando una pipetta di trasferimento di grandi dimensioni. Evitare di raccogliere embrione direttamente con una pinza per ridurre al minimo i danni ai tessuti.
- Fissazione
- Fissare gli embrioni sezionati a 10% soluzione neutra formalina tamponata a 4 ° C per più di 24 ore con almeno 10 volumi di campione di fissativo.
- Pretrattamento
- Preparare la Soluzione Clearing: 4M urea, 10% glicerolo, 4% di sodio dodecilsolfato (SDS) in acqua bidistillata.
- Sostituire il fissativo con la soluzione Clearing.
- Ruotare delicatamente il campione su un rocker a temperatura ambiente per 1 - 2 settimane. Sostituire la soluzione compensazione una volta al secondo e al terzo giorno. Il campione diventa lentamente chiaro e traslucido.
- Sostituire la soluzione di compensazione con formalina al 10% e lasciare su una sedia a dondolo per 2 giorni.
- Disidratazione
- Lavare i campioni pretrattati con 1x PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
- Disidratare i campioni in una serie di etanolo ascendente a temperatura ambiente su una sedia a dondolo gentile. Per embrioni E15.5, utilizzare una serie ascendente di etanolo incluso il 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100% etanolo, 2 hr ogni passo. Per embrioni più vecchi, il tempo di incubazione deve essere aumentata.
- colorazione
- Preparare la colorazione Soluzione: aggiungere 0.1375 grammi di eosina Y Disodium Salt e 0,0275 grammi di arancio di acridina emi (cloruro di zinco) sale a 50 ml di etanolo al 100%. Mescolare per 2 ore. Filtro con una carta da filtro. Conservare a temperatura ambiente ed evitare la luce coprendo con un foglio di alluminio.
- Trasferire esemplare per la soluzione colorante per 1 ora.
- Sostituire con soluzione colorante fresco e macchia durante la notte.
- Infiltrazione
- Preparare infiltrazione Soluzione: coniugare 100 ml di soluzione A di JB-4 kit di embedding, 1,25 g di catalizzatore C, 0,275 g di eosina Y Disodium Salt e 0,055 g di acridina arancio emi (cloruro di zinco) sale. Mescolare per mescolare (200 rpm) in un secchio di ghiaccio per 2 ore, e poi filtrare con la carta da filtro.
- Conservare la soluzione di infiltrazione a 4 ° C per evitare la luce coprendo con un foglio di alluminio.
- Trasferire gli embrioni per infiltrazione Soluzione: La colorazione Soluzione (1: 1), e incubare per almeno 3 ore su una sedia a dondolo a 4 ° C.
- Trasferire gli embrioni per infiltrazione Solution e incubare per 3 orer su un bilanciere in una camera fredda.
- Sostituire infiltrazione soluzione una volta al giorno, e lasciare in una stanza fredda su una sedia a dondolo dolce per altri tre giorni.
2. Embedding
- Mantenere Soluzione B e l'infiltrazione soluzione su ghiaccio.
- Fare Embedding Solution (01:25 di soluzione B e infiltrazione Solution) immediatamente prima di incorporamento.
- Orientare il campione in uno stampo embedding, poi versare freddo Solution Incorporare nello stampo embedding delicatamente. Ri-orientare con uno spillo, se necessario.
- Utilizzare un perno per esaminare se la soluzione Embedding è solidificato. Spingere il blocco del campione, e tagliare, se necessario.
- Riorientare il blocco del campione usando lo stampo separata per ottenere un orientamento trasversale.
- Mettere un titolare di blocco sulla parte superiore dello stampo embedding. Delicatamente versare Integrazione Soluzione nello stampo fino a quando lo stampo e il titolare del blocco sono sommersi da Incorporare Solution.
- Conservare il campione in un contenitore secondario e lasciarein ghiaccio per 3 - 4 ore in una cappa aspirante.
- Conservare i campioni solidificati in un 4 ° C.
- Sbucciare via lo stampo embedding. Mettere il blocco con lo stereomicroscopio con illuminazione obliqua per ispezionare la posizione del campione nel blocco. Sulla faccia del blocco, le linee della griglia marchio in tutto il campione.
- Tagliare il blocco per rimuovere quantità accesso di incorporare materiale utilizzando le linee della griglia indicati come riferimenti.
3. Acquisizione di immagini
- Bloccare il blocco del campione al microtomo e ottenere una superficie di taglio fresco. Impostare lo spessore della sezione (ad esempio, e9.5-10.5, 1,5 micron; e11.5-12.5, 2,0 micron; e13.5-15.5, 2,5 micron; E16.5-anziani, 3 micron). Mantenere il campione / blocco alla posizione iniziale del microtomo.
- Montare il stereo microscopio con zoom fronte orizzontalmente la superficie del blocco di campione.
- Accendere il computer e il microscopio, e avviare il software di acquisizione delle immagini.
- Visualizzare e mettere a fuoco l'ottica al blocco facciain modalità "live view" del software di imaging.
- Allineate microscopio e microtomo se necessario in modo che il blocco faccia è al centro del mirino.
- Regolare zoom in modo che l'intero blocco-faccia è nel mirino.
- Selezionare verde filtro proteina fluorescente (GFP) (eccitazione 470 ± 20 nm, dicroiche 495 nm, emissione di 525 ± 25 nm) e riorientare, se necessario.
- Misurare e impostare il tempo di esposizione manualmente (ad esempio, 80-400 mini sec).
- Acquisire le immagini del blocco faccia dopo ogni taglio fresco e salvare automaticamente le immagini, se possibile.
- Registra parametri importanti, tra cui la risoluzione, spessore della sezione e lo zoom.
- Dopo aver terminato l'intero campione, l'esportazione e convertire tutti i file di immagine in formato JPEG, se necessario.
- Invertire tutte le immagini originali che utilizzano un software di elaborazione delle immagini, e regolare la luminosità e il contrasto.
- Salvare tutte le immagini elaborate in una cartella separata.
4. 3DVisualizzazione
- Carica tutte le immagini elaborate da un software di visualizzazione 3D seguendo le istruzioni.
- Risoluzione e spessore della sezione per convertire tutte le immagini a dati volumetrici (ad esempio, le dimensioni voxel) e salvare il file 3D.
- Allineare tutte le immagini utilizzando la modalità automatica. Regolare le singole immagini manualmente, se necessario.
- Salvare l'immagine allineata a un nuovo nome file.
- Analizzare le caratteristiche morfometriche del campione utilizzando il software di visualizzazione 3D.
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Representative Results
Abbiamo riportato le immagini HREM di alta qualità di embrioni di topo tra E9.5 e E13.5 8. La qualità dell'immagine degli embrioni fine scena, tuttavia, è notevolmente compromessa a causa della penetrazione tissutale limitata del eosina colorante fluorescente. Per aumentare l'efficienza di colorazione, abbiamo testato diversi metodi di pretrattamento che sono compatibili all'imaging fluorescente 11. In particolare, gli embrioni di topo E15.5 sono stati trattati con Sca / e A2 12 o corpo intero CUBIC 13. Abbiamo anche testato la formula semplificata, la soluzione Clearing (4 M urea, 10% glicerolo e 4% dodecil solfato di sodio). Tutti i metodi di pretrattamento maggiore efficienza colorazione. Gli embrioni diventato traslucido dopo 1 settimana di trattamento con la soluzione Clearing. Nessun danno ai tessuti evidente è stata rilevata dopo il trattamento. Gli embrioni pretrattati sono stati elaborati attraverso passaggi tra cui la disidratazione, la colorazione e l'infiltrazione prima di essere embedded nei mezzi di comunicazione di inclusione. immagini HREM sono state acquisite dal campione incorporati come sopra descritto nella sezione 3 (Image Acquisition) e visualizzati utilizzando un software di visualizzazione 3D. Un esempio di tutto il monte vista superficie E15.5 embrione ha dimostrato caratteristiche morfologiche dettagliate della pelle, tra cui i rilievi baffi e in via di sviluppo follicoli piliferi (Figura 1). Risoluzione della vista di sezione virtual era paragonabile alla sezione istologica (figura 2).
Figura 1:. 3D Surface Vista del Embryo E15.5 Essa mostra le caratteristiche morfologiche dettagliate della pelle. I follicoli dei capelli in via di sviluppo (piccoli punti bianchi) sono evidenti, dimostrando ad alta risoluzione delle immagini. Clicca qui per visualizzare un grande version di questa figura.
Figura 2:. Il Salone Virtuale Vista in sezione della linea mediana Sezione della Embryo E15.5 Le strutture interne, compreso il cuore, il fegato, intestino e vescica sono chiaramente visibili. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, vi presentiamo un protocollo modificato utilizzando attrezzature di laboratorio di routine per acquisire immagini HREM seriali che sono compatibili per la visualizzazione 3D rapida e analisi morfometrica di strutture complesse. Perché le immagini ad alta risoluzione sono presi direttamente dalla faccia blocco, invece di singole sezioni, le caratteristiche morfologiche pregiati sono conservati e rapidamente ricostruito digitalmente in un programma di visualizzazione 3D.
imaging 3D offre notevoli vantaggi nel visualizzare e comprendere caratteristiche morfologiche complesse. La maggior parte delle tecnologie di imaging 3D dipendono da attrezzature specializzate 1-4. Al contrario, EFIC e di imaging HREM utilizzano solo attrezzature di laboratorio standard compreso uno stereomicroscopio dotato di una fotocamera digitale e un microtomo 14. accoppiamento funzionale tra microscopio e microtomo consente l'automazione di acquisizione delle immagini permette automazione dell'intero processo di acquisizione dell'immagine. Tuttavia, abbiamo dimostrato cheaccoppiamento funzionale non è obbligatoria 8. Invece, abbiamo semplicemente montare lo stereomicroscopio orizzontalmente in modo che sia rivolto direttamente al volto blocco di un microtomo standard al punto di arresto di riposo. Il principale limite di questo semplice configurazione è che le immagini HREM devono essere presi manualmente. Abbiamo stimato che ci vogliono circa 5 secondi per immagine in media. Un'altra limitazione è che singola immagine può passare da una posizione all'altra, ma questo non è un problema in quanto sono facilmente riallineate durante la ricostruzione 3D.
Utilizzando la tecnologia HREM, abbiamo analizzato una serie di immagini 3D di embrioni di topo da E9.5 a E13.5, e scoperto un nuovo meccanismo attraverso il quale la cloaca embrionale solitario si trasforma in due strutture separate, il tubo digerente distale e il urinario inferiore tratti 8. Qualità delle immagini HREM di ritardo in scena embrioni è limitata a causa della penetrazione inefficiente di eosina (dati non riportati). Per aumentare Penetr tessutozione di E15.5 e e18.5 embrioni, abbiamo utilizzato due diversi metodi di pretrattamento che sono compatibili per l'imaging a fluorescenza 11 e testato una nuova formula, la soluzione Clearing (4 M urea, 10% glicerolo e 4% SDS). Tutti questi metodi hanno mostrato un miglioramento significativo della penetrazione dei tessuti e eosina. Una considerazione importante prima e dopo pretrattamento è che il campione è incline alla pelle gonfiore o contrazione a causa della pressione osmotica. Per limitare l'improvviso cambiamento di pressione osmotica ridurre in tal modo la deformazione del tessuto, si consiglia graduale scambio della soluzione. Inoltre, abbiamo scoperto che l'inclusione di etanolo contribuisce in modo significativo (il passo 1.5.4). Durante infiltrazione e gradini incorporamento, è importante mantenere il campione dalla luce ea 4 ° C.
Collettivamente, questo protocollo utilizza attrezzature di laboratorio di routine per acquisire immagini HREM, che è compatibile per la visualizzazione 3D ad alta risoluzione e analisi morfometrica. Il protocollo shouLd essere facilmente adattato a qualsiasi ambiente di laboratorio standard.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
- Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
- Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
- Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
- Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
- Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
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- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
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