Protocol
Alla djur användningsområden är godkända av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Boston barnsjukhus.
1. Provframställning
- timed parning
- Placera en C57BL6 vild typ manlig och en kvinnlig tillsammans i samma bur.
- Kontrollera om bildandet av en passande plugg tidigt nästa morgon. Parnings plugg (aka, vaginal eller copulationen kontakten) är en härdad geléform nedfall som blockerar slidan.
- Ställ pluggen datum embryonala dag 0,5 (e0.5).
- Isolering av musembryon
- Avliva dräktiga honor av CO 2 kvävning.
- Sätta möss på rygg på en absorberande dyna och spraya abdominal region med 70% etanol.
- Lyft huden och gör en första 5 mm snitt vid den bakre delen av buken regionen med hjälp av kirurgisk sax. Skära och ta bort bukhuden att fullständigt exponera de inre organen
- Skära nära vagina att ta bort hela livmodern.
- Skära mellan implantationsställen längs livmoderhornet. Varje segment eller Conceptus bör ha endast ett embryo inuti.
- Håll livmodersegmenten i 1x iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- embryo dissektion
- Placera varje Conceptus i en separat skål med iskall PBS under stereoskop.
- Ta bort livmodervävnad, placenta och sedan fosterhinnorna sekventiellt med fin dissekera pincett.
- Överföra dissekerade embryot till ett 50 ml rör med 1x iskall PBS med användning av en stor överföringspipett. Undvik att plocka upp embryo direkt med pincett för att minimera vävnadsskador.
- Fixering
- Fäst dissekerade embryon i 10% neutral buffrad formalinlösning vid 4 ° C under mer än 24 timmar med minst 10 provvolymer av fixativ.
- förbehandling
- Förbered Clearing Lösning: 4M urea, 10% glycerol, 4% natriumdodecylsulfat (SDS) i dubbeldestillerat vatten.
- Byt ut fixerings med Clearing Solution.
- Rotera försiktigt provet på en rocker vid rumstemperatur under 1 - 2 veckor. Utbyta Clearing lösning en gång på den andra och den tredje dagen. Provet blir långsamt klar och genomskinlig.
- Byt Clearing lösning med 10% formalin och lämna på en rocker i 2 dagar.
- Uttorkning
- Tvätta de förbehandlade proven med 1x PBS 3 gånger under 5 min vardera.
- Dehydratisera prover i en stigande etanolserie vid rumstemperatur på en mild rocker. För E15.5 embryon, använder en stigande etanolserie inkluderande 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% och 100% etanol, 2 timmar varje steg. För äldre embryon, måste inkubationstiden ökas.
- färgning
- Förbered färglösningen: lägg 0.1375 gram Eosin Y dinatriumsalt och 0,0275 gram akridinorange hemi (zinkklorid) salt till 50 ml 100% etanol. Rör om under 2 timmar. Filter med ett filterpapper. Förvara vid rumstemperatur och undvika ljus genom att täcka med aluminiumfolie.
- Överför provet till färgningslösningen under 1 timme.
- Ersätt med färska färglösningen och fläck natten.
- Infiltration
- Förbereda Infiltration Lösning: kombinera 100 ml av lösning A i JB-4 inbäddning kit, 1,25 g av katalysator C, 0,275 g av Eosin Y dinatriumsalt och 0,055 g av akridinorange hemi (zinkklorid) salt. Rör om för att blanda (200 rpm) i en ishink under 2 timmar, och sedan filtrera med filterpapper.
- Förvara Infiltration lösning vid 4 ° C och undvika ljus genom att täcka med aluminiumfolie.
- Överföra embryon till Infiltration Lösning: Färgningslösning (1: 1), och inkubera under åtminstone 3 h på en rocker vid 4 ° C.
- Överföra embryon till infiltrationslösning och inkubera under 3 hr på en vippa i ett kallt rum.
- Byt Infiltration lösning en gång om dagen, och lämna i ett kallt rum på en liten rocker i tre dagar.
2. Inbäddning
- Håll Lösning B och Infiltration lösningen på is.
- Gör inbäddning Solution (1:25 av lösning B och Infiltration Solution) omedelbart före inbäddning.
- Orient förlagan i en inbäddning mögel, häll sedan kallt inbäddning lösning i inbäddning formen försiktigt. Åter orientera med en PIN-kod om det behövs.
- Använd en nål för att undersöka om Bädda lösning stelnar. Tryck ut preparatet, och trimma det om det behövs.
- Omorientera preparatet med hjälp av separat form för att erhålla en tvär orientering.
- Sätt en blockhållare ovanpå inbäddning mögel. Häll försiktigt Bädda lösning i formen tills formen och blockhållaren är nedsänkta genom att bädda in Solution.
- Förvara provet i en sekundär behållare och lämna denpå is under 3-4 h i ett dragskåp.
- Lagra de stelnade provkropparna i ett 4 ° C.
- Skala bort inbäddning mögel. Placera blocket under stereomikroskop med sned belysning för att inspektera läget av provet i blocket. På blocket ansiktet, markera rutnätslinjer runt provet.
- Trimma blocket att ta bort åtkomst mängden inbäddningsmaterial med hjälp av markerade rutnätslinjer som referenser.
3. Image Acquisition
- Kläm preparatet till mikrotomen och få en ny snittyta. Ställ snittjocklek (t.ex. e9.5-10.5, 1,5 m; e11.5-12.5, 2,0 m; e13.5-15.5, 2,5 m; E16.5-äldre, 3 pm). Håll provet / blocket i utgångsläget av mikrotomen.
- Montera stereozoom mikroskop horisontellt mot blocket ytan av provet.
- Slå på datorn och mikroskop, och starta bilden förvärvet programvara.
- Visualisera och fokusera optiken till blocket ansikteunder "live view" -läge av bildprogram.
- Rikta mikroskop och mikrotom vid behov så att blocket ansikte är i mitten av sökaren.
- Justera zoomningen så att hela blocket ansikte är inom sökaren.
- Välj grönt fluorescerande protein (GFP) filter (excitation 470 ± 20 nm, dikroiskt 495 nm, emission 525 ± 25 nm) och fokusera om det behövs.
- Mät och ställ in exponeringstiden manuellt (t.ex. 80-400 mini sek).
- Förvärva bilder av block ansiktet efter varje nyklippt och spara bilder automatiskt om det är möjligt.
- Spela viktiga parametrar inklusive upplösning, snittjocklek och zoom.
- Efter avslutad hela provet, export och konvertera alla bildfiler till JPEG-format om det behövs.
- Vänd alla ursprungliga bilder med hjälp av en bildbehandling programvara och justera ljusstyrka och kontrast.
- Spara alla de bearbetade bilderna i en separat mapp.
4. 3Dvisualisering
- Ladda alla bearbetade bilder till en 3D-visualisering programvara enligt instruktionerna.
- Ingångsupplösning och snittjocklek att konvertera alla bilder till volymdata (dvs voxel storlek) och spara 3D-filen.
- Rikta alla bilder med det automatiska läget. Justera enskilda bilderna manuellt om det behövs.
- Spara inriktade bilden till ett nytt filnamn.
- Analysera morfometriska funktioner i provet med hjälp av 3D-visualisering programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har rapporterat HREM bilder av musembryon mellan E9.5 och E13.5 8 av hög kvalitet. Bildkvaliteten av de sena iscensatt embryon, emellertid är påtagligt nedsatt på grund av den begränsade vävnadspenetration av det fluorescerande färgämnet eosin. För att öka färgningseffektiviteten, har vi testat flera förbehandlingsmetoder som är förenliga med fluorescerande avbildning 11. Specifikt de E15.5 musembryon behandlades med antingen Sca / e A2 12 eller hela kroppen CUBIC 13. Vi har också testat den förenklade formeln, Clear Solution (4 M urea, 10% glycerol och 4% natriumdodecylsulfat). Alla förbehandlingsmetoder ökad färgningseffektivitet. Embryon blev genomskinliga efter en veckas behandling med Clear Solution. Inga uppenbara vävnadsskada upptäcktes efter behandlingen. De förbehandlade embryon bearbetades genom stegen inklusive uttorkning, färgning och infiltration innan de embedded i plast inbäddning media. HREM bilder förvärvades från de inbäddade provet som beskrivs ovan i avsnitt 3 (Image Acquisition) och visas med en 3D-visualisering programvara. Ett exempel på hela berget yta tanke på E15.5 embryo visade detaljerade morfologiska funktioner i huden inklusive whiskers kuddar och utvecklings hårsäckar (Figur 1). Upplösning av den virtuella sektionsvy var jämförbar med histologisk sektion (figur 2).
Figur 1:. 3D-yta Vy över E15.5 Embryo Den visar detaljerade morfologiska funktioner i huden. Utvecklings hårsäckar (små vita prickar) är uppenbara, vilket visar hög upplösning av bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Den virtuella avsnitt Vy över Midline sektionen vid E15.5 Embryo De interna strukturer, inklusive hjärta, lever, tarm och urinblåsa syns tydligt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett modifierat protokoll användning av rutinlaboratorieutrustning för att få serie HREM bilder som är kompatibla för snabb 3D-visualisering och morfometrisk analys av komplexa strukturer. Eftersom högupplösta bilder tas direkt från blocket ansikte i stället för enskilda delar, är de fina morfologiska egenskaper bevaras och snabbt rekonstrueras digitalt i en 3D-visualisering program.
3D-röntgen ger betydande fördelar i att visualisera och förstå komplexa morfologiska egenskaper. De flesta 3D bildteknik är beroende av specialutrustning 1-4. Däremot endast EFIC och HREM avbildning använder standardlaboratorieutrustning inklusive en stereo utrustad med en digitalkamera och en mikrotom 14. Funktionell koppling mellan mikroskop och mikrotom möjliggör automatisering av bilden förvärvet möjliggör automatisering av hela bilden förvärvsprocessen. Däremot har vi visat attfunktionell koppling är inte obligatorisk 8. I stället vi helt enkelt montera stereohorisontellt så att den är vänd direkt till blocket ansiktet av en standard mikrotom vid vilande stoppläge. Den största begränsningen av denna enkla installationen är att HREM bilder måste tas manuellt. Vi har uppskattat att det tar ungefär fem sekunder per bild i genomsnitt. En annan begränsning är att enskild bild kan skifta från en position till en annan, men det är inte ett problem eftersom de lätt uträtad under 3D-rekonstruktion.
Med hjälp av HREM teknik, har vi analyserat en serie 3D-bilder av musembryon från E9.5 till E13.5, och avslöjade en ny mekanism genom vilken den ensamme embryonala kloak förvandlas till två separata strukturer, den distala mag-tarmkanalen och de nedre urin områden 8. Kvaliteten på HREM bilder av sent iscensatt embryon är begränsad på grund av ineffektiv penetration av eosin (data ej visade). För att öka vävnads Penetreringation av E15.5 och e18.5 embryon, har vi använt två olika förbehandlingsmetoder som är kompatibla med fluorescerande avbildning 11 och testat en ny formel, Clearing Solution (4 M urea, 10% glycerol och 4% SDS). Alla dessa metoder har visat signifikant förbättring av vävnadspenetration och eosin färgning. En viktig faktor före och efter förbehandling är att provet är benägen att huden svullnad eller krympning på grund av det osmotiska trycket. För att begränsa den plötsliga förändringen av det osmotiska trycket och därmed minska vävnads deformation, vi rekommenderar gradvis utbyte av lösningen. Dessutom fann vi att införandet av etanol bidrar signifikant (steg 1.5.4). Under infiltration och inbäddning steg, är det viktigt att hålla provet från ljus och vid 4 ° C.
Sammantaget använder detta protokoll rutin laboratorieutrustning för att förvärva HREM bilder, som är kompatibel med hög upplösning 3D-visualisering och morfometrisk analys. Protokollet should lätt anpassas i någon standard laboratoriemiljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
- Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
- Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
- Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
- Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
- Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).
