Protocol
Alle Tier Anwendungen werden von der Institutional Animal Care und Use Committee bei Boston Kinderkrankenhaus zugelassen.
1. Probenvorbereitung
- Timed Paarung
- Legen Sie eine C57Bl6 Wildtyp-Männchen und ein Weibchen zusammen in der gleichen Käfig.
- Prüfen Sie, ob die Bildung eines Gegenstecker früh am nächsten Morgen. Der Gegenstecker ist (aka, vaginal oder Kopulation Stecker) eine gehärtete gallertartig Ablagerung der Vagina, blockiert.
- Stellen Sie den Stecker Datum wie embryonale Tag 0.5 (E0.5).
- Isolierung von Maus - Embryonen
- Euthanize trächtige Weibchen von CO 2 Ersticken.
- Setzen Sie Mäuse in Rückenlage auf einem absorbierenden Kissen und Spray Bauchbereich mit 70% Ethanol.
- Heben Sie die Haut und machen einen anfänglichen 5 mm Schnitt an der Schwanzbauchregion mit chirurgische Scheren. Schneiden Sie und entfernen Sie die Bauchhaut vollständig die inneren Organe aussetzen
- Schneiden Sie in der Nähe von vagina die gesamte Gebärmutter zu entfernen.
- Schneiden Sie zwischen Implantationsstellen entlang der Uterushorn. Jedes Segment oder conceptus sollte innerhalb nur ein Embryo haben.
- Halten Sie die Gebärmutter-Segmente in 1x eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
- Embryo Dissektion
- Platzieren Sie jede conceptus in einer separaten Schüssel mit eiskaltem PBS unter einem Stereoskop.
- Entfernen Sie Gebärmuttergewebe, Plazenta und dann sequentiell Eihüllen mit feinen Dissektionszangen.
- Übertragen Sie die seziert Embryo in einen 50-ml-Röhrchen mit 1x eiskaltem PBS eine große Transferpipette. Vermeiden Embryo Aufnehmen direkt mit einer Pinzette Gewebeschäden zu minimieren.
- Fixierung
- Fixieren die sezierten Embryonen in 10% neutral gepuffertem Formalin-Lösung bei 4 ° C für mehr als 24 h mit mindestens 10 Probenvolumina von Fixativ.
- Vorbehandlung
- Bereiten Sie die Clearing-Lösung: 4M Harnstoff, 10% Glycerin, 4% Natriumdodecylsulfat (SDS) in doppelt destilliertem Wasser.
- Ersetzen Sie das Fixiermittel mit der Clearing-Lösung.
- Vorsichtig drehen für auf einer Wippe bei Raumtemperatur 1 die Probe - 2 Wochen. Tauschen Sie die Clearing-Lösung einmal auf dem zweiten und dritten Tag. Die Probe wird langsam klar und durchscheinend.
- Ersetzen Sie die Clearing-Lösung mit 10% Formalin und verlassen auf einer Wippe für 2 Tage.
- Entwässerung
- Waschen Sie die vorbehandelten Proben mit 1x PBS 3 mal für jeweils 5 Minuten.
- Entwässern Proben in einer aufsteigenden Ethanolreihe bei Raumtemperatur auf einem sanften Rocker. Für E15.5 Embryonen, verwenden eine aufsteigende Ethanolreihe einschließlich 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% und 100% Ethanol, 2 Stunden jeden Schritt. Für ältere Embryonen, muss die Inkubationszeit erhöht werden.
- Die Färbung
- Bereiten Sie Färbelösung: add 0,1375 Gramm Eosin Y Dinatriumsalz und 0,0275 g Acridinorange hemi (Zinkchlorid) -Salzes zu 50 ml 100% Ethanol. Rühre 2 Stunden. Filter mit einem Filterpapier. Lagerung bei Raumtemperatur und vermeiden Licht, indem sie mit Alufolie abdecken.
- Übertragen Probe zu der Färbungslösung für 1 Stunde.
- Ersetzen mit frischem Färbelösung und Flecken über Nacht.
- Infiltration
- Bereiten Sie Infiltrationslösung: Kombinieren Sie 100 ml Lösung A von JB-4 Einbettungssatz, 1,25 g Katalysator C, 0,275 g Eosin Y Dinatriumsalz und 0,055 g Acridinorange Hemi (Zinkchlorid) Salz. Rühre 2 h (200 Upm) in einem Eisbehälter zu mischen, und dann mit dem Filterpapier gefiltert.
- Bewahren Sie die Infiltrationslösung bei 4 ° C und vermeiden Licht durch Abdecken mit Aluminiumfolie.
- Übertragen Sie die Embryonen Lösung Infiltrations: Färbelösung (1: 1), und Inkubation für mindestens 3 Stunden auf einer Wippe bei 4 ° C.
- Übertragen Sie die Embryonen Lösung Infiltrations und Inkubation für 3 hr auf einer Wippe in einem kalten Raum.
- in einem kalten Raum auf einem sanften Rocker für drei weitere Tage ersetzen einmal Infiltrationslösung jeden Tag, und lassen.
2. Embedding
- Halten Sie die Lösung B und Infiltrationslösung auf Eis.
- Machen Sie Embedding Solution (01.25 der Lösung B und Infiltrationslösung) unmittelbar vor dem Einbetten.
- Richten Sie die Probe in einer Einbettform, dann gießen kalt Embedding-Lösung in die Einbettform sanft. Re-Orientierung mit einem Stift, wenn nötig.
- Verwenden Sie einen Stift zu prüfen, ob die Embedding-Lösung verfestigt wird. Schieben Sie den Probenblock heraus und schneiden Sie es, wenn nötig.
- Richten Sie die Probe und die separate Form mit einer Querorientierung zu erhalten.
- Setzen Sie einen Blockhalter auf der Oberseite der Einbettform. gießen Sie vorsichtig Embedding-Lösung in die Form, bis die Form und der Blockhalter durch Einbetten Lösung eingetaucht sind.
- Halten Sie die Probe in einem Sekundärbehälter und lassen Sie esauf Eis für 3 bis 4 Stunden in einem Abzug.
- Speichern die verfestigten Proben in einem 4 ° C.
- Ziehen Sie die Einbettform entfernt. Setzen Sie den Block unter dem Stereomikroskop mit schräger Beleuchtung Position der Probe in dem Block zu inspizieren. Auf der Blockfläche, die Probenmarkierung Gitterlinien um.
- Schneiden Sie den Block zu entfernen, um Zugang Materialmenge Einbetten der markierten Gitterlinien als Referenzen.
3. Image Acquisition
- Klemmen Sie den Probenblock zu dem Mikrotom und erhalten eine frische Schnittfläche. Set Schnittdicke (zB e9.5-10.5, 1,5 & mgr; m; e11.5-12.5, 2,0 & mgr; m; e13.5-15.5, 2,5 & mgr; m; E16.5-älter, 3 & mgr; m). Halten Sie die Probe / Block an der Ausgangsposition von Mikrotom.
- Montieren Sie den Stereo-Zoom-Mikroskop horizontal um den Block Oberfläche der Probe gegenüber.
- Schalten Sie den Computer und Mikroskop, und starten Sie die Bildaufnahme-Software.
- Visualisieren und konzentrieren sich die Optik auf den Block-faceunter der "Live-Ansicht" Modus der Imaging-Software.
- Richten Mikroskop und Mikrotom, wenn nötig, so dass die Blockfläche in der Mitte des Suchers ist.
- Stellen Sie den Zoom, so dass der gesamte Block-Gesicht im Sucher ist.
- Wählen grün fluoreszierendes Protein (GFP) -Filter (Anregung 470 ± 20 nm, dichroitische 495 nm, Emission 525 ± 25 nm) und neu auszurichten, wenn nötig.
- Messen Sie und stellen Sie die Belichtungszeit manuell (zB 80-400 Mini sec).
- Erwerben Sie Bilder des block Gesicht nach jedem frischen Schnitt und Speichern von Bildern automatisch, wenn möglich.
- Zeichnen Sie wichtige Parameter wie Auflösung, Schnittdicke und Zoom.
- Nachdem die gesamte Probe, Export Finishing und alle Bilddateien in das JPEG-Format, wenn notwendig, zu konvertieren.
- Invert alle Originalbilder eine Bildverarbeitungssoftware, und die Helligkeit und den Kontrast.
- Speichern Sie alle bearbeiteten Bilder in einem separaten Ordner.
4. 3DVisualisierung
- Laden Sie alle bearbeiteten Bilder zu einem 3D-Visualisierungssoftware gemäß den Anweisungen.
- Eingangsauflösung und Schnittdicke um alle Bilder zu volumetrischen Daten zu konvertieren (dh Voxel - Größe) und die 3D - Datei zu speichern.
- Richten Sie alle Bilder den automatischen Modus. Passen Sie manuell einzelne Bilder, wenn nötig.
- Speichern Sie das ausgerichtetes Bild zu einem neuen Dateinamen.
- Analysieren morphometrischen Eigenschaften der Probe die 3D-Visualisierungssoftware.
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Representative Results
Wir haben hohe Qualität HREM Bilder von Mäuseembryonen berichtet zwischen E9.5 und E13.5 8. Bildqualität der spät statt Embryonen jedoch signifikant wegen der begrenzten Gewebepenetration des fluoreszierenden Farbstoffes Eosin kompromittiert. Um die Färbung die Effizienz zu steigern, haben wir mehrere Vorbehandlungsmethoden getestet, die auf Fluoreszenz - kompatibel sind Bildgebung 11. Insbesondere wurden die E15.5 Maus - Embryonen entweder mit A2 12 Sca / e behandelt oder Ganzkörper - CUBIC 13. Wir haben getestet auch die vereinfachte Formel, die Clearing-Lösung (4 M Harnstoff, 10% Glycerin und 4% Natriumdodecylsulfat). Alle Vorbehandlungsmethoden Färbung Effizienz erhöht. Die Embryonen wurden nach 1 Woche der Behandlung mit dem Clearing-Lösung durchscheinend. Keine offensichtliche Gewebeschädigung wurde nach der Behandlung festgestellt. Die vorbehandelten Embryonen wurden durch die Schritte einschließlich Entwässerung, Färbung und Infiltration verarbeitet, bevor embedde seind in der Kunststoff-Einbettung Medien. HREM Bilder wurden aus den eingebetteten Probe erworben, wie in Abschnitt 3 (Image Acquisition) oben beschrieben und zeigte eine 3D-Visualisierung-Software. Ein Beispiel für eine ganze Montageoberflächenansicht E15.5 Embryos zeigte morphologischen Merkmale der Haut einschließlich Whiskers Pads und Entwicklung Haarfollikel (Abbildung 1). Auflösung des virtuellen Schnittansicht war vergleichbar mit histologischen Schnitt (Abbildung 2).
Abb . 1: 3D - Oberflächenansicht des E15.5 Embryo Es zeigt die morphologischen Merkmale der Haut. Die Entwicklung von Haarfollikeln (kleine weiße Punkte) sind offensichtlich mit hoher Auflösung des Bildes zu demonstrieren. Bitte klicken Sie hier um eine größere zu sehen version dieser Figur.
Abbildung 2:. Die virtuelle Schnittansicht Midline Abschnitt des E15.5 Embryo Die internen Strukturen, einschließlich des Herzens, der Leber, Darm und Blase sind deutlich sichtbar. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier präsentieren wir eine modifizierte Protokoll Routinelaborgeräte mit seriellen HREM Bilder zu erwerben, die für die schnelle 3D-Visualisierung und morphometrische Analyse komplexer Strukturen kompatibel sind. Da die hochauflösenden Bilder direkt von der Blockfläche statt einzelner Abschnitte genommen werden, werden die feinen morphologischen Merkmale erhalten und schnell digital in einem 3D-Visualisierungsprogramm rekonstruiert.
3D-Bildgebung bietet signifikante Vorteile bei der Visualisierung und das Verständnis komplexer morphologischer Merkmale. Die meisten 3D - Imaging - Technologien sind abhängig von Spezialgeräten 1-4. Im Gegensatz dazu EFIC und HREM Bildgebung nutzen nur Standard - Laborgeräte mit einem Stereomikroskop mit einer Digitalkamera ausgestattet und einem Mikrotom 14. Funktionelle Kopplung zwischen Mikroskop und Mikrotom ermöglicht die Automatisierung der Bildaufnahme ermöglicht die Automatisierung des gesamten Bilderfassungsprozesses. Wir haben jedoch gezeigt, dassfunktionelle Kopplung ist 8 nicht zwingend. Stattdessen montieren wir einfach die Stereo horizontal, so dass es direkt an die Blockfläche eines Standard-Mikrotom in der Ruhehalteposition steht. Die Haupteinschränkung dieser einfachen Einrichtung ist, dass die HREM Bilder manuell getroffen werden müssen. Wir schätzen, dass es etwa 5 Sekunden pro Bild im Durchschnitt dauert. Eine weitere Einschränkung ist, dass einzelne Bild von einer Position zur anderen verschieben kann, aber das ist kein Problem, da sie leicht während der 3D-Rekonstruktion neu ausgerichtet werden.
Mit Hilfe der HREM Technologie haben wir eine Reihe von 3D-Bildern von Maus-Embryonen von E9.5 bis E13.5 analysiert und entdeckt einen neuartigen Mechanismus, mit dem der einsame embryonalen Kloake verwandelt sich in zwei getrennte Strukturen, die distale Verdauungstrakt und der unteren Harnwege Bahnen 8. Qualität der HREM Bilder späten statt Embryonen aufgrund ineffizienter Eindringen von Eosin begrenzt ist (Daten nicht gezeigt). Zur Erhöhung der Gewebe Penetration von E15.5 und E18.5 Embryonen haben wir zwei verschiedene Vorbehandlungsmethoden verwendet , die 11 bis Fluoreszenz - Bildgebung kompatibel sind und eine neue Formel getestet, die Clearing - Lösung (4 M Harnstoff, 10% Glycerin und 4% SDS). Alle diese Verfahren haben erhebliche Verbesserung der Gewebepenetration und Eosin-Färbung gezeigt. Eine wichtige Überlegung vor und nach der Vorbehandlung ist, dass die Probe auf die Haut anfällig ist aufgrund des osmotischen Drucks Quellung oder Schrumpfung. Um die plötzliche Änderung des osmotischen Drucks begrenzen dadurch reduzieren Gewebe Verformung, empfehlen wir schrittweise Austausch der Lösung. Zusätzlich fanden wir, dass die Aufnahme von Ethanol hilft signifikant (Schritt 1.5.4). Während Infiltration und Einbettung Schritte ist es wichtig, die Probe vor Licht zu halten und bei 4 ° C.
Zusammengefasst nutzt dieses Protokoll Routinelaborgeräte HREM Bilder zu erwerben, die für hochauflösende 3D-Visualisierung und morphometrische Analyse kompatibel ist. Das Protokoll should leicht in jedem Standard-Laborbedingungen angepasst werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
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- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
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- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
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