Protocol
すべての動物の使用は、ボストン小児病院で施設内動物管理使用委員会によって承認されています。
1.試料の調製
- 時限交配
- 同じケージで一緒のC57Bl6野生型のオスとメスを入れます。
- 次の日の朝早く、嵌合プラグの形成のために確認してください。嵌合プラグ（ 別名 、膣または交尾プラグ）は、そのブロック膣を硬化ゲル状の堆積です。
- 胎生0.5（E0.5）などのプラグ日付を設定します。
- マウス胚の単離
- CO 2窒息により妊娠した雌を安楽死させます。
- 吸収パッドに仰向けマウスを入れて、70％エタノールで腹部をスプレー。
- 皮膚を持ち上げ、手術用はさみを使用して尾側腹部での初期5ミリメートルの切開を行います。カットし、完全に内臓を露出させるために腹部の皮膚を取り除きます
- VAの近くにカットGINAは、子宮全体を削除します。
- 子宮角に沿って移植部位の間で切断。各セグメントまたは受胎は、内部に一つだけの胚を持っている必要があります。
- 1xの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で子宮セグメントを保管してください。
- 胚の解剖
- ステレオスコープの下の氷冷PBSで別々の皿に各受胎を置きます。
- 順次細かい解剖鉗子を使用して、子宮組織、胎盤、その後、胎児膜を削除します。
- 大ホールピペットを用いて、1×氷冷PBSで50mlチューブに解剖胚を転送します。組織の損傷を最小限にするためにピンセットで直接胚を拾うことは避けてください。
- 固定
- 固定剤の少なくとも10のサンプルボリュームを持つ以上24時間4℃で10％中性緩衝ホルマリン溶液中で切開した胚を修正しました。
- 前処理
- 4：クリアソリューションを準備二重蒸留水中M尿素、10％グリセロール、4％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）。
- クリアリング・ソリューションとの固定液を交換してください。
- 2週間 - 優しく1室温でロッカー上の標本を回転させます。第二および第三日目に一度クリアソリューションを交換します。標本はゆっくりとはっきりと半透明になります。
- 10％ホルマリンでクリアソリューションを交換し、2日間ロッカーに残します。
- 脱水
- 5分ごとに、1×PBSで3回を前処理したサンプルを洗ってください。
- 穏やかなロッカー上で室温にて昇順エタノール系列でサンプルを脱水します。 E15.5の胚については、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％及び100％エタノール、2時間、各段階を含む、上昇エタノール系列を使用します。古い胚については、インキュベーション時間を長くする必要があります。
- 染色
- エオシンY二ナトリウム塩と0.02の0.1375グラムを追加します。染色溶液を準備100％エタノール50ml中にアクリジンオレンジヘミ（塩化亜鉛）塩75グラム。 2時間撹拌。濾紙でフィルタリングします。室温で保存し、アルミホイルで覆うことにより、光を避けます。
- 1時間染色溶液に試料を転送します。
- 新鮮な染色液と染色一夜に交換してください。
- 浸潤
- 浸透液を調製：JB-4埋め込みキットの溶液Aの100ミリリットル、触媒C、エオシンY二ナトリウム塩の0.275グラムとアクリジンオレンジヘミ（塩化亜鉛）塩の0.055グラムの1.25グラムを兼ね備えています。 2時間アイスバケット中（200 rpm）を混合するために攪拌し、次いで濾紙で濾過します。
- 4℃で浸透ソリューションを保存し、アルミホイルで覆うことにより、光を避けます。
- 浸透液に胚を移す：染色溶液（1：1）、および4℃でロッカー上で少なくとも3時間インキュベートします。
- 浸透液に胚を移し、3時間インキュベート低温室でロッカーの研究。
- 一回毎日浸透ソリューションを交換し、さらに3日間緩やかなロッカーに寒い部屋に残します。
2.埋め込み
- 氷の上に溶液Bと浸透策を保管してください。
- すぐに埋め込む前に埋め込みソリューション（溶液Bと浸透策の1時25分）を行います。
- オリエント埋め込む金型内の検体は、その後静かに埋め込む型の中に冷たい埋め込みソリューションを注ぎます。再配向させる必要に応じてピンで。
- 埋め込みソリューションが固化されているかどうかを調べるためにピンを使用します。試料ブロックを押し、必要に応じてそれをトリミング。
- クロスの向きを取得するために別々の金型を使用して試料ブロックの向きを変えます。
- 埋め込む金型の上にブロックホルダーを置きます。金型とブロックホルダは埋め込みソリューションによって水没するまで静かに金型内に埋め込みソリューションを注ぎます。
- 第2の容器に試料を保持し、それを残しますヒュームフード内で4時間 - 3氷上で。
- 4°Cで固化した標本を保管してください。
- 埋込み型を剥がします。ブロック内の試料の位置を検査するために、斜め照明で実体顕微鏡下にブロックを置きます。試料の周りのブロック面には、マークグリッド線。
- 参照としてマークされたグリッド線を使用して材料を埋め込むのアクセス量を除去するためにブロックをトリム。
3.画像取得
- ミクロトームに試料ブロックを固定し、新鮮な切断面を得ます。セット部の厚さ（ 例えば 、e9.5-10.5、1.5ミクロン; e11.5-12.5、2.0ミクロン; e13.5-15.5、2.5ミクロン; E16.5-古い、3ミクロン）。ミクロトームのホームポジションに検体/ブロックを保管してください。
- 水平方向に試料のブロック面に対向ステレオズーム顕微鏡をマウントします。
- コンピュータと顕微鏡の電源を入れ、画像取得ソフトウェアを起動します。
- 視覚化し、ブロック面に光学系の焦点を合わせますイメージングソフトウェアの「ライブビュー」モードで。
- ブロック-顔がファインダーの中心になるように、必要に応じて顕微鏡およびミクロトームを合わせます。
- ブロック全体-顔がファインダー内に収まるようにズームを調整します。
- 緑色蛍光タンパク質（GFP）フィルター（励起470±20 nmで、ダイクロイック495nmで、発光525±25 nm）を選択し、必要に応じて再び焦点を合わせます。
- 測定し、設定された露光時間を手動で（ 例えば、80から400ミニ秒）。
- 各新鮮なカットの後、ブロックの顔の画像を取得し、可能な場合は、自動的に画像を保存します。
- 解像度、切片厚とズームを含むレコードの重要なパラメータ。
- 標本全体を終えた後、エクスポートし、必要に応じてすべての画像ファイルは、JPEG形式に変換します。
- イメージング処理ソフトウェアを使用して、すべての原稿画像を反転し、明るさとコントラストを調整します。
- 別のフォルダ内のすべての処理された画像を保存します。
4. 3D可視化
- 指示に従って、3D可視化ソフトウェアに対するすべての処理された画像をアップロードします。
- 入力解像度とセクションの厚さは、ボリュームデータ（ すなわち、ボクセルサイズ）へのすべての画像を変換し、3Dファイルを保存します。
- 自動モードを使用して、すべての画像の位置を合わせます。必要に応じて手動で個々の画像を調整します。
- 新しいファイル名に合わせた画像を保存します。
- 3次元可視化ソフトウェアを使用して、試料の形態学的特徴を分析します。
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Representative Results
我々は、E9.5とE13.5 8間のマウス胚の高品質のHREM画像を報告しています。後期段階の胚の画像品質は、しかしながら、かなりために蛍光色素エオシンの限られた組織浸透の危険にさらされています。染色効率を向上させるために、我々は、蛍光イメージング11に互換性のあるいくつかの前処理方法をテストしています。具体的には、E15.5マウス胚のSca /電子A2 12または全身CUBIC 13のいずれかで処理しました。我々はまた、簡略化された式、クリア溶液（4 M尿素、10％グリセロール、4％ドデシル硫酸ナトリウム）を試験しました。すべての前処理方法は、染色効率を増加させました。胚はクリアソリューションによる治療の1週間後に半透明になりました。明らかな組織損傷は、治療後に検出されませんでした。前処理された胚はembeddeされる前に脱水、染色および浸潤などの工程を経て処理されましたプラスチック包埋媒体中のd。 HREM画像はセクション3で上述したように埋め込まれた標本から得られた（画像取得）および3D可視化ソフトウェアを使用して表示しました。 E15.5胚のホールマウントの表面図の例では、ウィスカーパッドと発展毛包（ 図1）を含む皮膚の詳細な形態学的特徴を示しました。仮想断面図の解像度は、組織切片（ 図2）に匹敵しました。
図1：E15.5 胚の3Dサーフェスビューこれは、皮膚の詳細な形態学的特徴を示しています。発展途上毛嚢（小さな白いドット）画像の高解像度を実証し、明らかである。 VEの大きい方を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のrsion。
図2：E15.5 胚のミッドラインセクションの仮想横断ビューは、心臓、肝臓、腸や膀胱などの内部構造は、はっきりと見える。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、迅速な3D可視化および複雑な構造の形態計測分析のために互換性のあるシリアルHREM画像を取得するために、ルーチン実験装置を使用して修正されたプロトコルを提示します。高解像度の画像ではなく、個々のセクションのブロック面から直接取得されるため、微細な形態学的特徴を保持し、迅速に3次元可視化プログラムでデジタル再構築されます。
3Dイメージングは、複雑な形態学的特徴を視覚化し、理解する上で重要な利点を提供しています。ほとんどの3Dイメージング技術は、特殊な装置1-4に依存します。これとは対照的に、EFICおよびHREMイメージングは、デジタルカメラやミクロトーム14を装備した実体顕微鏡を含む標準的な実験装置を利用しています。顕微鏡とミクロトームの間の機能的結合は、画像取得の自動化は、全体の画像取得プロセスの自動化を可能に可能にします。しかし、ことを示しています機能性カップリングは8必須ではありません。それは安静時停止位置での標準ミクロトームのブロック面に直接面するようにする代わりに、我々は単に水平に実体顕微鏡をマウントします。この簡単なセットアップの主な制限は、HREM画像を手動で撮影しなければならないことです。我々は、それが平均的に画像当たり約5秒を要していると推定しています。別の制限は、個々の画像を別の位置からずれる場合がありますが、彼らは容易に3D再構成時に再編されているので、これは問題ではないということです。
HREM技術を使用して、我々は、E13.5までE9.5からマウス胚の3D画像のシリーズを分析し、孤独な胚排出腔、2つの別々の構造に変換することによって新たなメカニズム、遠位消化管と下部尿を発見しました管8。後期胚の段階のHREM画像の品質が原因エオシンの非効率的な浸透（データは示していない）に制限されています。組織penetrを増加させるために、E15.5およびE18.5胚のationが、我々は蛍光イメージング11に対応している二つの異なる前処理方法を使用して、新しい式、クリアソリューション（4 M尿素、10％グリセロール、4％SDS）をテストしました。これらの方法の全ては、組織浸透およびエオシン染色の有意な改善を示しました。前処理前後の重要な考慮事項は、検体が原因で浸透圧に腫れや縮小肌になりやすいということです。それにより、浸透圧の急激な変化を制限する組織の変形を低減するために、我々は解決策の段階的な交換をお勧めします。加えて、我々はエタノールの混入が大幅に（ステップ1.5.4）を助けることがわかりました。浸潤および包埋ステップの間、光から4℃で試料を維持することが重要です。
集合的に、このプロトコルは、高解像度の3D可視化および形態計測分析のために互換性のある、HREM画像を取得するためのルーチンの実験装置を使用します。プロトコルショウLDは容易に任意の標準的な実験室の設定に適合させます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
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- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
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- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
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- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
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