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Developmental Biology

Rápida aquisição de imagens 3D usando de alta resolução episc Microscopia

doi: 10.3791/54625 Published: November 21, 2016
* These authors contributed equally

Protocol

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Todas as utilizações de animais são aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal do Hospital Infantil de Boston.

Preparação 1. Amostra

  1. acasalamento cronometrada
    1. Coloque um C57BL6 tipo selvagem macho e uma fêmea juntos na mesma gaiola.
    2. Verifique para a formação de um tampão genital cedo na manhã seguinte. A ficha de acasalamento (aka, vaginal ou a ficha cópula) é uma deposição gelatinosa endurecido que bloqueia a vagina.
    3. Defina a data plugue como embrionária dia 0,5 (e0.5).
  2. O isolamento de embriões de ratinho
    1. Eutanásia fêmeas grávidas por asfixia com CO2.
    2. Coloque ratos supina sobre uma almofada absorvente e spray região abdominal com etanol 70%.
    3. Levante a pele e fazer uma incisão 5 milímetros inicial na região abdominal caudal usando uma tesoura cirúrgica. Cortar e remover a pele abdominal para expor totalmente os órgãos internos
    4. Corte perto vagina para remover todo o útero.
    5. Cortar entre locais de implantação ao longo do corno uterino. Cada segmento ou concepto deve ter apenas um embrião dentro.
    6. Manter os segmentos uterinas em 1x fosfato gelada solução salina tamponada (PBS).
  3. dissecção embrião
    1. Coloque cada concepto em um prato separado com PBS gelado sob um estereoscópio.
    2. Remover os tecidos uterinos, placenta e, em seguida, membranas fetais utilizando sequencialmente fórceps de dissecação finas.
    3. Transferir o embrião dissecados para um tubo de 50 ml com 1 x PBS gelado utilizando uma pipeta de transferência grande. Evitar a captação de embriões diretamente com uma pinça para minimizar os danos do tecido.
  4. Fixação
    1. Fixar os embriões dissecados em solução de formalina tamponada neutra a 10% a 4 ° C durante mais de 24 horas, com pelo menos 10 volumes de amostra de fixador.
  5. Pré-tratamento
    1. Preparar a solução de Compensação: 4M de ureia, 10% glicerol, 4% de dodecilsulfato de sódio (SDS) em água duplamente destilada.
    2. Substitua o fixador com a Solução de Compensação.
    3. Rodar suavemente a amostra num agitador à temperatura ambiente durante 1 - 2 semanas. Trocar a solução de compensação uma vez que no segundo e no terceiro dia. O espécime lentamente torna-se clara e translúcida.
    4. Substitua a solução de Compensação com formalina a 10% e deixar em uma cadeira de balanço para 2 dias.
  6. Desidratação
    1. Lavam-se as amostras pré-tratadas com 1x PBS 3 vezes durante 5 minutos cada.
    2. Desidratar as amostras em uma série de etanol ascendente à temperatura ambiente em uma cadeira de balanço suave. Para os embriões E15.5, usar uma série ascendente de etanol incluindo 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100% de etanol, 2 horas cada passo. Para os embriões mais velhos, o tempo de incubação deve ser aumentada.
  7. coloração
    1. Prepare Coloração Solução: adicione 0.1375 gramas de Eosina Y Disodium Sal e 0,0275 gramas de hemi laranja de acridina (cloreto de zinco) sal a 50 ml de etanol a 100%. Agita-se durante 2 h. Filtrar com papel de filtro. Armazenar à temperatura ambiente e evitar a luz, cobrindo com papel alumínio.
    2. Transferência da amostra para a solução de coloração, durante 1 h.
    3. Substitua com solução de coloração fresca e durante a noite mancha.
  8. Infiltração
    1. Prepare Infiltração Solução: combinar 100 ml de solução A de JB-4 kit de incorporação, 1,25 g de Catalisador C, 0,275 g de sal dissódico Eosina Y e 0,055 g de hemi laranja de acridina (cloreto de zinco) sal. Mexa para misturar (200 rpm) em um balde de gelo, durante 2 horas, e em seguida, filtrar com papel de filtro.
    2. Guardar a solução A infiltração a 4 ° C e evitar a luz através da cobertura com uma folha de alumínio.
    3. Transferir os embriões à infiltração de solução: Solução de coloração (1: 1), e incuba-se durante pelo menos 3 horas num agitador rotativo a 4 ° C.
    4. Transferir os embriões à infiltração solução e incubar durante 3 hR num agitador numa sala fria.
    5. Substitua Infiltração Solution uma vez por dia, e deixar em uma sala fria em uma cadeira de balanço suave por mais três dias.

2. Embedding

  1. Mantenha Solução B e infiltração Solution no gelo.
  2. Faça Embedding Solution (01:25 de Solução B e infiltração Solution) imediatamente antes da incorporação.
  3. Orientar a amostra em um molde de incorporação, em seguida, despeje Solution Embedding frio no molde incorporando delicadamente. Re-orientar com um pino, se necessário.
  4. Use um pino para examinar se a solução Embedding é solidificado. Empurrar para fora o bloco da amostra, e prepará-la, se necessário.
  5. Reorientar o bloco da amostra usando o molde separado para obter uma orientação cruzada.
  6. Coloque um suporte de bloco em cima do molde de incorporação. Derramar delicadamente Embedding Solução para dentro do molde até que o molde e o suporte do bloco estão submersos por Incorporação Solution.
  7. Mantenha a amostra em um recipiente secundário e deixá-loem gelo durante 3-4 horas numa hotte.
  8. Armazenar as amostras solidificadas numa 4 ° C.
  9. Descascar o molde de incorporação. Coloque o bloco sob o microscópio estereoscópico com iluminação oblíqua para inspecionar posição da amostra no bloco. Na face do bloco, linhas de grade marca ao redor do espécime.
  10. Apare o bloco para remover montante acesso de material de incorporação utilizando as linhas de grade marcado como referências.

3. Aquisição de Imagem

  1. Prender o bloco de amostra para o micrótomo e obter uma superfície de corte fresco. Definir espessura de corte (por exemplo, e9.5-10.5, 1,5 uM; e11.5-12.5, 2,0 uM; e13.5-15.5, 2,5 uM; E16.5-idosas, 3? M). Mantenha o espécime / bloco na posição inicial de micrótomo.
  2. Montar o microscópio estéreo zoom horizontal voltada para a superfície do bloco de amostra.
  3. Ligue o computador e microscópio, e iniciar o software de aquisição de imagem.
  4. Visualizar e focar as óticas para o bloco-faceno modo "live view" do software de imagem.
  5. Alinhar microscópio e micrótomo, se necessário, para que o bloco de face é no centro do visor.
  6. Ajuste o zoom de modo que todo o bloco-face está dentro do visor.
  7. Escolha filtro verde proteína fluorescente (GFP) (excitação 470 ± 20 nm, dicróica 495 nm, emissão de 525 ± 25 nm) e reorientar, se necessário.
  8. Medir e definir o tempo de exposição manualmente (por exemplo, 80-400 mini-sec).
  9. Adquirir imagens do bloco-face depois de cada corte fresco e guardar as imagens automaticamente, se possível.
  10. Grave parâmetros importantes, incluindo resolução, espessura de corte e zoom.
  11. Depois de terminar o espécime inteiro, exportação e converter todos os arquivos de imagem para o formato JPEG, se necessário.
  12. Inverter todas as imagens originais usando um software de processamento de imagens e ajustar o brilho eo contraste.
  13. Salve todas as imagens processadas em uma pasta separada.

4. 3DVisualização

  1. Carregar todos os as imagens transformadas para um software de visualização 3D, seguindo as instruções.
  2. Resolução de entrada e espessura de corte para converter todas as imagens para dados volumétricos (ou seja, o tamanho voxel) e salve o arquivo 3D.
  3. Alinhar todas as imagens utilizando o modo automático. Ajustar imagens individuais manualmente, se necessário.
  4. Salve a imagem alinhada com um novo nome de arquivo.
  5. Analisar as características morfométricas da amostra usando o software de visualização 3D.

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Representative Results

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Nós relatamos imagens HREM alta qualidade de embriões de rato entre E9.5 e E13.5 8. A qualidade de imagem dos embriões final faseada, no entanto, é significativamente comprometida devido à penetração nos tecidos limitada do eosina corante fluorescente. Para aumentar a eficiência de coloração, testámos vários métodos de pré-tratamento que são compatíveis com imagens fluorescentes 11. Especificamente, os embriões de camundongos E15.5 foram tratados com Sca / e A2 12 ou de Corpo Inteiro CUBIC 13. Nós também testaram a fórmula simplificada, a solução de compensação (4 M de ureia, 10% de glicerol e 4% de sulfato de dodecilo e sódio). Todos os métodos de pré-tratamento aumentou a eficiência de coloração. Embriões tornou-se translúcida após 1 semana de tratamento com a solução de Compensação. Nenhum dano tecidual óbvio foi detectada após o tratamento. Os embriões pré-tratados foram processadas através de passos, incluindo a desidratação, a coloração e infiltração antes de ser embedded nos meios de comunicação de encaixar plásticas. imagens HREM foram adquiridos a partir da amostra incorporados como descrito acima na seção 3 (Aquisição de Imagem) e exibido usando um software de visualização 3D. Um exemplo de visão inteira superfície de montagem de embrião E15.5 demonstrou características morfológicas detalhadas da pele, incluindo almofadas suiças e folículos pilosos em desenvolvimento (Figura 1). Resolução da vista de seção virtual foi comparável ao corte histológico (Figura 2).

figura 1
Figura 1:. Ver superfície em 3D do embrião E15.5 Ela mostra as características morfológicas detalhadas da pele. Os folículos pilosos em desenvolvimento (pequenos pontos brancos) são aparentes, demonstrando de alta resolução da imagem. Por favor clique aqui para ver uma maior version desta figura.

Figura 2
Figura 2:. O Virtual Vista de seção da Seção linha média do embrião E15.5 As estruturas internas, incluindo o coração, fígado, intestino e bexiga são claramente visíveis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Aqui, apresentamos um protocolo modificado utilizando equipamentos de laboratório de rotina para obter imagens HREM de série que são compatíveis para uma rápida visualização 3D e análises morfométricas de estruturas complexas. Porque as imagens de alta resolução são tomadas diretamente da face do bloco, em vez de seções individuais, as características morfológicas finas são preservados e rapidamente reconstruída digitalmente em um programa de visualização 3D.

imagens 3D oferece vantagens significativas em visualizar e compreender características morfológicas complexos. A maioria das tecnologias de imagem 3D depender de equipamento especializado 1-4. Em contraste, EFIC e imagem HREM utilizam somente equipamentos de laboratório padrão, incluindo um estereomicroscópio equipado com uma câmera digital e um micrótomo 14. acoplamento funcional entre microscópio e microtome permite a automação de aquisição de imagem permite a automação de todo o processo de aquisição de imagem. Contudo, mostrámos queacoplamento funcional não é obrigatória 8. Em vez disso, basta montar o microscópio estereoscópico horizontalmente para que ele enfrenta diretamente para o rosto de blocos de um micrótomo padrão na posição parada de descanso. A principal limitação desta configuração simples é que as imagens HREM têm de ser tomadas manualmente. Estimamos que leva cerca de 5 segundos por imagem, em média. Outra limitação é que o indivíduo imagem pode mudar de uma posição para outra, mas isto não é um problema porque eles são prontamente realinhados durante a reconstrução 3D.

Usando a tecnologia HREM, analisamos uma série de imagens em 3D de embriões de ratos de E9.5 a E13.5, e descobriu um novo mecanismo pelo qual a cloaca embrionária solitária transforma em duas estruturas separadas, o trato digestivo distal eo urinário inferior tratos 8. A qualidade das imagens de HREM tarde encenado embriões é limitada devido à penetração ineficaz de eosina (dados não mostrados). Para aumentar a Penetração de tecidosção de E15.5 e E18.5 embriões, utilizou-se dois métodos de pré-tratamento diferentes que são compatíveis para imagiologia fluorescente 11 e testada uma nova fórmula, da solução de compensação (4 M de ureia, 10% de glicerol e 4% de SDS). Todos estes métodos mostraram uma melhoria significativa da penetração nos tecidos e eosina. Uma consideração importante antes e depois do pré-tratamento é que o espécime é propenso a pele inchaço ou encolhendo devido à pressão osmótica. Para limitar a mudança súbita de pressão osmótica, assim, reduzir a deformação do tecido, recomendamos troca gradual da solução. Além disso, verificou-se que a inclusão de etanol ajuda significativamente (do passo 1.5.4). Durante a infiltração e etapas de incorporação, é importante para manter a amostra da luz e a 4 ° C.

Coletivamente, este protocolo utiliza equipamentos de laboratório de rotina para obter imagens HREM, o que é compatível para visualização 3D de alta resolução e análises morfométricas. O shou protocolold ser facilmente adaptado em qualquer ambiente de laboratório padrão.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice The Jackson Laboratory C57BL6
Ethyl Alcohol Pharmco-Aaper 111000200 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin Sigma HT501128-4L
Urea Sigma U5128 Clearing Solution
Glycerol Fisher scientific G33-4 Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate Invitrogen 15525-017 Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt Fisher scientific BP241925 Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt Sigma A6014 Infiltration Solution
Whatman paper GE 3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A Polysciences, Inc. 0226A-800 Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B Polysciences, Inc. 0226B-30 Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst Polysciences, Inc. 02618-12 Infiltration Solution
Embedding Molds Polysciences, Inc. 23185-1 16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds Polysciences, Inc. 18986-1 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders Polysciences, Inc. 15899
Disposable Graduated Transfer Pipes VWR 414004-014
Petrl Dish VWR 25384-088 Embryo dissection
Forceps Inox Tip  ROBOZ RS-5015 Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep  ROBOZ RS-5153 Embryo dissection
Delicate Operating Scissor  ROBOZ RS-6700 Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes Falcon 352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes Falcon 352098
Ice Bucket Magic Touch Iceware International Corp. R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats VWR 89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats VWR 89106-770
Sodium Chloride MP Biomedicals 102892 PBS Solution
Potassium Chloride Sigma P0662 PBS Solution
Potassium phosphate monobasic Sigma P5405 PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S9390 PBS Solution
Digital Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Microtome Leica RM2265
Illuminator Carl Zeiss HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope Carl Zeiss Axio Zoom.V16
Stereo Microscope Olympus SZX16
Fiber Optic Light Source Leica KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade VWR 95057-832
Single Edge Dispenser Personna 62-0330-0000
ZEN Carl Zeiss pro 2012
Photoshop Adobe CS6 v13.0
Amira 3D Software Visage Imaging 5.4
Computer Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers VWR 40000-304
Standard Hot Plate Stirrer VWR 12365-382
Analytical Balance Mettler Toledo AB54-S

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References

  1. Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
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  14. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. 681-682 (2012).
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Cite this Article

Zhang, H., Huang, J., Liu, X., Zhu, P., Li, Z., Li, X. Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy. J. Vis. Exp. (117), e54625, doi:10.3791/54625 (2016).More

Zhang, H., Huang, J., Liu, X., Zhu, P., Li, Z., Li, X. Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy. J. Vis. Exp. (117), e54625, doi:10.3791/54625 (2016).

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