Protocol
Все случаи использования животных утверждаются по уходу и использованию комитета Institutional животного происхождения в Бостонской детской больнице.
1. Подготовка образцов
- Временный спаривание
- Поместите C57BL6 дикого типа самца и самку вместе в одной клетке.
- Проверьте для формирования матовую пробки рано утром следующего дня. Спаривание плагин (он же, вагинального или совокупление плагин) представляет собой закаленный желеобразные отложения , которое блокирует вход во влагалище.
- Установите дату пробку как день эмбрионального 0,5 (e0.5).
- Выделение эмбрионов мыши
- Эвтаназии беременных самок СО 2 удушья.
- Помещенный мышей навзничь на впитывающей подушечки и распылить брюшную область с 70% -ным этанолом.
- Подтяжка кожи и сделать первоначальный 5 мм надрез на хвостовом брюшной области с использованием хирургических ножниц. Вырезать и удалить кожи живота, чтобы полностью раскрыть внутренние органы
- Вырезать вблизи ваGina, чтобы удалить всю матку.
- Обрежьте между имплантацией участков вдоль рога матки. Каждый сегмент или зародыш должен иметь только один эмбрион внутри.
- Хранить сегменты матки в 1X ледяным фосфатно-буферным раствором (PBS).
- Эмбрион рассечение
- Поместите каждую Conceptus в отдельное блюдо с ледяным PBS под стереоскоп.
- Удалить матки ткани, плаценту, а затем последовательно плодные оболочки с использованием тонких препаровальный пинцет.
- Передача расчлененный эмбриона в 50 мл пробирку с 1x ледяной PBS с помощью большой пипетки передачи. Избегайте собирание эмбриона непосредственно с пинцетом, чтобы свести к минимуму повреждение тканей.
- фиксация
- Закрепить расчлененный эмбрионов в 10% нейтральном забуференном растворе формалина при температуре 4 ° С в течение более 24 ч, по меньшей мере, 10 объемов образцов фиксирующих.
- предварительная обработка
- Подготовить Клиринговый Решение: 4М мочевина, 10% глицерина, 4% додецилсульфат натрия (SDS) в бидистиллированной воде.
- Заменить закрепитель с Расчетной Solution.
- Осторожно повернуть образец на качалке при комнатной температуре в течение 1 - 2 недель. Обмен Клиринговый Solution один раз на второй и третий день. Образец медленно становится ясным и прозрачным.
- Заменить Клиринговый решение с 10% -ным формалином и оставить на качалке в течение 2-х дней.
- дегидратация
- Вымойте предварительно обработанных образцов с 1x PBS 3 раза в течение 5 минут каждый.
- Дегидрировать образцов в серии этанола возрастающей при комнатной температуре на пологом качалке. Для E15.5 эмбрионов, используют серию восходящий этанол в том числе 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% этанола, 2 ч каждый шаг. Для более старых эмбрионов, время инкубации должна быть увеличена.
- Окрашивание
- Подготовка окрашиванием Решение: добавить 0.1375 г эозина Y динатриевой соли и 0,0275 грамм акридинового оранжевого геми (хлорид цинка) соли к 50 мл 100% этанола. Смесь перемешивают в течение 2 часов. Фильтр с фильтровальной бумагой. Хранить при комнатной температуре и исключить воздействие света, покрывая с алюминиевой фольгой.
- Перенос образца в окрашивании раствор в течение 1 ч.
- Заменить свежим Окрашивание раствором и пятно в течение ночи.
- инфильтрация
- Готовят инфильтрацией решение: объединить 100 мл раствора А JB-4 комплекта вложения, 1,25 г катализатора С, 0,275 г эозина Y динатриевой соли и 0,055 г акридинового оранжевого геми (хлорид цинка) соли. Движение, чтобы смешать (200 оборотов в минуту) в ведре со льдом в течение 2 ч, а затем фильтруют с помощью фильтровальной бумаги.
- Храните инфильтрации решение при 4 ° С и избегать света, покрывая с алюминиевой фольгой.
- Перенос эмбрионов инфильтрации Решение: окрашиванием раствором (1: 1), и инкубировать в течение не менее 3 ч на качалке при 4 ° С.
- Перенос эмбрионов инфильтрации раствора и инкубировать в течение 3 чг на качалку в холодном помещении.
- Заменить инфильтрации решение один раз в день, и оставить в холодном помещении на пологом качалке в течение еще трех дней.
2. Вложение
- Держите Решение B и инфильтрации решение на льду.
- Сделать Встраивание Solution (1:25 раствора В и инфильтрации раствора) непосредственно перед вложением.
- Orient образец в вложению формы, а затем залить холодной Встраивание раствора в вложению формы аккуратно. Переориентирование с булавкой, если это необходимо.
- Используйте булавку, чтобы изучить вопрос о затвердевает вложении решение. Выталкивайте блок образца и обрежьте ее в случае необходимости.
- Переориентировать блок образца с использованием отдельной формы для получения перекрестной ориентации.
- Поместите держатель блока в верхней части пресс-формы вложения. Аккуратно влить Встраивание решение в пресс-форму до тех пор, форма и держатель блока не погружена Встраивание Solution.
- Храните образец в контейнере вторичного и оставить егона льду в течение 3 - 4 часа в вытяжном шкафу.
- Хранить Затвердевший образцов в 4 ° С.
- Отслаиваться вложение плесени. Поместите блок под стереомикроскопа с косом освещении, чтобы проверить положение образца в блоке. На блоке лица, Марк линии сетки вокруг образца.
- Обрезка блок, чтобы удалить количество доступа встраивания материала с использованием отмеченных линий сетки в качестве ссылки.
3. Получение изображения
- Зажим образца блока к микротома и получить свежую поверхность разреза. Установить толщину секции (например, e9.5-10.5, 1,5 мкм; e11.5-12.5, 2,0 мкм; e13.5-15.5, 2,5 мкм; E16.5-старшего, 3 мкм). Держите образец / блок в исходном положении микротом.
- Установите стерео микроскоп масштабирования по горизонтали, обращенную блок поверхности образца.
- Включите компьютер и микроскоп, и запустить программное обеспечение захвата изображений.
- Визуализируйте и фокусировки оптики на блок-лицав режиме "живой" вид программного обеспечения визуализации.
- Align микроскоп и микротом, если это необходимо, чтобы блок-лицо находится в центре видоискателя.
- Отрегулируйте масштаб так, чтобы весь блок-лицо в видоискателе.
- Выберите зеленый флуоресцентный белок (GFP) фильтр (возбуждение 470 ± 20 нм, дихроичный 495 нм, эмиссия 525 ± 25 нм) и переориентировать в случае необходимости.
- Измерьте и установите время экспозиции вручную (например, 80 - 400 мини - сек).
- Приобретать изображения блок-лица после каждого свежего вырезать и сохранить изображения автоматически, если это возможно.
- Запись важных параметров, включая разрешение, толщина секции и масштабирования.
- После окончания всего образца, экспорта и конвертировать все файлы изображений в формате JPEG, если это необходимо.
- Переверните все исходные изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений, а также настроить яркость и контрастность.
- Сохранить все обработанные изображения в отдельной папке.
4. 3DВизуализация
- Загрузите все обработанные изображения в 3D-визуализации программного обеспечения, следуя инструкциям.
- Входное разрешение и толщина секции , чтобы преобразовать все изображения в объемных данных (т.е. воксельная размер) и сохранить 3D - файл.
- Совместите все изображения, используя автоматический режим. Настройте отдельные изображения вручную, если это необходимо.
- Сохраните выровненный изображение на новое имя файла.
- Анализ морфометрических особенностей образца с использованием программного обеспечения визуализации 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы сообщали высокого качества ЭМВР изображения эмбрионов мыши между E9.5 и E13.5 8. Качество изображения конца поставил эмбрионов, однако, в значительной степени нарушена из-за проникновения ограниченного тканевого эозином флуоресцентного красителя. Для повышения эффективности окрашивания, мы протестировали несколько предварительной обработки методы, которые совместимы с флуоресцентной визуализации 11. В частности, эмбрионов мышей E15.5 обрабатывали либо Sca / е А2 12 или всего тела CUBIC 13. Мы также протестировали упрощенную формулу, Очищающий раствор (4 М мочевины, 10% глицерина и 4% додецилсульфата натрия). Все методы предварительной обработки повысили эффективность окрашивания. Эмбрионы стали полупрозрачными после 1 недели лечения с Клиринговым Solution. Никаких повреждений тканей очевидно не было обнаружено после лечения. Предварительно обработанные эмбрионы были обработаны с помощью шагов, включая обезвоживание, окрашивания и инфильтрации, прежде чем embedded в пластиковые вложения средств массовой информации. ЭМВР изображения были получены из встроенных образца, как описано выше в разделе 3 (Image Acquisition) и отображается с использованием 3D программного обеспечения визуализации. Пример всей поверхности горы зрения E15.5 эмбриона продемонстрировал подробные морфологические особенности кожи , включая усов колодками и развивающихся волосяных фолликулов (Рисунок 1). Постановление зрения виртуального раздела была сравнима с гистологической секции (рисунок 2).
Рисунок 1:. 3D Surface Вид E15.5 Эмбрион Она показывает подробные морфологические особенности кожи. Развивающиеся волосяные фолликулы (маленькие белые точки) очевидны, демонстрируя высокое разрешение изображения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную веrsion этой фигуры.
Рис . 2: Виртуальный Раздел Вид Midline секции E15.5 зародыше внутренние структуры, в том числе сердца, печени, кишечника и мочевого пузыря отчетливо видны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем модифицированный протокол с использованием рутинного лабораторного оборудования для получения серийных ЭМВР изображения, которые совместимы для быстрой 3D визуализации и анализа морфометрического сложных структур. Поскольку изображения с высоким разрешением взяты непосредственно из блока лица, а не отдельных участков, мелкие морфологические особенности сохраняются и быстро реконструированы в цифровом виде в программе 3D визуализации.
3D визуализация дает значительные преимущества в визуализации и понимания сложных морфологических особенностей. Большинство 3D - технологии визуализации зависит от специализированного оборудования 1-4. В противоположность этому , EFIC и обработки изображений ТРЗМ использовать только стандартного лабораторного оборудования в том числе стереомикроскопа , снабженного цифровой камерой и микротома 14. Функциональная связь между микроскопом и микротома позволяет автоматизировать получения изображения позволяет автоматизировать весь процесс получения изображения. Тем не менее, мы показали, чтофункциональная муфта не является обязательным 8. Вместо этого мы просто монтировать стереомикроскопа в горизонтальном направлении так, что она обращена непосредственно к блоку лицом стандартного микротома в положении покоя остановки. Основным недостатком этой простой установки является то, что ЭМВР изображения должны быть приняты вручную. Мы подсчитали, что это занимает около 5 сек на изображение, в среднем. Другим ограничением является то, что отдельные изображения может переходить от одной позиции к другой, но это не является проблемой, потому что они легко перестроены во время 3D-реконструкции.
Используя технологию ЭМВР, мы проанализировали серию 3D-изображения эмбрионов мыши из E9.5 до E13.5, и обнаружили новый механизм, с помощью которого одиночные эмбриональное клоаку трансформирует на две отдельные структуры, дистального желудочно-кишечного тракта и нижних мочевых тракты 8. Качество ЭМВР изображений поздней постановке эмбрионов ограничено из-за неэффективного проникновения эозином (данные не показаны). Для увеличения penetr тканиданию E15.5 и E18.5 эмбрионов, мы использовали два различных метода предварительной обработки, которые совместимы с флуоресцентной визуализации 11 и протестировали новую формулу, Очищающий раствор (4 М мочевины, 10% глицерина и 4% SDS). Все эти методы показали значительное улучшение проникновения в ткани и эозином. Важным фактором до и после предварительной обработки является то, что образец склонен к коже припухлость или сокращается из-за осмотического давления. Чтобы ограничить внезапное изменение осмотического давления, таким образом, уменьшить деформацию ткани, мы рекомендуем постепенный обмен раствора. Кроме того, мы обнаружили, что включение этанола значительно помогает (этап 1.5.4). Во время инфильтрации и встраивание шагов, важно, чтобы держать образец от света и при 4 ° С.
В совокупности этот протокол использует обычное лабораторное оборудование для получения изображений ЭМВР, который совместим для 3D визуализации высокого разрешения и анализа морфометрического. Shou протоколLd можно легко адаптировать в любой стандартной лабораторной установке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
- Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
- Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
- Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
- Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
- Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).
