Protocol
Todos los usos de animales son aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Hospital Infantil de Boston.
1. Preparación de muestras
- apareamiento sincronizado
- Coloque una C57Bl6 tipo salvaje macho y una hembra juntos en la misma jaula.
- Comprobar la formación de un tapón de apareamiento mañana siguiente temprano. La clavija de acoplamiento (aka, la vagina o el enchufe de la cópula) es una deposición gelatinosa endurecida que bloquea la vagina.
- Ajuste la fecha enchufe como el día embrionario 0,5 (E0.5).
- El aislamiento de los embriones de ratón
- La eutanasia a las mujeres embarazadas por asfixia con CO2.
- Ponga los ratones en posición supina sobre una almohadilla absorbente y rociar región abdominal con un 70% de etanol.
- Levantar la piel y hacer una incisión de 5 mm inicial en la región abdominal caudal utilizando tijeras quirúrgicas. Cortar y quitar la piel abdominal para exponer completamente los órganos internos
- Cortar cerca de Vagina para extirpar todo el útero.
- Cortar entre sitios de implantación a lo largo de la trompa uterina. Cada segmento o producto de la concepción deben tener un solo embrión en su interior.
- Mantener los segmentos uterinos en solución salina 1x helada tamponada con fosfato (PBS).
- la disección de embriones
- Coloque cada embrión en un plato aparte con helado de PBS en un estereoscopio.
- Retire los tejidos uterinos, la placenta y luego las membranas fetales utilizando secuencialmente pinza de disección finas.
- Transferir el embrión diseccionado a un tubo de 50 ml con 1x PBS enfriado con hielo usando un gran pipeta de transferencia. Evitar la captación de embriones directamente con fórceps para minimizar el daño tisular.
- Fijación
- Fijar los embriones disecados en solución de formalina tamponada neutra al 10% a 4 ° C durante más de 24 horas con al menos 10 volúmenes de muestra de fijador.
- El pretratamiento
- Preparar la solución clarificadora: 4M urea, 10% de glicerol, 4% dodecil sulfato de sodio (SDS) en agua bidestilada.
- Vuelva a colocar el fijador con la Solución de Compensación.
- gire suavemente la muestra sobre un balancín a temperatura ambiente durante 1 - 2 semanas. Intercambiar la solución de aclarado una vez en el segundo y el tercer día. El espécimen se convierte poco a poco clara y translúcida.
- Vuelva a colocar la solución de aclaramiento con formalina al 10% y dejar en un agitador durante 2 días.
- Deshidración
- Se lavan las muestras pretratadas con 1 x PBS 3 veces durante 5 minutos cada uno.
- Deshidratar las muestras en una serie ascendente de etanol a temperatura ambiente en un agitador suave. Para los embriones E15.5, utilizar una serie de etanol ascendente incluyendo 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% y 100% de etanol, 2 hr cada paso. Para los embriones de más edad, el tiempo de incubación debe ser aumentado.
- tinción
- Preparar la solución de tinción: añadir 0.1375 gramos de eosina Y sal disódica y 0,0275 gramos de naranja de acridina hemi (cloruro de zinc) de sal a 50 ml de etanol al 100%. Se agita durante 2 hr. Filtro con un papel de filtro. Almacenar a temperatura ambiente y evitar la luz cubriendo con papel de aluminio.
- Transferir la muestra a la solución de tinción durante 1 hora.
- Reemplazar con solución de tinción durante la noche fresca y mancha.
- Infiltración
- Preparar solución de infiltración: combinar 100 ml de solución A de JB-4 kit incrustación, 1,25 g de catalizador C, 0.275 g de eosina Y sal disódica y 0,055 g de naranja de acridina hemi (cloruro de zinc) sal. Revuelva para mezclar (200 rpm) en un cubo de hielo durante 2 horas, y luego filtrar con papel de filtro.
- Almacenar la solución de infiltración a 4 ° C y evitar la luz cubriendo con papel de aluminio.
- La transferencia de los embriones a la infiltración de soluciones: solución de tinción (1: 1), y se incuba durante al menos 3 horas en un puente a 4 ° C.
- La transferencia de los embriones a la infiltración de soluciones e incubar durante 3 hr en un agitador en una habitación fría.
- Reemplazar solución de infiltración una vez al día, y dejar en un cuarto frío en un agitador suave durante tres días más.
2. Incorporación
- Mantenga la solución B y la solución de infiltración en el hielo.
- Hacer Solución incrustación (1:25 de la solución B y la solución de infiltración) inmediatamente antes de la incrustación.
- Orientar el espécimen en un molde de inclusión, a continuación, vierta la solución incrustación fría en el molde de inclusión con suavidad. Vuelva a orientar con un alfiler, si es necesario.
- Use un alfiler para examinar si la solución de incrustación se solidifica. Empuje a cabo primero la muestra, y el ajuste si es necesario.
- Reorientar primero la muestra usando el molde separado para obtener una orientación transversal.
- Poner un soporte de bloque en la parte superior del molde de inclusión. Vierta suavemente la solución incrustación en el molde hasta que el molde y el soporte del bloque están sumergidos mediante la incorporación de soluciones.
- Mantenga la muestra en un recipiente secundario y dejarloen hielo durante 3 - 4 horas en una campana de humos.
- Almacenar las muestras solidificadas en un 4 ° C.
- Despegar el molde de inclusión. Ponga el bloque bajo el microscopio estereoscópico con iluminación oblicua a la posición de la muestra en el bloque de inspeccionar. En la cara del bloque, las líneas de cuadrícula en Todo el espécimen.
- Recortar el bloque para eliminar el acceso cantidad de material aglomerante usando las líneas de la cuadrícula marcados como referencias.
3. Adquisición de imágenes
- Colocar primero la muestra para el microtomo y obtener una superficie recién cortada. Establecer espesor de corte (por ejemplo, e9.5-10.5, 1,5 micras; e11.5-12.5, 2,0 micras; e13.5-15.5, 2,5 micras; E16.5-mayores, 3 M). Mantenga la muestra / de bloques en la posición inicial del microtomo.
- Montar el microscopio estéreo con zoom horizontalmente hacia la superficie del bloque de la muestra.
- Encienda el ordenador y el microscopio, y ejecutar el software de adquisición de imágenes.
- Visualizar y enfocar la óptica al bloque carabajo la modalidad de "visualización en vivo" de software de imágenes.
- Alinear microscopio y micrótomo si es necesario de modo que el bloque de cara está en el centro de visor.
- Ajuste el zoom de modo que el bloque entero cara está dentro del visor.
- Seleccione la proteína fluorescente (GFP) filtro verde (excitación 470 ± 20 nm, dicroico 495 nm, emisión 525 ± 25 nm) y reorientar, si es necesario.
- Medir y ajustar el tiempo de exposición manualmente (por ejemplo, el 80 - 400 mini-seg).
- Adquirir imágenes del bloque de cara después de cada corte fresco y guardar las imágenes automáticamente, si es posible.
- parámetros importantes de registro incluida la resolución, el espesor de la sección y el zoom.
- Después de terminar la totalidad de la muestra, la exportación y convertir todos los archivos de imagen a formato JPEG si es necesario.
- Invertir todas las imágenes originales usando un software de procesamiento de imágenes y ajustar el brillo y el contraste.
- Guardar todas las imágenes procesadas en una carpeta separada.
4. 3DVisualización
- Sube todas las imágenes procesadas a un software de visualización 3D siguiendo las instrucciones.
- Resolución de entrada y espesor de corte para convertir todas las imágenes en datos volumétricos (es decir, el tamaño del voxel) y guardar el archivo 3D.
- Alinear todas las imágenes utilizando el modo automático. Ajustar las imágenes individuales de forma manual si es necesario.
- Guarda la imagen alineada con un nuevo nombre de archivo.
- Analizar las características morfométricas de la muestra utilizando el software de visualización 3D.
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Representative Results
Hemos informado imágenes HREM de alta calidad de los embriones de ratón entre E9.5 y E13.5 8. La calidad de imagen de los embriones por etapas finales de los años, sin embargo, se ve comprometida de manera significativa debido a la limitada penetración en el tejido de la eosina colorante fluorescente. Para aumentar la eficiencia de la tinción, hemos probado varios métodos de tratamiento previo que son compatibles con imágenes fluorescentes 11. En concreto, los embriones de ratón E15.5 fueron tratados con Sca / e A2 12 o para todo el cuerpo CÚBICO 13. También hemos probado la fórmula simplificada, la solución de aclaramiento (4 M de urea, glicerol al 10% y 4% de dodecilsulfato de sodio). Todos los métodos de pretratamiento aumentaron la eficiencia de la tinción. Los embriones se hizo translúcido después de 1 semana de tratamiento con la solución de Compensación. No se detectó ningún daño en los tejidos evidente después del tratamiento. Los embriones tratados previamente fueron procesados a través de etapas que incluyen la deshidratación, manchas y la infiltración antes de ser embedded en los medios de inclusión plástica. HREM imágenes fueron adquiridas de la muestra incrustados como se describió anteriormente en la sección 3 (Adquisición de imágenes) y se muestra el uso de un software de visualización 3D. Un ejemplo de visión entera superficie de la montura del embrión E15.5 demostró rasgos morfológicos detallados de la piel incluyendo los cojines barbas y desarrollo folículos pilosos (Figura 1). Resolución de la vista en sección virtual fue comparable al corte histológico (Figura 2).
Figura 1:. 3D vista de la superficie del embrión E15.5 Muestra las características morfológicas detalladas de la piel. Los folículos pilosos en desarrollo (pequeños puntos blancos) son evidentes, lo que demuestra de alta resolución de la imagen. Por favor, haga clic aquí para ver una mayor cincorsión de esta figura.
Figura 2:. La Sección virtual Vista de la sección de la línea media del embrión E15.5 Las estructuras internas, incluyendo el corazón, el hígado, el intestino y la vejiga son claramente visibles. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
A continuación, presentamos un protocolo modificado mediante equipos de laboratorio de rutina para adquirir imágenes HREM de serie que son compatibles para la visualización 3D rápida y análisis morfométrico de las estructuras complejas. Debido a que las imágenes de alta resolución se toman directamente de la cara del bloque en lugar de secciones individuales, las características morfológicas finas se conservan y rápidamente reconstruidas digitalmente en un programa de visualización en 3D.
imágenes en 3D ofrece ventajas significativas en la visualización y la comprensión de las características morfológicas complejas. La mayoría de las tecnologías de la imagen 3D dependen de equipo especializado 1-4. Por el contrario, EFIC y la imagen HREM solamente utilizan equipo de laboratorio estándar incluyendo un estereomicroscopio equipado con una cámara digital y un micrótomo 14. acoplamiento funcional entre microscopio y micrótomo permite la automatización de la adquisición de imágenes permite la automatización de todo el proceso de adquisición de imágenes. Sin embargo, hemos demostrado queacoplamiento funcional no es obligatorio 8. En su lugar, basta con montar el microscopio estereoscópico horizontalmente de manera que mire directamente a la cara de bloques de un microtomo estándar en la posición de parada de descanso. La principal limitación de este sencillo programa de instalación es que las imágenes HREM tienen que ser tomadas manualmente. Hemos estimado que se tarda unos 5 segundos por imagen en promedio. Otra limitación es que la imagen individuo puede pasar de una posición a otra, pero esto no es un problema debido a que están fácilmente reajustado durante la reconstrucción 3D.
El uso de la tecnología HREM, hemos analizado una serie de imágenes en 3D de embriones de ratón de E9.5 a E13.5, y descubierto un nuevo mecanismo por el cual la cloaca embrionaria solitaria se transforma en dos estructuras separadas, el tracto digestivo distal y el urinario inferior tractos 8. Calidad de las imágenes de HREM tarde por etapas embriones es limitado debido a la penetración ineficiente de eosina (datos no mostrados). Para aumentar el tejido penetración de E15.5 y E18.5 de embriones, se han utilizado dos métodos de pretratamiento diferentes que son compatibles con imágenes fluorescentes 11 y probado una nueva fórmula, la solución clarificadora (4 M urea, 10% de glicerol y 4% de SDS). Todos estos métodos han mostrado una mejora significativa de penetración en el tejido y la tinción eosina. Una consideración importante antes y después del tratamiento previo es que el espécimen es propenso a la piel hinchazón o contracción debido a la presión osmótica. Para limitar el cambio repentino de la presión osmótica reducir por ello la deformación del tejido, se recomienda de cambio gradual de la solución. Además, hemos encontrado que la inclusión de etanol ayuda significativamente (el paso 1.5.4). Durante la infiltración y la incrustación de pasos, es importante mantener la muestra de la luz y a 4 ° C.
En conjunto, este protocolo utiliza equipos de laboratorio de rutina para adquirir imágenes HREM, que es compatible para la visualización en 3D de alta resolución y el análisis morfométrico. El protocolo de Should ser adaptado fácilmente en cualquier entorno de laboratorio estándar.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
- Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
- Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
- Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
- Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
- Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).
