Abstract
Cnidarians, en in het bijzonder Hydra, werden de eerste dieren getoond om beschadigde of doorgesneden structuren, en inderdaad dergelijke studies aantoonbaar gelanceerd moderne biologische onderzoek door het werk van Trembley meer dan 250 jaar geleden te regenereren. Momenteel de studie van regeneratie een opleving waarbij zowel "klassieke" regeneratief organismen, zoals de Hydra, planaria en Urodeles, alsook een verbreding spectrum van soorten verspreid over het gebied metazoen uit sponzen tot zoogdieren gezien. Naast haar intrinsieke belangstelling als een biologisch fenomeen, begrijpen hoe regeneratie werkt in een verscheidenheid van soorten zullen ons te informeren over de vraag of regeneratieve processen delen gemeenschappelijke kenmerken en / of soorten of context-specifieke cellulaire en moleculaire mechanismen. De starlet zeeanemoon, Nematostella vectensis, is een opkomende modelorganisme voor het regenereren. Net als Hydra, Nematostella is een lid van de oude stam, Cnidaria, maar binnen tHij klasse Anthozoa, een zuster clade de hydrozoa dat is evolutionair meer basaal. Zo aspecten van de wedergeboorte in Nematostella zal interessant zijn om te vergelijken en het contrast met die van de Hydra en andere cnidarians. In dit artikel presenteren we een methode te halveren, observeren en classificeren regeneratie van het aborale uiteinde van de Nematostella volwassene die Physa genoemd. De Physa ondergaat splijting natuurlijk als middel ongeslachtelijke voortplanting, en hetzij natuurlijke splijting of handmatig amputatie van de Physa triggers hergroei en hervorming van complexe morfologie. Hier hebben we deze eenvoudige morfologische veranderingen in een Nematostella Regeneration Staging System (de NRSS) gecodificeerd. We gebruiken de NRSS de effecten van chloroquine, een remmer van lysosomale functie blokkeert autofagie testen. De resultaten laten zien dat de regeneratie van poliep structuren, met name de mesenteria, abnormaal wanneer autofagie wordt geremd.
Introduction
De waarneming van de wedergeboorte in één hydra was het rudimentaire gebeurtenis in de komst van de biologie als een experimentele wetenschap 1,2. Regeneration blijft een fenomeen van buitengewoon brede aantrekkingskracht te bioloog en leg persoon gelijk. Het potentieel voor ontwikkelingsstoornissen biologen, artsen, biomedische wetenschappers en ingenieurs weefsel te begrijpen en het overwinnen van de beperkingen op de menselijke regeneratie maakt regeneratie biologie meer dan de op zich interessant.
Nu, met het gebruik van nieuwe technologieën zoals genome sequencing en winst en verlies van functie gereedschap, het veld is klaar om uit elkaar regeneratieve mechanismen plagen en om uiteindelijk te begrijpen hoe de verschillende soorten kunnen regenereren, terwijl anderen dat niet kunnen. De mate van gemeenschappelijkheid in de moleculaire, cellulaire en morfologische reacties nog worden opgehelderd, maar tot nu toe lijkt het erop dat de fundamentele reacties onder dieren die kan regenereren meer lijkt dan zijn Imagi zou hebbenned slechts tien jaar geleden 3.
Cnidarians in het bijzonder gemakkelijk op bijna al hun lichaamsdelen regenereren midden van een breed spectrum van morfologische diversiteit. Van de eenzame zoetwater poliep, Hydra samen met de kleine mariene poliepen die immense koraalriffen te bouwen, om de complexe koloniale siphonophoren, zoals de Portugese Man-O-War, regeneratie is vaak een manier van voortplanting, in aanvulling op een mechanisme voor het repareren of de hervorming van beschadigde of verloren lichaamsdelen als gevolg van een blessure en predatie. Of de diverse soorten Cnidaria gebruiken dezelfde of verschillende mechanismen voor de regeneratie is een fundamenteel interessante vraag 4-6.
Wij, en anderen zijn het ontwikkelen van de anthozoan, Nematostella vectensis als een model voor regeneratie 7-17. We hebben onlangs ontwikkelde een staging-systeem voor het beschrijven van de regeneratie van een hele lichaam van een morfologisch uniform stukje weefsel doorsneden uit de Aboral einde van de poliep 10. Terwijl Nematostella poliepen kan regenereren wanneer doorsneden op elk niveau, hebben we gekozen om volwassenen te snijden op een aboral positie in de meest morfologisch eenvoudige regio, de Physa, mede omdat deze dicht bij de normale vlak van natuurlijke aseksueel kernsplijting 18, en ook omdat het vergunningen observatie en moleculaire analyse van hoe een hele lichaam in elkaar zetten van de eenvoudigste morfologische componenten.
De Nematostella Regeneration Staging System (NRSS) voorziet in een relatief eenvoudige set van morfologische benchmarks die kunnen worden gebruikt om de voortgang van elk aspect van de wedergeboorte scoren door een geamputeerde Physa, onder normale kweekomstandigheden of experimenteel verstoorde situaties zoals kleine molecule behandelingen, genetische manipulatie of milieu-wijziging. Zoals verwacht, is de NRSS steeds aangenomen morfologisch stellage waarop de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen regeneratie kan worden verwezen10.
Tenslotte onze manier van snijden produceert een gapend gat verschillende ordes van grootte hoger dan de pin punt lek gebruikt in een recent onderzoek 17, maar beide wonden te helen in ongeveer 6 uur. Documenteren visueel arrestatie en verschillende fasen van wondsluiting moet voorstellen experimentele benaderingen om de schijnbare onafhankelijkheid van de grootte van een wond en de tijd die nodig is om te sluiten leggen. Zo kan een dieper visuele begrip van de aboral amputatie proces, die door dit protocol, zal verder onderzoek helpen in dit model regeneratie systeem en de toepassing van deze enscenering systeem met behulp van Nematostella vectensis verbreden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Conditionering van dieren voor de temperatuur, voeding en licht / donker-cyclus
- Verkrijgen Nematostella vectensis volwassenen uit een van de vele Nematostella laboratoria over de hele wereld, of een non-profit leverancier (tabel 1)
- Handhaaf Nematostella bij constante temperatuur (meestal tussen 18 en 21 ° C) in het donker, in "1 / 3x" kunstmatige zeewater (ASW) bij een zoutgehalte van 12 delen per duizend (ppt). Handhaaf culturen in eenvoudige natronkalkglas cultuur gerechten, typisch 250 ml of 1,5 liter capaciteit 11.
Let op: Deze eenvoudige kweekomstandigheden worden vaak gebruikt onder de labs die Nematostella studeren, maar de cultuur zorg kan ook worden geautomatiseerd 19. - Feed Nematostella vers uitgekomen Artemia naupliën 2 - 4x per week. Hatch Artemia cysten in volle sterkte (36 ppt) of 1 / 3x ASW bij 30 ° C, in een ondiepe rechthoekige glazen schaal 20 ofelk van een aantal kleine schaal, commerciële of zelfgemaakte pekelgarnalen broederijen. Als een incubator niet beschikbaar is, zal garnalen uitkomen bij kamertemperatuur maar doen dat langzamer.
Opmerking: Dit vereist vaak meer dan 24 uur voltooid. - Vervang anemoon cultuur water minstens een keer per week. Voor de beste volwassen gezondheid, grondig te reinigen (zonder zeep) de cultuur kommen een keer per week van de geaccumuleerde slijm afscheidingen, die de vacht van de kom en val niet opgegeten voedsel en afval, en kan verwarren de dieren.
2. Selectie en Ontspanning van nutritioneel Geconditioneerd Dieren
- Select-maat aangepast poliepen van ongeveer dezelfde lengte (3-5 cm, wanneer natuurlijke, ontspannen) en plaats ze in een kom gescheiden van de kolonie gedurende drie dagen voor amputatie.
Opmerking: Het aantal dieren geselecteerd voor het snijden wordt bepaald door het experiment wordt uitgevoerd, natuurlijk, maar in het algemeen er minimaal vijf dieren per monsterpunt zes replicaties. aldusin een typisch experiment minste 30 dieren worden voorgeselecteerd. In het algemeen is het verstandig om meer dan het minimum aantal (30) sinds amputaties die onregelmatig (zie hieronder) kan later van invloed scoren zijn te selecteren. - Verwijder de schotel van geselecteerde dieren uit de incubator naar kunstlicht ten minste één uur voor amputatie.
Opmerking: Blootstelling aan licht en trillingen van de behandeling zal waarschijnlijk leiden tot de dieren te contracteren, dus ze moeten worden aangepast of "relaxed" door incubatie op de labtafel. Dieren zullen vuurvaste aan te raken en blootstelling aan licht te worden en op dat punt kan worden verplaatst door zachte pipetteren. - Optioneel: Verdoven van de dieren door het toevoegen van 7,5% MgCl2 (in 1 / 3x ASW). Voorzichtig voeg de MgCl2-oplossing in de kom met een standaard kunststof 5 ml pipet.
Opmerking: Hoewel de dieren uiteindelijk gewend zal worden om het licht en de fysieke manipulatie, kan het voordelig zijn om dieren te verdoven te handhaven of "fix" thij ontspannen toestand nadat ze langwerpige 16,21,22 zijn geworden. - Gebruik een brede boring (> 0,5 cm) plastic pipet over te dragen (in 1 / 3x ASW) vijf dieren van het zwembad worden geamputeerd, in de bodem van een steriele glazen snijden schotel van 100 mm diameter met 12 ppt ASW. Plaats de schotel op het podium van een stereomicroscoop met variabele vergroting tussen 10 - 40X.
Opmerking: Als de dieren niet verdoofd en ontspannen voor het snijden, kunnen ze nog steeds reageren op aanraking en stereoscoop verlichting en daarmee kan het nodig zijn een paar minuten om weer ontspannen te worden.
3. Amputatie
- Met een steriele scalpel, amputeren de aboral Physa uit elke poliep, met als doel een deel van de Physa die ongeveer zo lang als breed en met niet mesenterium verkrijgen.
Opmerking: de ideale cut site is gewoon aboral de beëindiging van het mesenterium. Op het vlak van snijden er een overgang van mesenterium goede dunne lines overeenkomstig elke mesenteriale insertie (zie figuur 1, pijlen). Afwezigheid van mesenterium is van cruciaal belang, omdat het slijm dat kan vergemakkelijken 'inpluggen' het gat 17,30 produceert.- Plaats de scalpel in contact met het dier op de gewenste plaats van amputatie. Doe dit hetzij zonder hulp (vrije hand) of door voorzichtig grijpen lichaam van het dier met een # 5 pincet (Dumont stijl of soortgelijke).
- Snij door het weefsel door gebruik te maken van de gebogen blad van de scalpel in een 'rockende' beweging over het lichaam.
Opmerking: Het weefsel moet netjes te snijden als de scalpel wordt gewiegd en te bevrijden van het gewenste gedeelte van Physa van de donor. Echter, als een klein stukje weefsel nog steeds het lichaam en de Physa verbindt, snijd het met de scalpel. Probeer niet om de aangesloten stukken te scheiden door te trekken, omdat dit de Physa kan beschadigen.
- Verwijder elke geamputeerde 'donor' poliep van het gerecht en terug te sturen naar een SEPArate kom met label 'gepoolde geamputeerden'; dateren de kom en terug te sturen naar de stam.
Opmerking: geamputeerde poliepen zal de aboral wond binnen een dag te genezen en dan kan normaal worden gevoed. Zij zullen een normaal uitziende Physa binnen twee weken waarna het Physa opnieuw kan worden geamputeerd indien gewenst regenereren. - Spoel de uitgesneden Physa dat de snij schotel 12 ppt ASW blijven, vervolgens over elk Physa een afzonderlijk steriel putje in een multi-well celcultuur plaat die al 10 ml 12 ppt ASW in elk putje.
Opmerking: Dit voorbeeld maakt gebruik van een zes goed plaat, met elk putje die 10 ml van zeewater en vijf uitgesneden Physa. In het algemeen zeewater moet het Physa voldoende dekking om de blootstelling aan lucht te voorkomen als gevolg van beweging in de behandeling en de potentiële verdamping. De plaat of putten moet een deksel hebben. - Herhaal stap 3,1-3,3 ten minste 5 Physa te verzamelen in elk putje gereserveerd voor elke experimentele behandeling.
- Incubeer de Physa bij een temperatuur die provide het beste tarief van de wedergeboorte van de geplande experimentele ondervragingen. Plaats de plaat met de Physa in een incubator temperatuur gebracht, bij een vaste temperatuur bepaald door de gewenste snelheid van regeneratie.
Opmerking: De Physa zal ontbrekende weefsels regenereren en vormen een volledige poliep bij incubatie bij temperaturen tussen 15 en 27 ° C. De snelheid van regeneratie temperatuurafhankelijk is, behalve voor de eerste twee fasen. De gemiddelde dag voor het bereiken Fase 4 voor alle temperaturen 7 d na het uitsnijden en dit valt ook samen met regeneratie bij 21 ° C. Bij 27 ° C, wordt Fase 4 ongeveer 3 dagen eerder bereikt en bij 15 ° C, wordt Fase 4 vertraagd met ongeveer 3 d tegenover regeneratie bij 21 ° C (zie eveneens referentie 10).
4. Het beoordelen van Regeneratie met de Nematostella Regeneration Staging System (NRSS)
- De score van de Physa met behulp van een stereo-samengestelde microscoop met een variabele magnificatie (10 - 80X). De score van de vers gesneden Nematostella Physa Fase 0 en blijven scoren op hetzelfde tijdstip iedere dag na de amputatie (dpa) met behulp van de NRSS 10.
Opmerking: Voor key staging criteria en details verwijzen Reference 10.- Score Physa Fase 0 (open wond) indien een vers gesneden Physa verschijnt als een beker- vormige massa die lijkt op een slappe ballon, met een open wond is waarschijnlijk zichtbaar is.
Opmerking: De wondranden Ook elkaar blijven vanaf het begin, maar het weefsel nog ingeklapt en stijfheid ontberen. De randen van de open wonde kunnen worden waargenomen radiale contractie van de wond geneest ondergaan. - Score Physa Fase 1 (Wound Closed) als de amputatie wonde lijkt gesloten.
Let op: de wond locatie komt overeen met de toekomst mondelinge paal. Het buitenoppervlak rondom de toekomst orale paal kunnen gaan verschillende bogen die overeenkomt met de onderliggende stervormig symmetrisch endodermale mesenteriale inserties geven. - score physa Fase 2 (Radial bogen) indien het oppervlak van de orale paal verschijnt opgeblazen, onthullen acht verhoogde bogen gerangschikt in een stervormig symmetrisch patroon en van elkaar gescheiden door groeven. Observeren kleine, halfbolvormige blebs aan de top van de bogen. Ze zal ongeveer zo groot als breed, waarschijnlijk van voorbijgaande aard, en bestond aanvankelijk uit door een enkele ectodermale cellaag.
Let op: In sommige gevallen kan dubbellaags blebs stabiliseren. Opmerking: In dit of een latere fase een slijmlaag lijken de Physa (figuur 2) in een membraneuze 'omhulsel' kapselen. Het inkapselend materiaal moet worden verwijderd een doelpunt te vergemakkelijken. - Score Physa Fase 3 (tentakel) als de toppen van de tentakels bevattende mesodermale en ectodermale weefsels lagen stabiel worden gevormd aan de orale einde van ten minste enkele radiale bogen.
Opmerking: De tentakels zijn langer dan breed zijn en minimaal beweeglijk. De Physa zal tonen gestegen, maar variabele inflatie, zodat mesenterium rudimenten kan worden visbaar uitstrekt vanaf de mesenteriale inbrengen in de lichaamsholte (coelenteron). - Score Physa Fase 4 (Linear mesenteria) indien het Physa bevat acht verschillende, zichtbare mesenteria dat in het lichaam muur tot in de coelenteron van toevoegingen, met orale-aboral lengtes die meer dan twee keer de radiale breedte gemeten van waar ze lijken aan te sluiten zijn de keelholte aboral aan zijn uiteinde (enterostome).
Opmerking: vier of minder mesenteria hebben "geplooide" interne vrije randen. De keelholte zichtbaar. Meer dan acht tentakels zichtbaar, beweeglijk en soms rechtstreeks zij in het lichaam. - Score Physa Fase 5 (voornamelijk geplooide mesenteria) indien de Physa heeft meer dan vier mesenteria met plooien en de plooien is voller en bochtige dan in fase 4. Het dier heeft een bijna "normale" volwassen uitstraling, maar er zijn geen zichtbare gonadale cellen.
- Score Physa Fase 0 (open wond) indien een vers gesneden Physa verschijnt als een beker- vormige massa die lijkt op een slappe ballon, met een open wond is waarschijnlijk zichtbaar is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De voortgang van morfologische gebeurtenissen tijdens regeneratie afgesneden Physa wordt getoond in Figuur 1A, die representatief uitzicht Physa in elke NRSS fase omvat. De typische Physa cut site is aangegeven op de volwassen (pijlpunten). De foto's in figuur 1A tonen geleidelijke herstel van mondelinge en anatomische eigenschappen van vers gesneden Physa door middel van volledig gevormd poliep. Figuur 1B, C de inrichting van interne septa, de mesenteria tonen in fase 4 en fase 5, respectievelijk. Merk op dat sommige mesenteria in fase 4 "plooien" zal ontbreken, maar te kwalificeren als een Fase 5 van de meerderheid moet plooien hebben ontwikkeld. Figuur 1D toont een Physa gehuld in een membraan van slijm die kan worden verwijderd met een pincet (figuur 1E). Hoewel gewoonlijk niet schadelijk voor regeneratie (tenzij onredelijk vangt het dier), kan het membraan verhinderen scoren van de Physa en doeing experimentele manipulaties, zoals microscopie, monster fixatie of oogsten voor moleculaire / biochemische analyse. Dit wordt het best verwijderd na Fase 1, of later als het hervormingen.
Figuur 2 toont hoe de staging systeem kan worden gebruikt om de resultaten van een experiment score om de effecten remmen autofagie beoordelen. Physa werden gesneden en behandeld met chloroquine bij 10, 50 en 100 uM of Physa werden niet behandeld (controle). Chloroquine remt lysosomale functies die nodig zijn voor autofagie. De NRSS criteria werden gebruikt om de Physa in de loop van de wedergeboorte en de resultaten werden uitgezet in figuur 2E scoren. Foto's van representatieve controle (Figuur 2A) en chloroquine behandeld Physa (figuur 2 B - D) werden gemaakt toen de controles bereikte stadium 5. Chloroquine behandelde dieren niet verder dan fase 4, en ze meestal tentoongesteld onvolledig mesenterium regeneratietie (meest ontbrak plooien), korte tentakel grootte, en in sommige gevallen korte lichaamslengte.
Figuur 1. Eigenschappen van regeneratie. (A) Voorbeelden van Physa regenereren orale en lichaamsstructuren opgevoerd volgens de NRSS. Paneel gemerkte Volwassen toont kenmerken van een volwassen dier met tentakels (t) pharynx (ph), mesenteria (m) en mesenterium inserties (mi). Witte pijlen geven aan waar geplooide regio mesenteria overgang naar het mesenterium inbrengen, een bergkam van endoderm te breiden tot de aboral terminus. Dit gebied vormt de Physa. Gele pijlen tonen ideale Physa tweedeling plaats. Panel 0 toont vijf Physa minuten na de tweedeling en Panel 0 'is een vergrote weergave van een één van die Physa, met een open wond in het midden, het definiëren Stadium 0 van deNRSS. Paneel 1 toont een Physa met de wond nu gesloten, het definiëren van Fase 1. Paneel 2 shows Physa met verhoogde radiale bogen rond de mondelinge paal, met opgeblazen weefsels hieronder, dat overeenkomt met de derde fase 2 (panelen 0-2 zijn uitzicht op de mondelinge einde). Paneel 3 toont tentakel knoppen die zich op de mondelinge pool (naar rechts) van het langgerekte en opblazen Physa, nu in fase 3. Opmerking rudimentaire mesenterium elementen worden zichtbaar en de keelholte vormt in het donker gebied aan de mondelinge einde. Paneel 4 toont het ontstaan van werkelijke tentakels, alsmede tijdelijke "blebs" op orale pool, definiëren Fase 4. Lineaire mesenteria zichtbaar in de opgeblazen Physa. De grote ronde massa zichtbaar in de poliep is van onbekende oorsprong en zal worden uitgezet via de mond. Panel 5 toont bijna volledige regeneratie gekenmerkt door meer dan vier geplooide mesenteria, een volledig gevormd pharynx en acht of meer tentakels, die zij omschrijft als Stage 5. (B, C) aboral uitzicht op de individuele Physa illustreren de biradial arrangement en de morfologie van mesenteria. In deze visie, geplooide mesenteria lijken een uitstulping van het weefsel halverwege (groene pijl) te hebben. Een Fase 4 Physa vier of minder geplooid mesenteria, en een podium 5 Physa heeft meer dan vier (C). Mesenteria met of zonder plooien zijn aangegeven met groene of gele pijlpunten, respectievelijk. Zwarte pijlpunt in (C) wordt een geplooid mesenterium dat radiaal verlengd is. (D, E) Verwijdering van een slijmerige omhulsel van de Physa is afgebeeld. De witte pijlen wijzen op een slijmerige omhulsel rond de Physa (D), die moeten worden verwijderd als in (E) voordat hij scoorde regeneratie. Soms achtergebleven weefsel (gele pijlen) kan worden gevangen in de schede, en deze ook moeten worden verwijderd. Asterisk geeft orale polen, waar de marked. Rood maat bars zijn 0,5 mm in alle panelen behalve A5 (1,0 mm). Panelen B en C van deze figuur werden aangepast en herdrukt met toestemming van referentie 10. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Effecten van Chloroquine op Regeneration. Een toepassing van de NRSS tonen, we testten de effecten van een chloroquine, een remmer van autofagie. Physa werden geamputeerd en onmiddellijk geplaatst in 1 / 3x ASW bevattende 0,1% DMSO (controle) of chloroquine bij 10, 50, 100 uM. Physa werden gescoord na 24 uur met tussenpozen met de NRSS. (A) Vertegenwoordiger eindpunt foto's genomen van de controles als ze stage 5 bereikt.
Figuur 3. Overzicht vanbelangrijkste kenmerken van de NRSS fasen. Deze grafiek toont de belangrijkste morfologische veranderingen die elke stap van de NRSS definiëren. Richting van de bewegingen worden aangegeven door rode pijlen en functies door groene pijlpunten. Stage 0 beeldt open wond net na het snijden van (A), en t). De wondranden ondergaan sluiting radiale samentrekking naar het midden (B). Stadium 1 wordt gekenmerkt door een volledige wondsluiting (C) en de hoogte van de bogen tussen orale gerichte richels (D); het centrum van het orale oppervlak (pijlpunt) wordt ingedrukt. Fase 2 heeft een uitgesproken welving van de orale oppervlak (pijlpunt, E); de Physa begint te verlengen en worden smal (F) met tentakel knoppen en blebs zichtbaar aan de top van de bogen (pijlpunten). Fase 3 heeft stabiele tentakel knoppen (pijlpunt, G) en het regenereren keelholte kan worden gezien als een dichtheid bij de mondelinge pool (oranje massa, pijlpunt in H (I) die ten minste tweemaal zo lang als ze hoog zijn bij knooppunt pharynx (I ') te zijn. Vier of minder mesenteria kunnen worden geplooid naar hun binnenrand - de mesenteriale filament (J, J '). Stage 5 wordt gekenmerkt door meer dan vier geplooide mesenteria (K), die het best kan worden beoordeeld door het bekijken van het aborale uiteinde (K '). Re-print met toestemming van referentie 10. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gebruik van Nematostella als model voor wondgenezing en regeneratie wordt steeds populairder. Aldus is het belangrijk om te kunnen de morfologische patroon van een bepaald protocol zien voordat effectieve cellulaire en moleculaire analyses kunnen worden toegewezen en vergeleken. Nematostella een hoge regeneratieve "flexibiliteit", in staat om bijna hervormen ontbrekende structuur afgezet op elke locatie, op post-planula levensstadia. Zo hebben verschillende onderzoekers onderzocht regeneratie gevolg van amputatie of verwonden in verschillende gebieden van poliepen, op verschillende leeftijden en maten 7-18.
De enscenering systeem hier beschreven volgt de transformatie van een morfologisch uniform deel van Physa, geamputeerd vanaf het aboral einde van een volwassene, om een anatomisch compleet juveniele poliep ontbreekt alleen het reproductief weefsel (we hebben nog niet bepaald wanneer deze geregenereerd jongeren seksueel mtuur). Deze aanpak onderzoekt regeneratie van een eenvoudige rudiment van weefsel aan één van de buurt van de maximale complexiteit. Waaronder vijf Physa als een minimale groepsgrootte is aan te raden om te normaliseren voor potentiële individuele variabiliteit en overlevingspensioen. Natuurlijk kan dit aantal worden aangepast aan de specifieke experimentele doelen aan te passen, maar de NRSS protocol maakt 2 ml medium per Physa om een potentiële 'volume-effect', zoals die welke is gemeld voor regeneratie beïnvloeden hydra 23 ontkrachten.
Andere benaderingen om Nematostella regeneratie studie hebben gebruikt volwassenen doorsneden mid-instantie of bij de mondelinge einde, of juveniele 4-tentakel stadium poliepen doorsneden mid-body 7,11-18. Twee studies hebben onderzocht regeneratie in Physa bevrijd door natuurlijke splijting 16,18, en waarbij gebruik wordt gemaakt geamputeerd Physa hebben onlangs kwam met de NRSS 8,9. Elk van deze verschillende benaderingen heeft zijn eigen merites en kunnen unieke vragen over Regeneratie pakkenve processen die zich voordoen onder verschillende amputatie of verwonding regimes, en onder een andere oudere dieren. De NRSS protocol voor Physa amputatie en scoren, getoond in de huidige studie, genereert een relatief uniforme set van Physa voor een systematische studie en vermijdt variatie in de Physa omvang, weefsel samenstelling, en de daaropvolgende progressie van regeneratie waargenomen met natuurlijke dwarse kernsplijting 18,24. Hoewel Physa amputatie enigszins overeenkomt met de natuurlijke wijze van ongeslachtelijke voortplanting in Nematostella, zijn moleculaire verschillen geconstateerd tussen de regeneratie als gevolg van natuurlijke splijting en amputatie halverwege de body of op Physa 16,18,24. Of Physa volgens de werkwijze van amputatie beschreven of natuurlijke splijting vertonen deze verschillen nog worden bepaald.
Er zijn een paar zaken die van cruciaal belang voor succes met de opvoeding amputatie zijn, en scoren technieken die hier beschreven. Poliepen geselecteerd voor amputatie Should worden gehandhaafd op dezelfde temperatuur, aangepast voor Physa grootte voedingsgeschiedenis en zo mogelijk leeftijd (hoewel deze niet systematisch getest om te bepalen of er een leeftijd-effect van de schommelingen in fase progressie). Het verkrijgen van een open wond met een scherpe steriele scalpel met een gebogen mes is belangrijk voor de morfologische observaties van wondgenezing tussen fase 0 en fase 1. Wanneer de Physa wordt opgeblazen en de gebogen blad van de scalpel wordt wiegde over de volwassen weefsel, het is geamputeerd in één beweging en snel kan worden overgebracht naar de behandeling en het versnijden schotel. Amputaties die mesenterium bevatten of die het resultaat van uitgebreide fysieke manipulatie moet worden weggegooid.
Praktijk enscenering onbehandeld Physa om een gevoel van de individuele variatie in de populatie te krijgen wordt getest. Variatie tussen individuele Physa het minst de vroegste stadia. Bijvoorbeeld alle Physa zijn in fase 0 bij 0 dpa. Op dezelfde manier alle Physa bereiken Stage1 synchroon op 1 dpa. Het uiterlijk van fase 2 kan moeilijker voor de waarnemer te onderscheiden, omdat 'inflatie' is een relatief aandoening die wordt bereikt, echter met 2 dpa met weinig variatie. Het uiterlijk van de ware tentakels merken progressie naar fase 3. De regenererende tentakels kan worden gestoord door de verschijning van een membraneuze 'cocon' dat visualisatie van de tentakel kiem eronder belemmert. Als de membraneuze bekleding niet eerder is verwijderd, moet dus nu worden gedaan. Het verwijderen van het membraan met fijne getipt pincet zal de regenererende Physa bevrijden. Het onderscheid tussen fase 4 en 5 is het aantal geplooide mesenteria. Fase 4 heeft vier of minder geplooid mesenteria, en Etappe 5 heeft 5-8 geplooide mesenteria. Terwijl plooien in een zijaanzicht waarneembaar, het exacte aantal geplooide mesenteria beter waargenomen met een aboral uitzicht.
Een uitdaging in het bestuderen van volwassen Nematostella regeneratie van een PHYsa rudiment, en inderdaad met weefsels gesneden uit andere amputatie sites, is het gevarieerde duidelijkheid van de levende weefsels. De bol van de Physa is vrij duidelijk in de intacte volwassen, maar het wordt nogal ondoorzichtig als gevolg van weefsel krimp na amputatie. Duidelijkheid geeft geleidelijk (fase 2) zodra de wond sluit (fase 1) en het dier wordt opgeblazen, maar zelfs dan het gebied rond de wond waar de weefsels en structuren actief regenereren blijft enigszins overschaduwd door dichte weefsels (vooral Fase 3). Toegenomen inflatie begeleidt meestal Fase 4 en 5. Fixation gevolgd door optische opheldering zal vrijwel zeker op te lossen wat er gebeurt tijdens de mondelinge einde, maar meer informatief kan zijn levend, weefsel-specifieke transgene verslaggevers dat kan worden gecontroleerd op fluorescentie en gemakkelijker gevisualiseerd 15, 25-30.
Een geamputeerde Physa kan natuurlijk niet voeden, omdat het ontbreekt aan tentakels, mond en mesenteria (die de spijsvertering klieren haven), aldus requiring regeneratie van vermiste lichaam structuren moeten worden verwezenlijkt door het mobiliseren voedingsstoffen reserves van non-food bronnen. De Physa kan deze potentieel te bereiken is door autofagie, waarin cytoplasma, organellen en andere cellulaire componenten intracellulair worden verzwolgen en verwerkt door een lysosoom-afhankelijk mechanisme om energie en verbindingen te bereiden voor anabole processen 31-33. We vinden dat de behandeling van Physa met het lysosoom remmer, chloroquine, veroorzaakt een onregelmatige regeneratie van mesenteria en tentakels en algemene lichamelijke morfologie, wat aangeeft dat autofagie nodig is voor de normale regeneratie van orale en het lichaam structuren. Autofagie reguleert stamcel functies 34-36, en speelt een essentiële rol in de wedergeboorte in Hydra, planaria en zebravis 37-41. Nadere analyse is nodig om te begrijpen hoe autofagie beïnvloedt Nematostella regenereren op cellulair en moleculair niveau, maar onze eerste pas experiment toont het nut van het gebruik van de NRSS als een snelle screeningsmethode voor kleine moleculen die de regeneratie van invloed kunnen zijn.
De genetische, moleculaire en cellulaire processen die regeneratie reguleren Nematostella zijn slechts in een rudimentair stadium van begrip, maar dit opkomende model voor regeneratie heeft een groeiende repertoire van gereedschappen voor genomische en genexpressie analyse. Met zijn Geannoteerde genoom, een overvloed aan regionale en weefsel specifieke genetische markers en robuuste methoden voor transgenese, mutagenese, histologie en microscopie, Nematostella belooft mechanismen die anthozoan cnidarian regeneratie onthullen en ontdek of de regeneratieve processen op elkaar lijken of uniek onder cnidarians en meercelligen in het algemeen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een New York Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Subsidie voor GHT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
| Glass Culture Dish, 250 mL | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 mL |
| Glass Culture Dish, 1,500 mL | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 mL |
| Polyethylene transfer pipette, 5 mL | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
| Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
| #5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
| Pyrex Petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass Petri plates |
| Sterile 6-well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 12-well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 24-well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
| Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
| pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
| artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
| Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
| Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
| Beaker, Graduated, 4,000 mL | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
| Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 - 40X magnification |
References
- Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , The Boxwood Press. (1986).
- Trembley, A. Mémoires pour servir à l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, à bras en forme de cornes. , Jean & Herman Verbeek. (1744).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles? Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration? Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).
- Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).
- Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).
- Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).
- Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).
- Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).
- Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
- Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).
- Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).
- Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).
- DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
- Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
- Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).
- Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).
- Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
- Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).
- Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).
- Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
- Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
- Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).
- Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139 (2), 347-357 (2012).
- Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).
- DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
- Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).
- Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).
- Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).
- Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
- Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).
- Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).
- Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
- Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).
