Abstract
Cnidários e, especificamente, Hydra, foram os primeiros animais indicado para regenerar estruturas danificadas ou cortada, e na verdade esses estudos sem dúvida lançados investigação biológica moderna através do trabalho de Trembley mais de 250 anos atrás. Presentemente o estudo de regeneração tenha visto um ressurgimento usando ambos os organismos regenerativos "clássicas", tais como a hidra, e Planaria Urodelos, bem como um alargamento do espectro de espécies que abrangem a gama de metazoários, a partir de esponjas através de mamíferos. Além de seu interesse intrínseco como um fenômeno biológico, a compreensão de como a regeneração funciona em uma variedade de espécies irá informar-nos sobre se a processos regenerativos compartilhar recursos e / ou espécies comuns ou mecanismos celulares e moleculares específicas ao contexto. A anêmona de mar estrela, Nematostella vectensis, é um organismo modelo emergente para a regeneração. Como Hydra, Nematostella é membro do filo antiga, cnidaria, mas dentro de tele anthozoa classe, um clado irmão do Hydrozoa que é evolutivamente mais basal. Assim, os aspectos da regeneração na Nematostella será interessante comparar e contrastar com os de Hydra e outros cnidários. Neste artigo, apresentamos um método para bissetriz, observar e classificar a regeneração do fim aboral do adulto Nematostella, que é chamado de physa. O physa naturalmente sofre fissão como um meio de reprodução assexuada, e quer fissão naturais ou amputação manual da physa desencadeia re-crescimento e reforma de morfologias complexas. Aqui temos codificada estas alterações morfológicas simples em um sistema de estadiamento Nematostella Regeneração (a ENSR). Usamos o NRSS para testar os efeitos de cloroquina, um inibidor da função lisossómica que bloqueia autofagia. Os resultados mostram que a regeneração de estruturas de pólipos, particularmente os mesentério, é anormal quando autofagia é inibida.
Introduction
A observação de regeneração em um único hidra foi o evento seminal na advento da biologia como um 1,2 ciência experimental. Regeneração continua a ser um fenômeno da extraordinariamente amplo apelo para biólogo e leigo alike. O potencial para os biólogos do desenvolvimento, médicos, cientistas biomédicos e engenheiros de tecido para entender e superar os limites sobre a regeneração humana faz biologia regeneração mais de intrinsecamente interessante.
Agora, com o uso de tecnologias emergentes, como a sequenciação do genoma e ganho e perda de ferramentas de função, o campo está pronta para provocar mecanismos além regenerativos e compreender, finalmente, como espécies diferentes podem se regenerar enquanto outros não podem. O grau de comunalidade nas respostas moleculares, celulares e morfológicas continua a ser elucidado, mas até agora parece que as respostas básicas entre os animais que podem regenerar é mais similar do que teria sido imagiNED há apenas uma década 3.
Cnidários em particular, são facile na regeneração quase todas as suas partes do corpo em meio a um amplo espectro de diversidade morfológica. A partir do solitário pólipo de água doce, Hidra, juntamente com as pequenas pólipos marinhos que constroem imensos recifes de coral, para os Siphonophores coloniais complexos, tais como o Português Man-O-War, a regeneração é muitas vezes um modo de reprodução, além de um mecanismo de reparar ou reformar partes do corpo danificadas ou perdidas resultantes de lesões e predação. Se as diversas espécies de Cnidaria utilizar mecanismos semelhantes ou diferentes para a regeneração é uma questão fundamentalmente interessante 4-6.
Nós, e outros têm vindo a desenvolver o anthozoan, Nematostella vectensis como um modelo para a regeneração 7-17. Recentemente, desenvolveu um sistema de estadiamento para descrever a regeneração de um órgão inteiro a partir de um pedaço morfologicamente uniforme de tecido cortada a partir das aboral final do pólipo 10. Enquanto pólipos Nematostella pode regenerar quando cortada em qualquer nível, nós escolhemos para cortar adultos em uma posição aboral na região mais morfologicamente simples, o physa, em parte porque este é perto do plano normal da fissão assexual natural, 18, e também porque licenças de observação e análise molecular de como um corpo inteiro é remontado a partir dos componentes morfológicos mais simples.
A encenação Sistema Nematostella Regeneração (ENSR) fornece um conjunto relativamente simples de pontos de referência morfológicas que poderiam ser usados para marcar o progresso de qualquer aspecto da regeneração por um physa amputada, em condições de cultura normais ou experimentalmente perturbado situações como pequenos tratamentos molécula, a manipulação genética ou alteração ambiental. Como antecipado, a NRSS está sendo adotado como um andaime morfológico em que os eventos celulares e moleculares de regeneração pode ser referenciado10.
Finalmente o nosso método de corte produz uma Gaping buracos várias ordens de magnitude maior do que a punção ponto pinos usado em um estudo recente 17, mas ambas as feridas cicatrizam em torno de 6 horas. Documentar as fases visualmente distintas de prender e de encerramento de feridas deve sugerir abordagens experimentais para explicar a aparente independência do tamanho de uma ferida e o tempo que leva para a fechar. Assim, uma compreensão visual mais profunda do processo de amputação aboral, fornecida por este protocolo, irá auxiliar investigações ulteriores sobre esta sistema de regeneração de modelo e ampliar a aplicação deste sistema de estadiamento usando Nematostella vectensis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Condicionado dos Animais para temperatura, Nutrição e ciclo claro / escuro
- Obter adultos Nematostella vectensis de um dos numerosos laboratórios Nematostella em todo o mundo, ou um fornecedor sem fins lucrativos (Tabela 1)
- Manter Nematostella a uma temperatura constante (tipicamente entre 18 e 21 ° C) no escuro, em "1 / 3x" mar artificial água (ASW) a uma salinidade de 12 partes por mil (ppt). Manter culturas simples de soda-cal placas de cultura de vidro, tipicamente 250 mL ou 1,5 L de capacidade 11.
Nota: Estas condições de cultura simples são comumente usado entre os laboratórios que estudam Nematostella, mas cuidado cultura também pode ser automatizado 19. - Alimente Nematostella Artemia recém nascidos náuplios 2 - 4x por semana. Escotilha Artemia cistos em força total (36 ppt) ou 1 / 3x ASW a 30 ° C, em um prato de vidro retangular raso 20 ou emqualquer um de uma série de pequena escala, incubadoras artémia comerciais ou caseiros. Se uma incubadora não está disponível, camarão eclodem na RT, mas fazê-lo de forma mais lenta.
Nota: Isso muitas vezes requer mais de 24 h para a conclusão. - Substituir a água cultura anêmona, pelo menos uma vez por semana. Para uma melhor saúde do adulto, completamente limpa (sem sabão) a cultura tigelas, uma vez por semana de secreções mucosas acumuladas, que o revestimento da bacia e pode armadilha restos de comida e resíduos, e enredar os animais.
2. Seleção e relaxamento dos Animais Nutricionalmente condicionado
- Seleccione pólipos pareados por tamanho de aproximadamente o mesmo comprimento (3 - 5 cm, quando naturalmente relaxado) e coloque-os em uma tigela separada da colônia durante três dias antes da amputação.
Nota: O número de animais seleccionados para o corte vai ser determinada pela experiência sendo realizada, é claro, mas, em geral, nós recomendamos pelo menos cinco animais por ponto de amostragem com seis repetições. Assim,Numa experiência típica de um mínimo de 30 animais seria pré-seleccionado. Em geral, é sábio para selecionar mais do que o número mínimo (30), uma vez que são amputações irregular (veja abaixo) podem posteriormente afetar pontuação. - Remover o prato de animais seleccionados a partir do incubador em luz ambiente, pelo menos, uma hora antes da amputação.
Nota: A exposição à luz ambiente e vibrações de manipulação provavelmente fará com que os animais a se contrair, então eles precisam de ser adaptados ou "relaxado" por incubação na bancada do laboratório. Os animais irão tornar-se refractário ao toque e a exposição à luz e em que ponto pode ser movido por pipetagem suave. - Opcional: Anestesiar os animais através da adição de 7,5% de MgCl 2 (em 1 / 3x ASW). Delicadamente adicionar a solução de MgCl2 para a tigela com um padrão de plástico de 5 mL pipeta.
Nota: Embora os animais acabará por se tornar habituados à luz e à manipulação física, pode ser vantajoso para anestesiar animais para manter ou "consertar" tele relaxou estado depois que eles se tornaram 16,21,22 alongado. - Utilizar um grande furo (> 0,5 cm) de pipeta de plástico para transferir (em 1 / 3x ASW) cinco animais da piscina para ser amputado, no fundo de uma placa de corte de vidro estéril de 100 mm de diâmetro contendo 12 ppt ASW. Coloque o prato no palco de um microscópio estereoscópico com ampliação variável entre 10 - 40X.
Nota: Se os animais não foram anestesiadas e relaxado para o corte, eles ainda podem responder ao toque e iluminação estereoscópio e, portanto, pode precisar de alguns minutos para se tornar relaxado novamente.
3. A amputação
- Usando um bisturi estéril, amputa o physa aboral de cada pólipo, com o objetivo de se obter uma secção da physa que é aproximadamente do mesmo comprimento como é largo e não contendo mesentério.
Nota: O site corte ideal é apenas aboral à rescisão do mesentério. No plano de corte existe uma transição de mesentério adequada para diluir lines correspondente a cada inserção do mesentério (ver Figura 1, as setas). Ausência de mesentério é crítica porque produz muco que podem facilitar 'ligar' o buraco 17,30.- Colocar a lâmina de bisturi em contacto com o animal no local desejado de amputação. Fazer isso sem ajuda (mão livre), ou agarrando suavemente o corpo do animal com um # 5 fórceps (estilo Dumont ou similar).
- Cortar o tecido, aproveitando a lâmina curva do bisturi em um movimento de "balanço" em todo o corpo.
Nota: O tecido deve cortar limpa quanto o bisturi é abalada e libertar a seção desejada da physa do doador. No entanto, se um pequeno pedaço de tecido ainda liga o corpo e o physa, cortá-lo com o bisturi. Não tente separar as peças conectadas puxando, pois isso pode danificar o physa.
- Remover cada pólipo amputada 'doador' do prato e devolvê-lo a um sepabowl taxa rotulados 'amputados comuns »; datar a tigela e devolvê-lo à cultura estoque.
Nota: pólipos amputados irá curar a ferida aboral dentro de um dia e em seguida, podem ser alimentados normalmente. Eles vão regenerar uma physa aparência normal dentro de duas semanas em que ponto o physa pode ser amputados novamente se desejar. - Lavar o physa excisado que permanecem no prato de corte de 12 ppt ASW, em seguida, transferir cada physa a um poço separado estéril numa placa de cultura de células multi-poços que já tem 10 mL de 12 ppt ASW em cada poço.
Nota: Este exemplo usa uma placa de seis, com cada poço de detenção de 10 ml de água do mar e cinco physa excisada. Na água do mar em geral devem cobrir o physa suficiente para evitar a exposição ao ar devido ao movimento na manipulação e evaporação potencial. A placa de poços ou deve ter uma tampa. - Repita os passos de 3,1-3,3 para recolher, pelo menos, 5 physa em cada poço reservado para cada tratamento experimental.
- Incubar a physa a uma temperatura que vai provide a melhor taxa de regeneração para os interrogatórios experimentais planejadas. Colocar a placa contendo o physa em uma incubadora de temperatura regulada, a uma temperatura fixa, determinada pela desejada taxa de regeneração.
Nota: O physa irá regenerar tecidos em falta e formar um pólipo completa quando incubados a temperaturas entre 15 e 27 ° C. A taxa de regeneração é dependente da temperatura, excepto para as primeiras duas fases. O dia médio para atingir Fase 4 para todas as temperaturas é 7 d após o corte e isso também coincide com a regeneração a 21 ° C. A 27 ° C, Fase 4 é atingido cerca de 3 dias mais cedo e a 15 ° C, Fase 4 é retardada por cerca de 3 d em comparação com a regeneração a 21 ° C (ver também referência 10).
4. Avaliação de regeneração com o sistema de estadiamento Nematostella Regeneração (ENSR)
- Marcar o physa usando um microscópio estéreo de composto com magnific variávelção (10 - 80X). Marcar o physa Nematostella recém-cortada como estágio 0 e continuar marcando, ao mesmo tempo, cada amputação dia pós (dpa) usando a ENSR 10.
Nota: Para os critérios de paragem-chave e detalhes, consulte Referência 10.- Pontuação physa como Estágio 0 (ferida aberta) se um physa recém-cortada aparece como uma massa em forma Cup- semelhante a um balão flácido, com um local de ferida aberta é provável visível.
Nota: As bordas da ferida também pode ficar juntos desde o início, mas o tecido ainda vai ser recolhido e falta de rigidez. As bordas da ferida aberta pode ser observado a sofrer contracção radial, a ferida cicatriza. - Pontuação physa como Fase 1 (ferida fechada) se a ferida da amputação parece fechada.
Nota: local da ferida irá corresponder ao futuro pólo oral. A superfície exterior em torno do futuro pólo oral podem começar a exibir arcos distintos correspondentes aos subjacentes endodérmicas radialmente simétrica inserções mesentéricos. - ph pontuaçãoysa como Fase 2 (radial dos arcos) se a superfície do pólo oral parece inflado, revelando oito arcos dispostos em relevo um padrão radialmente simétrico e separados por ranhuras. Observar pequenas bolhas, hemisféricas no vértice dos arcos. Eles serão tão alto quanto ampla transitória, provável, e, inicialmente composta por uma camada de células ectodérmica única.
Nota: Em alguns casos bolhas duas camadas pode estabilizar. Nota: Neste ou mais tarde encena uma camada de muco podem aparecer para encapsular o physa (Figura 2) em uma "bainha" membranoso. Este material de encapsulação deve ser removido para facilitar a pontuação. - Pontuação physa como Stage 3 (Tentáculo), se as papilas dos tentáculos contendo endoderme e ectodérmicas camadas de tecido são formadas de forma estável no final oral de pelo menos alguns arcos radiais.
Nota: Os tentáculos são mais longos do que eles são largas e são minimamente móveis. O physa vai mostram aumento, mas a inflação variável para que rudimentos mesentério pode tornar-se visvel que se prolonga a partir da inserção do mesentério na cavidade do corpo (coelenteron). - Pontuação physa como Fase 4 (mesentérios linear) se o physa contém oito distintos, mesentérios visíveis que se estendem para o coelenteron de inserções na parede do corpo, com comprimentos orais-aboral que são mais do que duas vezes a sua largura radial medida a partir de onde eles parecem ligar para a faringe, na sua extremidade aboral (enterostome).
Nota: Quatro ou menos mesentérios têm bordas livres internos "pregas". A faringe é visível. Mais de oito tentáculos são visíveis, móveis e às vezes eles contrair no corpo. - Pontuação physa como Stage 5 (predominantemente plissadas mesentérios) se o physa tem mais de quatro mesentérios com pregas, eo pregas é mais completo e sinuosa do que no estágio 4. O animal tem uma aparência adulta quase "normal", mas não há nenhum visível células gonadais.
- Pontuação physa como Estágio 0 (ferida aberta) se um physa recém-cortada aparece como uma massa em forma Cup- semelhante a um balão flácido, com um local de ferida aberta é provável visível.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A progressão de eventos morfológicas durante a regeneração em physa cortada é mostrado na Figura 1A, que inclui vistas representativas de physa em cada fase NRSS. O site típico physa corte é indicado no adulto (setas). As fotografias na Figura 1A mostra a regeneração progressiva das estruturas orais e corporais a partir physa recém-cortada através pólipo completamente formado. Figura 1B, C mostram a disposição dos septos internos, os mesentérios, no estágio 4 e Estágio 5, respectivamente. Note-se que alguns mesentérios no estágio 4 faltará "pregas", mas para se qualificar como um estágio 5 a maioria deve ter desenvolvido pregas. A Figura 1D mostra um physa envolvido por uma membrana de mucosas que podem ser removidos com uma pinça (Figura 1E). Embora geralmente não é prejudicial à regeneração (a menos que injustificadamente retém o animal), a membrana pode impedir de marcar o physa e fazering manipulações experimentais, como a microscopia, a fixação da amostra ou da colheita para análise molecular / bioquímica. Isto é melhor removido após a Fase 1, ou mais tarde, se reformas.
A Figura 2 mostra como o sistema de paragem pode ser usado para marcar os resultados de uma experiência para avaliar os efeitos de inibição da autofagia. Physa foram cortadas e tratadas com cloroquina em 10, 50 e 100 uM, ou physa foram não tratadas (controles). Cloroquina inibe funções lisossomais, que são necessários para a autofagia. Os critérios NRSS foram usadas para marcar o physa ao longo do curso de regeneração e os resultados foram representados graficamente na Figura 2E. Fotografias de controlo representativo (Figura 2A) e cloroquina tratada physa (Figura 2 B - D) foram feitas quando os controles atingiram a fase 5. Cloroquina animais tratados não progrediu além do estágio 4, e eles tipicamente exibida regenera mesentério incompletação (plissagem mais faltava), tamanho tentáculo curta, e em alguns casos, o comprimento do corpo curto.
Figura 1. Características de Regeneração. (A) Exemplos de physa regenerar estruturas orais e corporais encenado de acordo com a ENSR. Painel intitulado Adulto mostra características de um animal adulto com tentáculos (t) faringe (ph), mesentério (m) e inserções mesentério (mi). setas brancas mostram a região onde plissado de mesentérios transição para a inserção mesentério, uma crista de endoderme estendendo-se até o término aboral. Esta região constitui o physa. Setas amarelas mostram local physa bisection ideal. Painel de 0 mostra cinco minutos physa após bisection e Painel de 0 'é uma visão ampliada de um um daqueles physa, com ferida aberta no centro, definindo Stage 0 doENSR. Painel 1 mostra uma physa com a ferida fechada agora, definindo Stage 1. Painel 2 mostra physa com arcos radiais levantadas em torno do pólo por via oral, com tecidos inflados abaixo, correspondente ao estágio 2 (painéis 0-2 são vistas sobre o fim via oral). Painel 3 apresenta papilas tentáculo emergentes no pólo oral (virado para a direita) do physa alongada e inflar, agora em estágio 3. Nota elementos mesentério rudimentar são visíveis e da faringe está se formando na área escura no final oral. Painel 4 mostra o aparecimento dos verdadeiros tentáculos, bem como "bolhas" transientes no pólo oral, que definem Fase 4. mesentérios lineares são visíveis na physa inflado. A grande massa redonda visível no interior do pólipo é de origem desconhecida e será expulso através da boca. Painel 5 mostra regeneração quase completa caracterizada por mais de quatro mesentérios plissadas, um pH totalmente formadoarynx e oito ou mais tentáculos, que a define como Fase 5. (B, C) vista aboral de physa indivíduo ilustrar o arranjo biradial e morfologia do mesentério. Neste ponto de vista, mesentérios plissados parecem ter uma protuberância de meio caminho de tecido (seta verde). A Fase 4 physa tem quatro ou menos mesentérios plissadas, e uma physa etapa 5 tem mais de quatro (C). Mesentérios com ou sem pregas são indicados por pontas de seta verde ou amarelo, respectivamente. Seta preta em (C) aponta para um mesentério plissado que se estendeu radialmente. (D, E) A remoção de um revestimento mucoso do physa está representado. As setas brancas indicam uma bainha de muco em torno do physa (D) que deve ser removido como em (E) antes de marcar regeneração. Às vezes o tecido residual amarelo (setas) pode ser preso no interior da bainha, e isto deve também ser removida. Asterisco indica pólos orais, onde marcaEd. Barras de tamanho vermelhas são 0,5 mm de todos os painéis, com exceção A5 (1,0 mm). Painéis B e C desta Figura foram modificados e reimpresso com permissão de Referência 10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Efeito da cloroquina sobre a regeneração. Para demonstrar a aplicação do NRSS, testámos os efeitos de uma cloroquina, um inibidor de autofagia. Physa foram amputadas e imediatamente colocadas em 1 / 3x ASW contendo 0,1% de DMSO (controlo) ou cloroquina a 10, 50, 100 uM. Physa foram marcados em intervalos de 24 h usando a ENSR. (A) imagens de endpoint representativa colhida de controles quando eles atingiram a fase 5.
Figura 3. Resumo dasprincipais características dos estágios ENSR. Este diagrama mostra as alterações morfológicas chave que definem cada fase da ENSR. Direção de movimentos são indicadas por setas vermelhas e recursos por setas verdes. Fase 0 descreve ferida aberta apenas após o corte (A), e T). As bordas da ferida sofrer contracção radial de fecho na direcção do centro (B). Fase 1 caracteriza-se por completo o fecho do ferimento (C) e elevação dos arcos entre as cristas orais de revestimento (D); o centro da superfície bucal (ponta de seta) é deprimido. Fase 2 tem um arqueamento pronunciada da superfície bucal (ponta de seta, E); o physa começa a se alongar e se tornar estreito (F) com botões tentáculo e bolhas visíveis no ápice dos arcos (setas). Fase 3 tem botões estáveis tentáculo (ponta de seta, G) e da faringe regeneração pode ser visto como uma densidade no pólo por via oral (massa de laranja, ponta de seta em H (I) que deve ser pelo menos duas vezes o tempo que eles são altos na junção da faringe (I '). Quatro ou menos mesentérios pode ser plissado na sua borda interna - o filamento do mesentério (J, J '). Fase 5 é caracterizada por mais do que quatro pregas mesentério (k), que pode ser melhor avaliadas através da visualização da extremidade aboral (K '). Re-impressão com a permissão de 10. Referência Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uso de Nematostella como um modelo de cura de feridas e a regeneração está a tornar-se cada vez mais popular. Assim, é importante ser capaz de visualizar os padrões morfológicos de um protocolo em particular antes de análises celulares e moleculares eficazes podem ser atribuídas e comparados. Nematostella têm um elevado grau de "flexibilidade" regenerativa, ser capaz de mudar a quase qualquer estrutura que falta amputado em qualquer local, em fases pós-Planula de vida. Assim, vários investigadores examinaram a regeneração resultante de amputação ou ferir em diferentes regiões do pólipos, em diferentes idades e tamanhos 7-18.
O sistema de estadiamento descrito aqui segue a transformação de uma seção morfologicamente uniforme do physa, amputada a partir do final aboral de um adulto, a um pólipo juvenil anatomicamente completa faltando apenas tecido reprodutivo (ainda não determinada quando estes jovens regenerados tornarem sexualmente mtura). Esta abordagem examina a regeneração de um simples rudimento de tecido para um de perto complexidade máxima. Incluindo cinco physa como um tamanho mínimo de grupo é recomendado para normalizar para o potencial variabilidade e sobrevivência individual. Naturalmente, este número pode ser ajustado de acordo com os objectivos experimentais particulares, mas o protocolo permite NRSS 2 ml de meio por physa para negar um «efeito de volume 'potencial semelhante ao que foi reportado para afectar a regeneração em hidra 23.
Outras abordagens para estudar a regeneração Nematostella usaram adultos bissectados meio do corpo ou no fim por via oral, ou juvenis fase pólipos 4-tentáculo bissectados meio do corpo 7,11-18. Dois estudos examinaram a regeneração em physa libertados pela fissão naturais 16,18 e abordagens utilizando physa amputada surgiram recentemente com a ENSR 8,9. Cada uma dessas abordagens variadas tem seus próprios méritos e pode tratar de questões únicas sobre regenerative processos que ocorrem sob diferentes regimes de amputação ou ferir, e entre os animais de forma diferente idosos. O protocolo ENSR de amputação physa e pontuação, mostrado no presente estudo, gera um conjunto relativamente uniforme de physa para estudo sistemático e evita variação no tamanho physa, composição do tecido, e subsequente progressão da regeneração observada com transversal naturais de fissão 18,24. Embora physa amputação corresponde tanto para o modo natural de reprodução assexuada em Nematostella, diferenças moleculares têm sido observadas entre a regeneração resultante da cisão natural e amputação no meio-corpo ou no physa 16,18,24. Se physa produzido pelo método de amputação descrito aqui ou programa de fissão naturais tais diferenças ainda não foi determinado.
Existem algumas questões que são fundamentais para o sucesso com a amputação criação e técnicas de pontuação descritos aqui. Pólipos selecionados para shou amputaçãold ser mantido à mesma temperatura, ajustados para o tamanho physa, história nutricional e, se possível, a idade (embora este último não tenha sido sistematicamente testados para determinar se há um efeito da idade na variação na progressão da fase). A obtenção de uma ferida aberta com um bisturi estéril afiada tendo uma lâmina curva é importante para observações morfológicas de cicatrização de feridas entre Fase 0 e Fase 1. Quando o physa é inflado ea lâmina curva do bisturi é balançada sobre o tecido adulto, que é amputado em um movimento e pode ser rapidamente transferido para o tratamento bem prato de corte. Amputações que incluem mesentério ou que são o resultado de uma extensiva manipulação física deve ser descartado.
Prática de encenar physa não tratada para ter uma noção da variação individual na população a ser testada. Variação entre physa indivíduo é menos para os primeiros estágios. Por exemplo, todos physa estão em estágio 0 a 0 dpa. Da mesma forma, todos physa chegar Stage1 em sincronia em 1 dpa. A aparência da Fase 2 pode ser mais difícil para o observador para discernir porque 'inflação' é uma condição relativa que é obtida, no entanto, por duas DPA com pouca variação. O aparecimento da verdadeira progressão tentáculos marcas à Fase 3. Os tentáculos regeneração pode ser obscurecido pelo aparecimento de um "casulo" membranoso que impede a visualização do botão tentáculo abaixo. Se o revestimento membranoso não tenha sido previamente removido, ele deve ser feito de modo agora. A remoção da membrana com pinça de ponta fina irá liberar o physa regeneração. A distinção entre a Fase 4 e 5 é o número de pregas mesentério. Stage 4 tem quatro ou menos mesentérios plissadas e Stage 5 tem cinco a oito mesentérios plissadas. Enquanto pregas pode ser observada em uma vista lateral, o número exato de mesentérios plissadas é melhor observado com uma vista aboral.
Um desafio em estudar adulto Nematostella regeneração de um physa rudimento, e de fato com os tecidos cortados a partir de outros sites de amputação, é a clareza variada dos tecidos vivos. A lâmpada do physa é relativamente clara no adulto intacto, mas torna-se bastante opaca devido à contração do tecido após a amputação. Clareza volta gradualmente (Fase 2) uma vez que o fechamento da ferida (Fase 1) e o animal começa a encher, mas mesmo assim, a região em torno do local da ferida onde os tecidos e as estruturas estão regenerar activamente permanece um tanto obscurecidos por tecidos densos (especialmente Fase 3). Aumento da inflação geralmente acompanha Stage 4 e 5. Fixação seguido de clarificação óptico quase certamente irá resolver o que está acontecendo no final oral, mas mais informativa pode ser ao vivo repórteres transgênicas, de tecidos específicos que podem ser monitorados para a fluorescência e mais facilmente visualizadas 15, 25-30.
Um physa amputada, obviamente, não pode alimentar uma vez que carece tentáculos, boca e mesentério (que abrigam glândulas digestivas), assim requianel de regeneração de estruturas do corpo que faltam a ser realizado através da mobilização de reservas de nutrientes a partir de fontes não alimentares. O physa pode potencialmente conseguir isso é através autofagia, em que citoplasma, organelos e outros componentes celulares são engolidos intracelularmente e processado por um mecanismo dependente de lisossoma para produzir energia e compostos para os processos anabólicos 31-33. Nós achamos que o tratamento physa com o inibidor lisossoma, cloroquina, provoca a regeneração anormal de mesentério e tentáculos, e morfologia geral do corpo, indicando que a autofagia é necessária para a regeneração normais das estruturas orais e corporais. Autofagia regula-tronco funções celulares 34-36, e desempenha um papel essencial na regeneração em Hydra, planaria e peixe-zebra 37-41. Uma análise mais aprofundada é necessária para entender como autofagia influencia Nematostella regeneração nos níveis celulares e moleculares, mas a nossa primeira experiência passe mostra a utilidade de usar a NRSS como método de triagem rápida para pequenas moléculas que podem afetar a regeneração.
Os processos genéticos, moleculares e celulares que regulam a regeneração em Nematostella são apenas em um estágio rudimentar de entendimento, mas este modelo emergente para a regeneração tem um repertório crescente de ferramentas para análise de expressão genômica e genética. Com seu genoma anotados, uma infinidade de marcadores genéticos regionais e tecido específico e métodos robustos para transgenia, mutagênese, histologia e microscopia, Nematostella promete revelar os mecanismos que regem anthozoan regeneração cnidários e descobrir se os seus processos regenerativos são semelhantes ou único entre os cnidários e metazoários em geral.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma Stem Cell New York Science (NYSTEM C028107) Grant para GHT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
| Glass Culture Dish, 250 mL | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 mL |
| Glass Culture Dish, 1,500 mL | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 mL |
| Polyethylene transfer pipette, 5 mL | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
| Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
| #5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
| Pyrex Petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass Petri plates |
| Sterile 6-well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 12-well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 24-well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
| Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
| pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
| artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
| Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
| Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
| Beaker, Graduated, 4,000 mL | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
| Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 - 40X magnification |
References
- Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , The Boxwood Press. (1986).
- Trembley, A. Mémoires pour servir à l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, à bras en forme de cornes. , Jean & Herman Verbeek. (1744).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles? Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration? Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).
- Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).
- Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).
- Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).
- Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).
- Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).
- Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
- Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).
- Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).
- Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).
- DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
- Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
- Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).
- Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).
- Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
- Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).
- Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).
- Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
- Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
- Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).
- Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139 (2), 347-357 (2012).
- Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).
- DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
- Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).
- Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).
- Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).
- Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
- Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).
- Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).
- Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
- Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).
