Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

التجريبية ومواد وتقنيات حسابية إلقاء الضوء على الآليات "مبيدات الفطريات وسط النحل الصحية"

Published: October 9, 2017 doi: 10.3791/54631
Automatic Translation
1,2, 2, 3,4, 5, 1,3, 6,7,8
1Vegetable Crop Research Unit, USDA-ARS, 2Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics, Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution, University of Wisconsin-Madison

Summary

اتحادات الميكروبية داخل خلايا النحل تلعثم إثراء والحفاظ على حبوب اللقاح ليرقات النحل. باستخدام تسلسل الجيل القادم، جنبا إلى جنب مع المختبرات والتجارب الميدانية، وهذه المخطوطة يصف البروتوكولات المستخدمة لاختبار الفرضية القائلة بأن بقايا مبيد للفطريات تغير ميكروبيومي حبوب اللقاح، ومستعمرة التركيبة السكانية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى مستعمرة الخسارة.

Abstract

غالباً ما تستخدم مزارعي بخاخ مبيد للفطريات أثناء لوم لحماية المحاصيل ضد المرض الذي يعرض النحل لبقايا مبيد للفطريات. على الرغم من اعتبار "النحل الآمنة"، وهناك أدلة متزايدة على أن بقايا مبيد للفطريات في حبوب اللقاح ترتبط بانخفاض النحل (بالنسبة لأنواع العسل وتلعثم نحلة). الآليات التي ما زال مجهولاً نسبيا، تكهن الباحثون أن تشارك متنافسة الميكروبات والنحل. الجراثيم تلعب دوراً محوريا في الحفاظ على و/أو تجهيز حبوب اللقاح، الذي يخدم كالتغذية للنحل اليرقات. بتغيير المجتمع الميكروبية، فمن المحتمل أن مبيدات الفطريات تعطيل هذه الخدمات بوساطة ميكروب، ومما يعرض للخطر صحة النحل. ويصف هذه المخطوطة البروتوكولات المستخدمة للتحقيق في الآليات غير المباشرة التي قد تسبب الفطريات انخفاض مستعمرة. تجارب قفص تعريض النحل للمعالجة بمبيد للفطريات الزهور قدمت بالفعل أول دليل على أن الفطريات تسبب خسائر مستعمرة عميقة في أصلي تلعثم نحلة (impatiens بومبوس). استخدام جرعات الميدانية ذات الصلة من مبيدات الفطريات، وضعت سلسلة من التجارب لتقديم وصف أكثر دقة لديناميات المجتمع الميكروبي المعرضة لمبيد للفطريات حبوب اللقاح. بتسلسل الجيل القادم وتحليل مواد التحقيق في التحولات في التكوين الهيكلي لتجمعات الفطرية والبكتيرية داخل ميكروبيومي حبوب اللقاح. تجارب البلدان المتقدمة النمو هنا قد صممت لتوفير فهم ميكانيكية لكيفية تأثير مبيدات الفطريات ميكروبيومي حبوب اللقاح-الأحكام. وفي نهاية المطاف، هذه النتائج ينبغي تسليط الضوء على المسار غير المباشر من خلالها مبيدات الفطريات قد تسبب انخفاض مستعمرة.

Introduction

إدارتها وأنواع النحل البرية تعاني من انخفاضات على نطاق واسع، مع آثار كبيرة على النظم الطبيعية والزراعية على حد سواء1. وعلى الرغم من الجهود المتضافرة لفهم أسباب هذه المشكلة، العوامل المحركة لعسل النحل الانخفاضات لا تزال غير مفهومة جيدا2،،من34. لأنواع معينة من النحل البرية، الأصلية، أصبحت الحالة الأليمة5،6. إذا كان لا يمكن أن يستمر السكان النحل عندما أنها تتقاطع مع الزراعة الصناعية وسكانها سوف تستمر في الانخفاض، وسوف تحمل المحاصيل التي تتطلب الملقحات (35 في المائة من الإنتاج في العالم7) خفض المحاصيل.

وفي حين قد تورط العديد من العوامل المحتملة كمبيد آفات التعرض، والمرض، والموئل خسارة1،4،،من89،10 في عسل النحل الانخفاض، يعرف إلا القليل نسبيا عن أثر هذه الضغوطات التفاعلية على صحة النحل الأصلية، داخل أو بالقرب من النظم الزراعية. الكثير من الجهود البحثية الحالية مواصلة التركيز على المبيدات الحشرية، (مثلاً، neonicotinoids11،12)، على الرغم من أن البحوث السابقة تشير إلى أن مبيدات الفطريات قد تلعب أيضا دوراً في انخفاض النحل بعرقلة تشكيل الذاكرة، الاستقبال حاسة الشم13وعش الاعتراف14، نشاط إنزيم والوظائف الأيضية15،،من1617. على الصعيد العالمي، مبيدات الفطريات الاستمرار في تطبيق للمحاصيل المزهرة خلال لوم. وقد وثقت الدراسات الأخيرة أن النحل عادة إعادة بقايا مبيد للفطريات إلى خلية18، في الواقع، وقد أظهرت الدراسات أن نسبة كبيرة من خلايا تم اختبارها الواردة مبيد المخلفات19،20. مزيد من العمل قد كشفت عن أن بقايا مبيد للفطريات يترافق مع معدلات عالية من عسل النحل وفيات اليرقات21،،من2223 ، ووجود "حبوب اللقاح مدفون" داخل المستعمرات، التي على الرغم من أن غير سامة، تخلو من النشاط الميكروبي وهو الخطر غذائياً24. على الرغم من حقيقة أن مبيدات الفطريات طالما اعتبرت "النحل الآمنة"، هناك الآن أدلة على أن التعرض لمبيد للفطريات وحدها يمكن أن تسبب الخسائر مستعمرة شديدة في أنواع نحلة تلعثم أصلية، impatiens بومبوس25.

لإقامة علاقة سببية بين التعرض لمبيد للفطريات ومستعمرة وفيات، أسلوب عمل هذه المواد الكيميائية تحتاج إلى يتحدد. كما تدل على ذلك في26من التربة والرواسب2728من البيئات المائية، باستهداف الفطريات، مبيدات الفطريات الأكثر احتمالاً يغير وفرة الفطرية وتحول التنوع داخل حبوب اللقاح-الأحكام، وبالتالي الاحتجاج مجتمع رئيسية التي قد بقوة لصالح البكتيريا. دون الفطرية المنافسين أو الخصوم، يمكن أن تنتشر بعض البكتيريا المسببة للأمراض دون رادع نسبيا، تيسير تلف حبوب اللقاح-الأحكام. الماضي البحوث قد أثبتت أن الكائنات الحية الدقيقة، وبخاصة الخمائر والفطريات الخيطية، بمثابة سيمبيونتس الغذائية للنحل29،،من3031، حماية ضد الطفيليات والعوامل الممرضة32 ،33، وتقدم المحافظة على المدى الطويل من مخازن حبوب اللقاح. مبيدات الفطريات، لذلك، قد غير مباشر يضر بالنحل غير ناضجة بتعطيل المجتمع الميكروبية اللازمة لتوفير هذه الخدمات و/أو بزيادة التعرض ل مسببات الأمراض والطفيليات الانتهازية12. ومع تزايد الطلب على إنتاج الأغذية، المحاصيل في جميع أنحاء العالم هي يجري رش كل سنة مع مبيدات الفطريات خلال لوم، مؤكدا الحاجة إلى فهم حجم هذه الآثار الناجمة عن مبيد للفطريات.

حتى الآن، الثغرات المعرفية الأولية المتعلقة بالنحل الأصلية الميكروبية علم البيئة يمكن أن يمثله في المسائل التالية: وإلى أي مدى يتغير فطريات المجتمع الميكروبي داخل النحل حبوب اللقاح-الأحكام؟ ما هي آثار المصب تستهلك حبوب اللقاح مع مجتمع الميكروبية عميقة غيرت؟ تمشيا مع هذه الأسئلة وثيقة الصلة إيكولوجيا، وضعت تجارب مع الأهداف الرئيسية لكشف 1) أن بقايا مبيد للفطريات وحدها يمكن أن يسبب انخفاض حاد مستعمرة في أنواع أصلية النحل؛ 2) الدرجة التي يتم تغيير المجتمعات الميكروبية في حبوب اللقاح-الأحكام بمبيدات الفطريات، و 3) كيف تتأثر صحة النحل مجتمع الميكروبية غيرت شديدة. وقد حددت أهداف تجريبية لمعالجة المسائل المذكورة أعلاه باستخدام مزيج من التجارب المختبرية والميدانية. استخدام الجينومية الدولة للفنون والتقنيات الجزيئية جنبا إلى جنب مع الأساليب التقليدية للمراقبة الميدانية، يهدف هذا البحث إلى قطعة معا من الآثار المحتملة للفطريات على صحة النحل.

الهدف الأول من هذه الدراسة إثبات أن التعرض مبيد للفطريات وحدها يمكن أن تسبب الخسائر مستعمرة كبيرة بين أنواع النحل الأصلي. واستخدمت دراسة شملت أقفاص ميدانية كبيرة للتحقيق في آثار التعرض لمبيد للفطريات على نمو مستعمرة impatiens بومبوس، النحل أصلية في كل مكان، ووفرة في الولايات المتحدة (الشكل 1و الشكل 2، الشكل 3). كان الافتراض بأن المعالجة بمبيد للفطريات خلايا سيقدم انخفاض اللياقة البدنية، والديموغرافيا شاذة بالمقارنة مع خلايا غير مكشوف. البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التجربة تؤيد هذه الفرضية، مما يدل على أن بقايا مبيد للفطريات داخل حبوب اللقاح يمكن أن تكون السبب الوحيد للخسائر مستعمرة عميقة في أنواع أصلية تلعثم نحلة25. والهدف الثاني من هذه الدراسة هو التحقيق في استجابة ميكروبيومي حبوب اللقاح للتعرض لمبيد للفطريات. هو الافتراض بأن تكوين المجتمع للميكروبات داخل حبوب اللقاح-أحكام يتعرضون لمبيدات الفطريات يختلف عن حبوب اللقاح غير المعالجة. البكتيريا و/أو أنواع فطرية مهيمنة واحدة في حين يتوقع أن تنخفض إلى حد كبير وفرة الفطرية والتنوع، سوف يرجح أن تنمو دون رادع في حالة عدم وجود الفطريات الأخرى المتنافسة. من خلال سلسلة من المحاكمات في فيفو ، سيتم تحليل هذه التحولات في تركيبة المجتمع الميكروبية باستخدام ميتاجينوميكس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-دراسة "تأثير التعرض مبيد للفطريات" في "تلعثم نحلة مستعمرة نجاح استخدام قفص التجارب الميدانية"

  1. مجموعة حتى عشرة مش أقفاص في حقل مزروع بالشوفان. حفر خندق حول كل القفص، وحفر كافة الحواف الأربع من القفص مش في الأرض لضمان أن لا يمكن الهروب من النحل. الأسهم في الأقفاص مع وعاء، النباتات المزهرة التي هي معروفة لتكون جذابة للنحل (مثل الحنطة السوداء، لسان الثور، أليس، والكون، وعباد الشمس) ( الشكل 2).
  2. الملحق في الأقفاص مع علبة واحدة من البرسيم بلوم (36 سم × 42 سم). كتلة الموارد الأزهار داخل أحد أركان القفص، تحتل مساحة حوالي 2.5 م × 1 م فيجيتاتي منطقة القفص المتبقية بالشوفان.
  3. عشوائياً تعيين تلعثم نحلة كل العمال التي تحتوي على المستعمرات وملكة واحدة، لعلاج (مبيد للفطريات الحاضر/غائبة، N = 5 مستعمرات كل معاملة، ومجموع 10 مستعمرات)، ثم وضعها داخل قفص حقل (N = 1/قفص) لمدة 29 يوما (23 حزيران/يونيه -21 تموز/يوليه عام 2014).
  4. توجيه مربعات مستعمرة أن المستعمرة ' الفتحات s تشير إلى الجنوب لتزويد النحل بأفضل الظروف الملاحية. دعم المستعمرات بقربه مياه السكر، توضع داخل مربعات خلية لتكملة توافر الرحيق.
    5. باستخدام يد عقد
  5. تطبيق المستندة إلى التالونيل فطريات على مستوى حقل ذات صلة (20 غرام/لتر) للنباتات المزهرة في أقفاص علاج فطريات خمسة، بخاخ مبيدات الآفات، مرتين خلال الدراسة (اليوم 0 و 13). معطف الزهور موحد أن لا سائل أخرى تلتزم بالأسطح الأزهار ( الشكل 3).
  6. في ختام الدراسة الميدانية القفص، إزالة المستعمرات impatiens باء من الأقفاص باليد، بارد في خلايا عن طريق وضع في الثلاجة-20 درجة مئوية عن 20 دقيقة
  7. إزالة النحل باستخدام الملقط العقيمة، وتسجيل عدد اليرقات، الخوادر، والإناث البالغات (أنا- ﻫ. العلافون)، والذكور البالغين. توازن التحليلي باستخدام تسجيل الوزن الجاف الملكة الأم واليرقات، الخوادر، والكبار من الإناث (أي العلافون)، والذكور البالغين-

2. دراسة "آثار التعرض مبيد للفطريات" في "المجتمعات الميكروبية" في حبوب اللقاح-أحكام "تلعثم نحلة أعشاش استخدام المختبر على أساس" التجارب في فيفو

  1. بولفيريزي تجارياً بشراء حبوب اللقاح إلى مسحوق ناعم باستخدام معيار طاحونة الكرة في المختبر. تعقيم مسحوق حبوب اللقاح التي نقع في الإيثانول 70%، مما يتيح لها تتبخر بين ليلة وضحاها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تحقق من العقم من حبوب اللقاح بطلاء ملغ ~0.5 على وسائط أجار الأغراض العامة-
    1. الجاف، إضافة حبوب اللقاح معقمة، باستخدام ماصات معقم، الجرعة الميدانية ذات الصلة لمبيد للفطريات: بروبيكونازولي في نسبة 14.3 في المائة؛ أزوكسيستروبين في 22.9 في المائة للعلاج (0.74 ميليلتر وميليلتر 0.65 على التوالي اليوم/خلية). خلط جيدا باستخدام العصي الخشبية معقمة.
  2. مكان 6 خلايا تجريبية (n = 3 للتحكم والعلاج) في benchtop مختبر نظيفة وصحية الحفاظ على درجة حرارة الغرفة. كل يوم تزن ز 4.27 من حبوب اللقاح 34 ، 35 مختلطة مع مبيدات الفطريات (للعلاج) أو الماء المعقم (لمراقبة) داخل غطاء محرك السيارة باستخدام تقنية معقمة القياسية.
    1. باستخدام مصيدة أبواب المقدمة من جانب صندوق من الورق المقوى مرفقا بها خلايا النحل، إدخال اللقاح داخل خلايا النحل. الملحق الخلايا مع محلول السكر تعقيم كل أسبوع. مواصلة تغذية النظام لمدة أربعة أسابيع-
  3. في ختام الدراسة المستندة إلى مختبر، بارد في الخلايا من وضع في الثلاجة-20 درجة مئوية ل 20 دقيقة كشط حبوب اللقاح-الأحكام الواردة ضمن الدوائر الحضنة باستخدام الملقط المعقم وملاعق ومكان في أنابيب التخزين العقيمة. مخزن في درجة عد جيم-80 وسجل وزن العمال والملكة الأم في بداية ونهاية التجربة (الخطوة 1.7).
  4. مجموعات "عزل الحمض النووي" من عينة توفير حبوب اللقاح باستخدام عزل الحمض النووي المتاحة تجارياً (انظر "جدول المواد" للحصول على التفاصيل).
    1. إضافة 0.25 g لتوفير اللقاح لاستخراج أنابيب، بإيجاز دوامة مزيج.
      2. جعل
    2. 200 مغ/مل الحل ليسوزيمي في المياه المقطرة، يكفي 50 ميليلتر/عينة. هزة بقوة لحل النموذج تماما.
      3. إضافة 50 ميليلتر من الحل lysozyme لأنابيب استخراج عينة في ذلك
    3. ، ومزيج جيد بعكس عدة مرات. احتضان الأنبوب لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية في حمام مائي. إذا شكلت متسرعا، الحل إلى 60 درجة مئوية حتى يذوب قبل استخدام الحرارة.
    4. ميليلتر 70 إضافة حل تحلل مائي لاستخراج أنابيب، تأمين أفقياً على لوح مسطح دوامة مع الشريط، وأنابيب دوامة لأدنى 10 أجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة-
    5. نقل المادة طافية إلى أنبوب جمع نظيفة 2 مل. إضافة 250 ميليلتر الحل ترسيب البروتين، ودوامه لإينكوباتي س. 5 في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق في حمام الثلج.
      ملاحظة: توقع بين ميليلتر 400 إلى 500 ميليلتر من المادة طافية. المادة طافية قد لا تزال تحتوي على بعض الجزيئات.
    6. الطرد المركزي هذه الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة في 10,000 س ز، ونقل تصل إلى 600 ميليلتر من المادة طافية إلى أنبوب جمع نظيفة 2 مل. إضافة 200 ميليلتر من مثبط مائي إزالة الحل، دوامة بإيجاز، واحتضان في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 أجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة في غ. س 10,000 نقل ما يصل إلى 750 ميليلتر من المادة طافية في أنبوب جمع نظيفة 2 مل.
      7. س.
    7. ميليلتر إضافة 1200 من حل ربط مائي للمادة طافية، ودوامه 5 تحميل ما يقرب من 675 ميليلتر من المادة طافية على تصفية تدور، وأجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. التدفق من خلال تجاهل.
      8. كرر
    8. 2.4.7-مرتين-
      ملاحظة: مجموع الأحمال ثلاثة لكل عينة معالجة مطلوبة.
    9. إضافة 500 ميليلتر الإيثانول، وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ق في غ. س 10,000 تجاهل التدفق من خلال، والطرد المركزي مرة أخرى في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة 10 آلاف × تصفية تدور مكان زاي في أنبوب جمع نظيفة 2 مل.
    10. إضافة 100 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت إلى مركز غشاء التصفية. أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ق في غ. س 10,000 تجاهل عامل التصفية تدور. مخزن جمع الحمض النووي بين-20 درجة مئوية و-80 درجة مئوية
  5. استخدام عزل الحمض النووي لتسلسلها.
    1. قوانتيفي، وتطبيع الحمض النووي المعزولة إلى 2 نانوغرام/ميليلتر بتحليل فلوروميتريك. ردود فعل
      1. تحضير في ثلاث نسخ لكل عينة تم استخراجها لمقارنة الكميات النسبية من 28S (المصنع)، تحليل لها (الفطرية)، ومكونات كل نموذج توفير حبوب اللقاح 36 (البكتيرية) 16S. تأكد من أن كل رد يحتوي على 10 نانوغرام من مجموع الحمض النووي و x 2 من سيانيني غير متناظرة صبغ على أساس مزيج الرئيسي ميليلتر 2.5 كل من الإشعال إلى الأمام وعكس أزواج 28KJ/28 باء 37 للنبات و ITS1/ITS5.8R للحمض النووي الفطرية 38 .
    2. "تضخيم الحمض النووي" باستخدام المعلمات التالية: تمسخ قبل 2 دقيقة عند 50 درجة مئوية، تمسخ 2 دقيقة الأولى عند 95 درجة مئوية، دورات 40 (15 ثانية عند 98 درجة مئوية، 15 s في 58 درجة مئوية، 60 s عند 72 درجة مئوية)، متبوعاً بمنحنى تذوب.
    3. إعداد بروتوكول بكر 2-الخطوة، متداخلة باستخدام مكتبات الجيل التالي تسلسل استهداف الرنا الريباسي 16S V3/V4 المتغير المنطقة والبحث عن/5.8s الرنا الريباسي المنطقة الفاصلة. بمول
      1. ميليلتر 12.5 إضافة الحمض النووي إلى 5 لكل التمهيدي و 2 x ميكس الرئيسي. جعل ردود الفعل منفصلة لكل منطقة (16S أو لها؛ انظر الجدول 1). تعديل كبسولة تفجير المنطقة المحددة كما هو موضح سابقا 39 ، 40 لإضافة محول المنظم على حدة عبء النوكليوتيدات تسلسل إلى تسلسل جينات محددة.
      2. أداء التضخيم الأولية باستخدام المعلمات التالية: 3 دقيقة تمسخ الأولى عند 95 درجة مئوية، 25 دورات (30 s عند 95 درجة مئوية، 30 s في 55 درجة مئوية، 30 s عند 72 درجة مئوية)، التمديد النهائي 5 دقيقة في 72 درجة مئوية.
      3. يلي الأول التضخيم والتحقق من حجم المكتبة، والكمية التي تنقل الغرواني الكهربي، وتنظيف باستخدام 1 × حجم المرحلة الصلبة عمارة عكسهاأوبيليزاتيون الخرز إزالة بقايا كبسولة تفجير ورد فعل الكواشف. تجمع 16S وفي أمبليكونس كمياً لإنشاء تجمع أمبليكون واحدة لكل عينة.
        4. إضافة محولات معينة التسلسل
      4. وعينه محددة فهارس المزدوج باستخدام كبسولة تفجير التالية (انظر الجدول 1). إضافة 2.5 ميليلتر من تضخيم الحمض النووي إلى 5 بمول من كل التمهيدي و 2 x ميكس الرئيسي. إجراء مكتبة التضخيم باستخدام المعلمات التالية: 3 دقيقة تمسخ الأولى عند 95 درجة مئوية، 8 دورات (30 s عند 95 درجة مئوية، 30 s في 55 درجة مئوية، 30 s عند 72 درجة مئوية)، التمديد النهائي 5 دقيقة في 72 درجة مئوية.
    4. التالي PCR، الانتهاء من تنظيف المكتبات باستخدام وحدة تخزين 1 x من حبات التثبيت عكسها المرحلة الصلبة. تقييم نوعية وكمية للانتهاء من المكتبات باستخدام التنقل الغرواني الكهربي، وفلوروميتري، على التوالي. توحيد المكتبات إلى 2 ميكرومتر وتجمع قبل التسلسل.
    5. إجراء تسلسل الجيل القادم على منصة مماثلة للمحولات إضافة في بكر الثانوية، بطول مناسب لتغطية كامل amplicon 41-
  6. تسلسل الشرح والتحليل تكوين الجراثيم.
    1. الجمع بين زوج في نهاية تسلسل البيانات (R1 و R2) إلى كونتيجس واحدة لكل متسلسلة المكتبات. بعد دمج ملفات R1 و R2، يتم إنتاج ملف فاستا واحد لكل من المكتبات.
      ملاحظة: يتم إجراء هذه الخطوة والعمليات الوارد وصفها أدناه (ما لم يذكر خلاف ذلك) في مزار الإصدار 1.38.0 38-
    2. الشاشة كل ملف فاستا لإزالة القواعد الغامضة وتسلسلات طويلة غير متوقعة وطويلة هوموبوليميرس-
      ملاحظة: المعلمات للفحص، وإزالة تسلسل ماكسامبيج = 0، maxlength = 600، وماكسهوموب = 8 لكل الجينات. إزالة سلاسل متطابقة، ولكن يبقى جدول كونتينجينسي بشكل منفصل لكل المكتبات (يعرف أيضا باسم الجدول العد في مزار).
    3. محاذاة تسلسلات فريدة من نوعها من مكتبة الجينات 16S ضد إصدار قاعدة بيانات سيلفا 123، ومكتبة للبحث عن المورثات ضد قاعدة "توحد،" 42-
      ملاحظة: يجب أن المشروح متواليات من مستوى المملكة إلى مستوى جنس.
      1. في وقت لاحق، المجموعة محاذاة تسلسلات مع pre.cluster الدالة باستخدام فرق = 5، وإزالة التركيبات.
    4. تصنيف سلاسل باستخدام الأسلوب وانغ 43 على أساس سيلفا (للجينات 16S) و "توحيد لها" (للجينات للبحث عن) تصنيف الملفات (استقطاع قيمة 80%).
      5. تحميل
    5. في ص 44 الجداول كونتينجينسي (واحد لكل الجينات) التي تم إنشاؤها أثناء عملية التصنيف في مزار. على كل مستوى من مستويات التصنيف، الحصول على الوفرة النسبية في مكتبة لمزيد من التحليل لتغيرات المجتمع الميكروبية.
      ملاحظة: كل مستوى التصنيف، دمج معا المجموعات التصنيفية عند الوفرة النسبية هو أقل من 2 في المائة لكل التكرار تجريبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

دراسة ميدانية في قفص:

البيانات التي تم الحصول عليها من تجارب قفص أظهر أن المستعمرات تلعثم نحلة استجابة كبيرة للتعرض لمبيد للفطريات. خلايا النحل المعالجة بمبيد للفطريات المنتجة إلى حد كبير عدد أقل من العمال (± 12.2 3.8، يعني ± سراج الدين) من خلايا المراقبة (43.2 ± 11.2، و1, 9= 6.8، p = 0.03) (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، كانت الكتلة الأحيائية النحل من خلايا النحل المعالجة بمبيد للفطريات (ز 0.91 ± 0.15) أقل بكثير من مراقبة خلايا النحل (2.36 ز ± 0.55؛ و 1, 9 = 8.3, p = 0.02). كما لوحظ هذا النمط من الكتلة المخفضة في المعالجة بمبيد للفطريات خلايا الملكات الأم. الملكات خلايا المعالجة بمبيد للفطريات قدم مع الكتلة الحيوية أقل بكثير (ز 0.14 ± 0.04) من الملكات من مراقبة خلايا النحل (ز 0.27 ± 0.01؛ Z = 2.5، p = 0.01). ومع ذلك، لا يؤثر التعرض لمبيد للفطريات عدد اليرقات والخوادر والذكور عبر العلاجات. الكتلة الأحيائية لمراحل الحياة المنفصلة (اليرقات الخوادر والعمال، والذكور البالغين) والأوزان الفردية لليرقات والخوادر، والعمال ولم تظهر أي فرق عبر المعالجة بمبيد للفطريات ومراقبة خلايا النحل.

دراسة تستند إلى المعمل:

البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب المستندة إلى المختبر أشارت إلى أن قبل التعرض لمبيد للفطريات، التحكم والمعالجة بمبيد للفطريات خلايا العد عامل يعني المقارنة إحصائيا (التحكم في خلايا = 28.0 ± 3.1؛ والمعالجة بمبيد للفطريات خلايا = 31.67 ± 2.0؛ n = 3 كل) والملكة الوزن (التحكم في خلايا = ز 0.77 ± 0.04؛ والمعالجة بمبيد للفطريات خلايا = ز 0.74 ± 0.01). ومع ذلك، في نهاية الدراسة، عدد العمال كان أعلى بكثير في مراقبة خلايا النحل (± 67.67 4.3)، مقارنة بخلايا المعالجة بمبيد للفطريات (45.33 ± 3.8) (تي4 = 3.89، p = 0.01). عامل السكان بنسبة % ~ 150 في خلايا المراقبة ~ 45% في خلايا المعالجة بمبيد للفطريات بالمقارنة. وبالمثل، ظلت دون تغيير نسبيا في السيطرة على خلايا (± 0.76 ز 0.02) ~ 35% بالمقارنة مع الانخفاض في خلايا المعالجة بمبيد للفطريات (± ز 0.49 0.16) الوزن النهائي للملكة الأم. مجتمعة، هذه النتائج تتفق مع النتائج المنشورة سابقا25 وتشير إلى التعرض لمبيد للفطريات المتضررة مستعمرة اللياقة البدنية كما يدل على ذلك عدد العمال أقل، وتخفيض أوزان الملكة الأم (الشكل 5).

أظهر تحليل الجينومية من حبوب اللقاح-أحكام فروق واضحة بين المجتمعات الميكروبية التي جمعت من المعالجة بمبيد للفطريات والتحكم في خلايا (الشكل 6). وكان هناك انخفاض (> 95 ٪) في الوفرة النسبية لعادة معزولة ستريبتوميسيتاليس، انتيروباكتيرياليس في خلايا النحل المعالجة بمبيد للفطريات. من المثير للاهتمام، كلا من هذه المجموعات معروفة لنشاط مضاد فطري ودور في الحفاظ على اللقاح30،45 داخل بيئات خلية نحلة. أعضاء البكتيرية للنظام ريكيتسياليس، التي تشمل مسببات الأمراض الشائعة من المفصليات46، أظهر كثير وفرة أكبر في خلايا الفطريات تعامل. المعالجة بمبيد للفطريات خلايا قد وفرة أقل من الفطريات المنتمين لأوامر يوروتياليس وسوردارياليس، ووفرة أعلى من أوامر كابنودياليس وأسكوسفايراليس بالمقارنة مع مراقبة خلايا النحل (الشكل 7). كما كان متوقعا، لكل من البكتيريا والفطريات، مؤشر التنوع (ح) شانون وسيفيد (ه) كان أقل في خلايا المعالجة بمبيد للفطريات بالمقارنة مع عناصر التحكم، على الرغم من أن هذه الاختلافات لم يكن معتدا به إحصائيا (البكتيريا: ح التحكم في خلايا =1.25 ± 0.3، حالمعالجة بمبيد للفطريات خلايا = 0.82 ± 0.2، همراقبة خلايا النحل = 0.46 ± 0.1؛ هالمعالجة بمبيد للفطريات خلايا = 0.31 ± 0.1؛ الفطريات: حمراقبة خلايا النحل =0.99 ± 0.3، حالمعالجة بمبيد للفطريات خلايا = 0.72 ± 0.4، همراقبة خلايا النحل = 0.57 ± 0.2؛ هالمعالجة بمبيد للفطريات خلايا = 0.42 ± 0.2). على الرغم من أن تفاصيل الأيضية والفنية المترتبة على مثل هذا المجتمع تحولات كان خارج نطاق هذه الدراسة، جنبا إلى جنب مع العد مستعمرة، وبيانات الوزن، تشير هذه النتائج إلى أن التعرض لمبيد للفطريات يمكن أن يؤثر تدهور الصحة مستعمرة من تعطيل التكافل بين النحل وميكروبيومي حبوب اللقاح. التحقيق في الدور المجموعات الميكروبية المحددة التي تؤثر في حالة البقاء على الحياة اليرقات يوصي بإجراء تقييم أفضل لدور ميكروبيومي حبوب اللقاح في إدامة النحل صحة السكان.

Figure 1
رقم 1: داخل عش بومبوس إيمباتينس - الحصول على صورة عالية الدقة للعمال تميل إلى خلايا الحضنة. يمكن أن تحتوي على خلايا الحضنة العديد من البيض واليرقات في أي وقت من الأوقات. وضع اليرقات تتغذى على حبوب اللقاح-أحكام أدخلت دورياً في الدائرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: أقفاص ميدانية كبيرة أقيمت لإيواء مستعمرات النحل. كل القفص مش (N = 10) كانت مليئة بأحد شراؤها تجارياً خلية impatiens بومبوس ، فضلا عن بلوم زراعة الأنواع المعروفة لجذب النحل. زهور كانت مخزنة في أحد أركان القفص والمنطقة المتبقية كان مزروع بالعشب الشوفان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: بقايا مبيد للفطريات على عباد الشمس مؤخرا رش- تم رش جرعات الميدانية ذات الصلة من مبيد للفطريات في اليوم 0 و 13 من هذه التجربة. استخدام بخاخ مبيدات آفات، الزهور كانت بالتساوي المغلفة بمحلول مبيد لفطريات في الغسق/مساء لتجنب الاتصال المباشر مع النحل مساحات العلف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الآثار المترتبة على بقايا مبيد للفطريات على النحل تلعثم في تجربة القفص. تلعثم نحلة المستعمرات التي تعرضت لبقايا مبيد للفطريات على حبوب اللقاح أظهرت انخفاضات كبيرة في حجم مستعمرة (ريدوكتالأيونات في وفرة الإناث الكبار) على مدى شهر واحد. تمثل أشرطة الخطأ ± 1SE؛ ف < 0.05. تم تعديل هذا الرقم من برنار et al. 25- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: الآثار المترتبة على بقايا مبيد للفطريات على النحل تلعثم في تجربة المختبري. تلعثم نحلة المستعمرات التي تعرضت لحبوب اللقاح المعالجة بمبيد سجلت انخفاضات كبيرة في حجم مستعمرة (تخفيضات في وفرة العمال الكبار) وانخفاض وزن الملكة الأم على مدى شهر واحد. تمثل أشرطة الخطأ ± 1SE؛ p = 0.03. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: التخطيط الدائري تصنيف الجينومية التنوع الفطرية والبكتيرية في ترتيب الرتبة. تحليلات تستند إلى () التصنيف على أساس البحث عن 16S و (ب) من حبوب اللقاح-توفير عينات جمعت من التحكم والمعالجة بمبيد للفطريات خلايا النحل. خلايا المراقبة أظهرت أعلى من التنوع والتكافؤ في توزيع الميكروبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: % تغيير في ترتيب رتبة الوفرة النسبية للبكتيريا والفطريات في استجابة للتعرض لمبيد للفطريات. تصنيف الجينومية الميكروبية المجتمعات المحلية باستخدام () 16S و (ب) البحث عن أساس كبسولة تفجير الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

زوج التمهيدي نوع التمهيدي تسلسل التمهيدي
28KJ/28 باء مصنع السواقين الكبد عقاري AAA CGT CC/
CGT سی TGT عقاري AAG ACG
ITS1/ITS5.8 فطرية TCC ع الكبد جا CCT فريق التنسيق العالمي ز/
اسكت اتفاق المنسوجات والملابس CGT TGT TGA AAG من دولارات ترينيداد وتوباغو
16s إلى الأمام/عكس البكتيريا متداخلة --أكاكتكتتكككتاكاكجاكجكتكتككجاتكتككتاكججنجكوجكاج 5 '-3'/
--جتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكتجاكتاتشفججتاتكتاتكك 5 '-3'
التمهيدي ITS1F/ITS4 متداخل الفطرية 5-أكاكتكتتكككتاكاكجاكجكتكتككجاتكتتكجتاجتجاككتجكج-3 '
5-جتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكتككتككجكتاتجاتاتجك-3 '
كبسولة تفجير محول 5-آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاك [55555555]
أكاكتكتتكككتاكاكجاكجكتكتككجاتكت-3 '
5-كاجكاجاجاكجكاتاكجاجات [77777777]
جتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت-3 '

الجدول 1: قائمة من أزواج التمهيدي وتسلسل التمهيدي المستخدمة في تضخيم الحمض النووي- راجع النص للمراجع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وظلت التحقيقات المتعلقة الآثار مبيدات الفطريات على صحة النحل جانبا المداريين استراتيجيات إدارة الآفات. وتهدف دراستنا لسد هذه الفجوة في المعرفة باستخدام مجموعة من التقنيات التكميلية التي صراحة عزل العوامل المحركة للنحل الانخفاضات المحتملة. التخطيط، والأساس المنطقي، وتقديم هذه التجارب بالتفصيل أدناه.

من المهم ضمان أن النحل لا يسمح للهروب شبكة التجارب القفص، حيث يضر هذا التحليل الديموغرافي. من المهم أيضا أن يكون الاعشاش الاصطناعية العزل كافية لحماية من المطر وأشعة الشمس المباشرة. وينبغي الحرص حيث أنه لا يتم رش مبيدات الفطريات مباشرة في الاعشاش. ينبغي تزويد المستعمرات قربه مياه السكر لتكملة الرحيق تجمع ومنع الجفاف.

للمختبر على أساس تجارب التغذية، ينبغي الإبقاء على شروط معقمة صارمة لمنع التلوث عند إعداد وجبات الطعام حبوب اللقاح. يجب أن يكون مسحوق حبوب اللقاح تجارياً التي تم شراؤها، والأشعة فوق البنفسجية تعقيمها قبل الاستخدام. يجب المحافظة على نظافة الخلية منع الإصابة من طفيليات دخيلة مثل مخزن العث والصراصير. أن تستكمل أكياس السوائل بمحلول السكر معقمة منع الجفاف. لتعداد ما قبل المعالجة، الرعاية ينبغي أن تتخذها لا للإجهاد النحل معالجة المفرط وإبقائها خارج حفيد لفترات طويلة فترات.

كما الحمض النووي العائد يعتمد على العمر ونوع ابتداء من المواد، يجب استخدام العينات الطازجة أو المجمدة جيدا فقط في استخراج الحمض النووي والتضخيم. لا يزيد وزن العينة لاستخراج الحمض النووي 0.25 الآلية العالمية، كما أن هذا سوف يخفض الغلة الحمض النووي. ينبغي كمياً غلة الحمض النووي باستخدام هلام التفريد. القياس الكمي الغرواني الكهربي مقدما لعزل الحمض النووي الحرجة قبل الانتقال إلى ردود فعل qPCR لضمان كفاءة التضخيم47.

يمكن الحصول على تحليل أكثر شمولاً من الحيوي الميكروبي لتحليل الجينومية، بالحد من كمية تسلسل المشروح (عن طريق الاسترخاء جزء صغير الاختلافات المسموح بها بين متواليات) وتقليل عدد المجموعات التصنيفية، كما كذلك دمج تلك الوفرة النسبية التي منخفض إلى حد كبير (< 2%).

حجم العينة المحافظ (N = 5 لكل مبيد للفطريات تعامل ودون علاج القفص دراسة خلايا) يمكن أن يضخم الاختلافات في البيانات، والتي سوف يكون مصغراً في الدراسات المستقبلية باستخدام النسخ المتماثل أكبر. لإضافة القرار أكبر والقوة الإحصائية للنتائج، سيكون مستعمرات النحل الجمهرة ووزنه قبل وبعد التعرض لمبيد للفطريات. تشغيل التجربة قفص لفترات أطول وسوف تسمح بإنتاج الملكات الجديدة، التي يمكن أن تخدم كمتغير استجابة إضافية. مع هذه التعديلات على البروتوكول الحالي، ستوفر الدراسات المستقبلية مزيدا من التفاصيل حول ديناميات السكان خلية.

طبيعة مسعور من حبوب اللقاح يردع كفاءة خلط مع الماء. الذر وغربلة حبيبات اللقاح إلى مسحوق ناعم، الإيدز في عملية خلط. ويمكن تعديل كمية مسحوق حبوب اللقاح لتحقيق التناسق المنشود. وينبغي الحرص على دقة المزيج السائل (الماء أو مبيد للفطريات) تحقيق توزيع متجانس للمكونات النشطة وحتى التسليم لباحثات.

كما الزائدة من الحمض النووي يمكن أن تمنع ردود الفعل بكر، من المستحسن أن العينة لا ينبغي أن تزن أكثر من 0.25 غ. فورتيكسينج المفرطة وينبغي تجنب هذه المقصات الحمض النووي، وتخفيض العائد. يمكن أيضا أن "الحمض النووي منخفضة" الغلة نتيجة للتعرض المطول لتحلل المخزن المؤقت. ينبغي اختيار الإشعال البكتيرية يفضل من منطقة الرنا الريباسي 16S V7-V9 لتقليل التضخيم غير محددة من الحمض النووي بلاستيدات الخضراء48. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تقديم تسلسل جينات أخرى، مثل الجينات الحمض النووي الريبي الريباسي 18S فهم أفضل للتنوع الميكروبي في حبوب اللقاح، فضلا عن التغيرات السكانية عند استخدام مبيد للفطريات.

نظراً لكمية المكتبات عملية مع مزار، الوقت الحوسبة يمكن أن تكون عالية إلى حد كبير. إزالة وحدانية عند مقارنة سلاسل ضد بعضها البعض (إذا الحوسبة الموارد محدودة وإزالتها قبل الترشيح الوهم) يمكن أن تقلل إلى حد كبير الوقت اللازم لحساب الوحدات التصنيفية التشغيلية.

تجارب قفص تحصر نطاق الطيران الطبيعي للنحل (في مقابل السماح لهم بالأعلاف على نطاق واسع عبر المناظر الطبيعية)، ومن غير الواضح الدرجة التي يمكن أن تؤثر هذه القيود في المتغيرات واستجابة. على الرغم من أن تجربة الأقفاص التحكم والعلاج نفس النطاق من المتغيرات الحيوية وغير الحيوية، من المستحيل لوجستيا لعنصر التحكم المكروية داخل كل قفص.

النطاق الحقيقي للتفاعلات داخل المجتمع الميكروبي جداً معقدة ومتشابكة للنسخ المتماثل من خلال التجارب الاختبارية. بينما لدينا البيانات المحتمل الوثيقة مجموعة فرعية من إجمالي التنوع الميكروبي داخل حبوب اللقاح-الأحكام، هو أول نظرة ثاقبة الآثار التفاعلية التي قد تسود بين البكتيريا والفطريات في الوجود/عدم وجود مبيدات الفطريات.

استخدام قواعد البيانات البديلة لمواءمة تسلسل49 أو توقع الدول الأيضية الوظيفية استناداً إلى حبوب اللقاح التنوع البكتيري50 يمكن تقديم عرض أوسع من ميكروبيومي حبوب اللقاح. في نهاية المطاف، أفضل تميز دينامية المجتمعات الميكروبية الأيضية والوظيفية بعد تطبيق مبيد للفطريات، تسلسل الجينوم كله من حبوب اللقاح ميكروبيومي ضروري.

قفص تجارب باستخدام خلايا تم شراؤها تجارياً توفر واحدة من أفضل الأطر لقياس متغيرات الاستجابة في أجواء شبه الخاضعة للرقابة. يسبب تغيير الحد الأدنى للبيئة النحل الطبيعية (الكفاءة مساحات العلف، والبنية الاجتماعية، رعاية الأبناء)، تجارب قفص التقليل إلى أدنى حد باختراع والإجهاد، وعرض البيئة الاصطناعية ودليل المناولة خلال المستندة إلى مختبر التجارب.

على حد علمنا، تجر أية دراسة حتى الآن لتقييم آثار مبيدات الفطريات على ديناميات المجتمع الميكروبي داخل حبوب اللقاح-توفير تلعثم النحل. التعرض لمبيدات الفطريات قد إزالة واحد أو أكثر من الأنواع الحساسة، تعطيل الهدنة الإيكولوجية بين الفطريات والبكتيريا. استخدام الحقل والمستندة إلى مختبر تجارب كبوتقة للعب خارج هذه التفاعلات، تهدف هذه الدراسة إلى إثبات أن إبادة الأنواع الميكروبية المقيم يمكن تضليل التوازن الإيكولوجي ميكروبيومي حبوب اللقاح، الذي قد يتحول في الصحة النحلة توفيقي.

ثقافة تعتمد على تقنيات مثل تمييع والطلاء على التقاط الوسائط القياسيةسوى جزء صغير من النبت من بيئة معينة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى نقص إجمالي تمثيل التنوع الميكروبي، وقد انتقل الميكروبات ايضات غير مكتشفة51. دراسة اتساع نطاق الأحياء المجهرية والعلماء يجب أن تعتمد على تقنيات مستقلة عن الثقافة، التي أكثر شمولاً وشاملة، مثل تحليل الجينومية وتسلسل الجيل القادم. الرسم بشكل كبير من هذه التقنيات الجزيئية قوية، تهدف هذه الدراسة إلى الحصول على دقة أكبر في ميكروبيومي حبوب اللقاح من تقدمها على أساس ثقافة التقنيات التقليدية وحدها.

كشفت نتائج هذه الدراسة الخسائر العميقة في عدد العمال داخل تلعثم نحلة المستعمرات يتعرضون لمبيد للفطريات. لمستعمرة النحل تلعثم لتكون ناجحة، يحتاج العمال توفير الموارد الكافية والرعاية للملكة الأم ولا سيما وضع اليرقات. في نهاية المطاف، هدف المستعمرة إلى أقصى حد التقاط الموارد (حبوب اللقاح والرحيق) مثل أن يمكن أن تنتج الملكات ابنه أكبر عدد ممكن قبل نهاية الصيف. كوينز ابنه صحية هي مقياس للياقة البدنية لمستعمرة. ثم، تخفيضات كبرى في العمال، ويحد من فعالية قدرة المستعمرة على إنتاج الملكات للسنة التالية. في هذه الدراسة، ليس فقط تناقص عدد العمال، ولكن تعامل الأم-الملكات من مبيد الفطريات خلايا عرض مع انخفاض الكتلة الحيوية، ويفترض أنها نتيجة لإمدادات غذائية غير كافية بباحثات. نظراً لتعقيد التفاعلات الميكروبية داخل حبوب اللقاح-الأحكام، من الصعب تمييز الآثار التفاعلية الدقيق بين الفطريات والبكتيريا التي تسهم في هذه الأنماط. بيد النتائج المستمدة من تجارب منسوخة والمتكررة كما هو موضح هنا، سوف توفر حيوية ثاقبة متنافسة تحول بين هاتين المجموعتين الميكروبية (سواء كانت تنافسية أو المنفعة المتبادلة، أو commensal) ردا على الإجهاد إكسينوبيوتيك، وما آثار المصب على ميكروبيومي حبوب اللقاح.

من خلال استخدام أدوات الجزيئية قوية، يمكن حل تعقيدات الإيكولوجية ميكروبيومي حبوب اللقاح أفضل. التفاهم الأولية تكشف عن عدد كبير من البكتيريا التي تحدث بشكل طبيعي والفطريات، المساهمة بصورة جماعية للحفاظ على اللياقة البدنية مستعمرة. على وجه الخصوص، الخمائر التي كانت معزولة من حبوب اللقاح-أحكام معروفة لتحمل خصائص معفن وجراثيم، كلاهما أمر حاسم بالنسبة لتطوير النحل اليرقات. هذه الجمعيات البيئية توحي بدرجة عالية من تنافع بين النحل وما ميكروبيومي حبوب اللقاح. ولذلك، تمثل حبوب اللقاح-الأحكام، تأثير تنوع ناشئة، الناجمة عن زراعة مجتمع الميكروبية تتألف من الأدوار الوظيفية الرئيسية. في غياب هذه سيمبيونتس الرئيسية، يظهر حبوب اللقاح-توفير للخطر إلى درجة غير معروف. مواصلة العمل في هذا الاتجاه، سوف يرجح أن شرح تنوع وظيفي لهذه الميكروبات وكشف دورهم كالنحلة سيمبيونتس.

البحوث التي أجريت مؤخرا قد فضحت مفهوم مبيدات الفطريات بأنه غير ضار بالنحل19،،من2452،،من5354. والهدف من هذا البحث عزل آليات القيادة آثار مبيد للفطريات على النحل، ثم إلقاء الضوء على العلاقة السببية بين انخفاض النحل واستخدام مبيد للفطريات. مركز فرضيات حول مفهوم أن يجري تغيير متنافسة الميكروبات والنحل إلى حد كبير ببقايا مبيد للفطريات في حبوب اللقاح. في نهاية المطاف، سيتم إعادة تأطير هذا العمل كيف ينظر إلى مبيدات الفطريات واستخدامها في الزراعة والبيئات الحضرية. في ضوء الأزمة الملقحات العالمية الحالية، ويولد البحث المقترح المعارف الجديدة بشأن البيئة النحل الأصلية، كما أنها تتصل بممارسات الإنتاج الزراعي. مبيدات الفطريات تبقى المجموعة الأخيرة أجريتشيميكال تعفي فعلياً من الأنظمة التي تحد من التطبيقات للمحاصيل خلال لوم. كنتيجة لذلك، يتعرض دائماً النحل المدارة والبرية على حد سواء لمبيدات الفطريات. مجموعة متنامية من الأدب وتقترح، رغم أن مبيدات الفطريات غير القاتلة للنحل في جهة الاتصال، في جرعات مرتفعة، التعرض مضر جداً، مما يؤدي إلى ارتفاع معدلات الوفيات اليرقات21 وتغيير السلوك محصده. ومن المتوقع أن هذا العمل سيتم إلقاء الضوء على الآليات التي تضر الفطريات الملقحات. وعلاوة على ذلك، سوف تشكل الأساس لسياسة إدارة الآفات الأكثر حكمه هذا البحث وإبلاغ المزارعين من أفضل الممارسات الإدارية. هذا العمل سيكون أيضا دور أساسي في تقديم المبادئ التوجيهية لرش المبيدات المحسنة، التي قد تؤثر على مبيدات الآفات القوانين واللوائح. على نطاق أوسع، سوف تكون هذه النتائج ذات الصلة إلى أي النظم الإيكولوجية المدارة التي زارها النباتات المزهرة هي جمع حبوب اللقاح الحشرات. مع تقديرات عالمية للنحل-خاصة بخدمات التلقيح حاليا56من ارتفاع غير عادي55،، إذا كان هذا العمل يمكن أن تخفف من انخفاض السكان النحل، والآثار المحتملة ستكون كبيرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المؤلف أشكر مركز التكنولوجيا الحيوية جامعة ويسكونسن تسلسل الحمض النووي مرفق لتوفير المساعدة التقنية مع التضخيم وتسلسل مرافق وخدمات، كيتلين كارلسون، وموهبة جنيفر، أوتو جيك وهاس ماكس التحليل الجزيئي. وأيد هذا العمل "خدمة البحوث" الزراعية-وزارة الزراعة خصصت الأموال (معلومات البحث الحالي نظام #3655-21220-001). وقدمت "المؤسسة الوطنية للعلوم" (تحت "رقم منحة" مزيدا من الدعم DEB-1442148)، مركز الكيان التشغيلي المعين البحيرات الأبحاث الحيوية الكبرى (مكتب وزارة الطاقة علوم البر دي-FC02-07ER64494)، ووزارة الزراعة المعهد الوطني للأغذية والزراعة (هاتش مشروع 1003258). C.T.H. هو "باحث بيو" في مجال العلوم البيولوجية الطبية وزميل كلية تويبفر الفريد، تدعمها بيو الخيرية ومؤسسة ألكسندر فون همبولت، على التوالي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
  2. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, Suppl 1. S80-S95 (2010).
  3. Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
  4. Vanbergen, A. J. Insect Pollinators Initiative. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
  5. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
  6. Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines? Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
  7. Klein, A. -M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
  8. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  9. Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
  10. Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
  11. Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), New York, N.Y. 348-350 (2012).
  12. Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
  13. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  14. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
  15. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
  16. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
  17. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
  18. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754 (2010).
  19. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182 (2013).
  20. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  21. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547 (2014).
  22. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  23. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
  24. van Engelsdorp, D., et al. "Entombed Pollen": A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
  25. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  26. Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
  27. Huang, C. -Y., Ho, C. -H., Lin, C. -J., Lo, C. -C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
  28. Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
  29. Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
  30. Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
  31. Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
  32. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  33. Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125 (2013).
  34. Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
  35. Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency? Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
  36. ThermoFisher Scientific. User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf 3-6 (2010).
  37. Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
  38. Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
  39. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
  40. White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  41. Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. , Available from: http://ngs.biodiv.tw/NGSCore/wp-content/uploads/Documents/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017).
  42. Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
  43. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  44. Team, R. C. R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2015).
  45. Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
  46. Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
  47. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  48. Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
  49. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  50. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
  51. Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
  52. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  53. Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  54. Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
  55. Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235 (2012).
  56. Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals? Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).

Tags

العلوم البيئية، العدد 128، مستعمرة انهيار الفوضى، ميتاجينوميكس، والتنوع الميكروبي، ميكروبيومي، حبوب اللقاح، الخميرة
التجريبية ومواد وتقنيات حسابية إلقاء الضوء على الآليات "مبيدات الفطريات وسط النحل الصحية"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steffan, S. A., Dharampal, P. S.,… More

Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter