Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Empirische, Metagenomic en computationele technieken verlichten de mechanismen door welke fungiciden compromis Bee gezondheid

Published: October 9, 2017 doi: 10.3791/54631
Automatic Translation
1,2, 2, 3,4, 5, 1,3, 6,7,8
1Vegetable Crop Research Unit, USDA-ARS, 2Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics, Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution, University of Wisconsin-Madison

Summary

Microbiële consortia binnen bumble bee-hives verrijken en behouden van pollen voor larven van de honingbij. Met behulp van de volgende generatie sequencing, samen met laboratorium en veld gebaseerde experimenten, dit manuscript wordt beschreven protocollen gebruikt om te testen van de hypothese dat fungicide residuen veranderen de stuifmeel microbiome, en de kolonie demografie, uiteindelijk leidde tot de kolonie verlies.

Abstract

Kwekers gebruiken vaak fungicide sprays tijdens bloei te beschermen gewassen tegen ziekte, die bijen fungicide residuen blootstelt. Hoewel beschouwd als "bee-safe", is er montage bewijs dat fungicide residuen in stuifmeel gekoppeld bee dalingen (voor zowel de honing en de bumble bee-soorten zijn). Terwijl de mechanismen nog relatief onbekend, hebben onderzoekers gespeculeerd dat bee-microbe symbiose zijn betrokken. Microben spelen een centrale rol in het behoud en/of de verwerking van stuifmeel, dat als voeding voor larvale bijen fungeert. Door een wijziging van de microbiële Gemeenschap, is het waarschijnlijk dat fungiciden deze microbe-mediated diensten en verstoren waardoor compromis gezondheid van de bijen. Dit manuscript beschrijft de protocollen voor het onderzoeken van de indirecte mechanism(s) door die fungiciden wordt veroorzaakt door de daling van de kolonie. Cage experimenten bloot bijen aan fungicide-behandelde bloemen hebt al het eerste bewijs dat fungiciden diepgaande kolonie in een inheemse bumble bee (Bombus impatiens verliezen) opgegeven. Met behulp van veld-relevante doses van fungiciden, een reeks experimenten zijn ontwikkeld om te voorzien van een fijnere beschrijving van microbiële Gemeenschap dynamiek van stuifmeel fungicide-blootgesteld. Verschuivingen in de structurele samenstelling van schimmel en bacteriële assemblages binnen de stuifmeel-microbiome worden door de volgende-generatie sequentie en metagenomic analyse onderzocht. Experimenten ontwikkeld hierin zijn ontworpen om een mechanistische begrip van de invloed van fungiciden op de microbiome van stuifmeel-bepalingen. Uiteindelijk, deze bevindingen moeten licht werpen op de indirecte route waarlangs fungiciden wordt veroorzaakt door dalingen van de kolonie.

Introduction

Beheerd en wilde bijen soorten ondervindt wijdverbreide dalingen, met grote gevolgen voor zowel natuur- en landbouw systemen1. Ondanks gezamenlijke inspanningen om te begrijpen van de oorzaken van dit probleem, zijn de factoren rijden honing honingbij dalingen nog steeds niet goed begrepen2,3,4. Voor bepaalde soorten van wilde, inheemse bijen, is de situatie geworden dire5,6. Als de bijenvolken kunnen niet worden gehandhaafd wanneer ze elkaar met de industriële landbouw snijden, hun bevolking zal blijven dalen en de gewassen waarvoor bestuivers (35% van de wereldwijde productie7) zal doorstaan verminderd oogsten.

Terwijl vele potentiële factoren zoals bestrijdingsmiddelen blootstelling, ziekte en habitat verlies1,4,8,9,10 zijn betrokken bij de daling van de bijen van de honing, relatief is weinig bekend over de interactieve effect van deze stressoren op inheemse bijen gezondheid, binnen of in de buurt van landbouwsystemen. Veel huidige onderzoeksinspanningen blijven richten op insecticiden (bijv, neonicotinoids11,12), hoewel afgelopen onderzoek wijst uit dat fungiciden ook een rol in de daling van de bee spelen kunnen door afbreuk te doen aan Geheugenvorming, olfactorische receptie13, nest erkenning14, enzymactiviteit en metabolische functies15,16,17. Wereldwijd blijven de Fungiciden op bloeiende gewassen worden toegepast tijdens de bloei. Recente studies hebben gedocumenteerd dat bijen brengen vaak fungicide residuen terug naar de korf18, inderdaad, studies hebben aangetoond een groot aantal geteste bijenkasten bevatte fungicide residuen19,20. Verdere werkzaamheden is gebleken dat fungicide residu wordt geassocieerd met hoge tarieven van honing honingbij larvale sterfte21,22,23 en de aanwezigheid van "entombed pollen" binnen de koloniën, die hoewel niet-toxisch, is verstoken van microbiële activiteit en voedingswaarde gecompromitteerde24. Ondanks het feit dat fungiciden hebben lang beschouwd als "bee-safe", blijkt nu dat de blootstelling aan fungicide alleen kan leiden tot ernstige kolonie verliezen in een inheemse bumble bee soorten, Bombus impatiens25.

Om het oorzakelijk verband tussen blootstelling van de fungicide en kolonie sterfte, de werkwijze van deze chemische stoffen moeten worden bepaald. Blijkens in bodems26, sedimenten27en28van het aquatisch milieu, gericht op schimmels, fungiciden waarschijnlijk veranderen schimmel overvloed en diversiteit binnen de stuifmeel-bepalingen, waardoor het inroepen van een grote gemeenschap die verschuiving kan sterk gunst bacteriën. Zonder schimmel concurrenten of antagonisten, kunnen bepaalde pathogene bacteriën vermenigvuldigen relatief ongecontroleerde, vergemakkelijking van het bederf van stuifmeel-bepalingen. Afgelopen onderzoek heeft aangetoond dat micro-organismen, met name de gisten en filamenteuze schimmels, dienen als voeding symbionten voor bijen29,30,31, beschermen tegen parasieten en pathogenen32 ,33, en op lange termijn behoud van stuifmeel winkels bieden. Fungiciden, daarom kunnen niet indirect schade toebrengen aan onrijpe bijen door het verstoren van de microbiële Gemeenschap die nodig is om deze services te verstrekken en/of door het verhogen van de gevoeligheid voor opportunistische pathogenen en parasieten12. Met de toenemende eisen op de productie van levensmiddelen, zijn gewassen die wereldwijd wordt gespoten jaarlijks met fungiciden tijdens bloei, onderstrepen de noodzaak om te begrijpen de omvang van dergelijke fungicide-geïnduceerde effecten.

Tot op heden, de lacunes in de primaire kennis met betrekking tot inheemse honingbij microbiële ecologie kan worden vertegenwoordigd door de volgende vragen: in welke mate verandert fungicide de microbiële Gemeenschap in bijen stuifmeel-voorzieningen? Wat zijn de downstream effecten van de consumptie van stuifmeel met een ingrijpend gewijzigde microbiële Gemeenschap? Houden met deze ecologisch germane vragen, experimenten werden ontwikkeld met de belangrijkste doelstellingen van het openbaren van 1) dat alleen fungicide-residu kan leiden tot daling van de strenge kolonie in een inheemse honingbij soorten; 2) de mate waarop microbiële gemeenschappen in stuifmeel-bepalingen worden gewijzigd door fungiciden, en 3) hoe bee gezondheid wordt beïnvloed door een sterk veranderde microbiële Gemeenschap. De experimentele doelstellingen werden gedefinieerd om aan te pakken van de bovenstaande vragen met behulp van een combinatie van laboratorium en veld-gebaseerde experimenten. Met behulp van state-of-the-art metagenomic en moleculaire technieken naast traditionele methoden van veld observatie, dit onderzoek heeft tot doel om samen stuk van de potentiële gezondheidseffecten van fungiciden bee.

De eerste doelstelling van deze studie is om aan te tonen dat fungicide blootstelling alleen leiden aanzienlijke kolonie verliezen onder inheemse honingbij soorten tot kan. Een studie waarbij grote veld kooien werd gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van fungicide blootstelling op de groei van de kolonie van Bombus impatiens, een alomtegenwoordige, overvloedige inheemse honingbij in de VS (afbeelding 1, afbeelding 2, Figuur 3). Het was veronderstelde dat bijenkasten fungicide-behandeld voorleggen aan het zou lagere fitness en atypische demografie in vergelijking met niet-blootgesteld kasten. Gegevens die zijn verkregen uit dit experiment ondersteund deze hypothese, aan te tonen dat residuen van het fungicide binnen stuifmeel de enige oorzaak van diepe kolonie verliezen in een inheemse bumble bee soorten25kunnen zijn. De tweede doelstelling van deze studie is om te onderzoeken van de reactie van de stuifmeel-microbiome fungicide blootstelling. Het is veronderstelde dat de samenstelling van de Gemeenschap van microben in stuifmeel-bepalingen blootgesteld aan fungiciden van die van onbehandeld stuifmeel afwijken zullen. Terwijl schimmel overvloed diversiteit naar verwachting aanzienlijk afnemen, zal bacteriën en/of een één dominante schimmel soort waarschijnlijk groeien ongecontroleerde bij gebrek aan andere concurrerende schimmels. Door een reeks van in-vivo proeven, zal deze verschuivingen in microbiële Gemeenschap samenstelling worden geanalyseerd met behulp van metagenomics.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. onderzoeken van het Effect van Fungicide blootstelling op de Bumble Bee kolonie succes met behulp van veld kooi experimenten

  1. Set van tien mesh kooien in een veld beplant met haver. Graven van een greppel rond elke kooi, en alle vier randen van de mesh-kooi graven in de grond om ervoor te zorgen dat de bijen niet kunnen ontsnappen. Voorraad van de kooien met, bloeiende potplanten waarvan bekend is dat aantrekkelijk voor bijen (bijvoorbeeld boekweit, bernagie, alyssum, kosmos en zonnebloemen) ( Figuur 2).
  2. Vormen een aanvulling van de kooien met een enkele lade (36 x 42 cm) van in-bloei klaver. Floral clusterbronnen binnen een van de hoeken van de kooi, een ruimte van ongeveer 2.5 m x 1 m. Vegetate de resterende kooioppervlakte te bezetten door de haver.
  3. Willekeurig toewijzen de bumble bee kolonies, elk met werknemers en een enkele koningin, een behandeling (fungicide heden/afwezig, N = 5 kolonies per behandeling, 10 kolonies totale), plaats ze binnen de kooi van een veld (N = 1/kooi) 29 dagen (23 juni -21 juli 2014).
  4. Oriënteren de kolonie vakken zodanig dat de kolonie ' s openingen wijst naar het zuiden tot de bijen voorzien optimale navigatie omstandigheden. Het subsidiëren van de kolonies met suiker water blazen, geplaatst in de vakken van de component te vullen nectar beschikbaarheid.
  5. Toepassen chloorthalonil gebaseerde fungicide op een veld-relevante niveau (20 g/L) voor bloeiende planten in de vijf fungicide behandeling kooien, met behulp van een hand gehouden pesticiden sproeien, tweemaal tijdens de studie (dag 0 en 13). De bloemen uniform jas zodanig dat geen verdere vloeistof aan floral oppervlakken ( Figuur 3 voldoet).
  6. Aan het einde van de studie van de kooi veld, met de hand verwijderen van de kolonies van B. impatiens van de kooien, de kasten door te plaatsen in de vriezer -20 ° C gedurende 20 minuten afkoelen
  7. Verwijderen van bijen steriel pincet gebruiken en registreren het aantal larven, poppen, volwassen vrouwtjes (Ik. e. foragers), en volwassen mannetjes. De droog-gewicht van de moeder koningin, larven, poppen, volwassen vrouwtjes (d.w.z. foragers) en volwassen mannetjes met behulp van een analytische balans opnemen.

2. Onderzoeken van de effecten van Fungicide blootstelling op microbiële gemeenschappen in de stuifmeel-bepalingen van In Vivo proeven Bumble Bee nesten met behulp van laboratorium op basis

  1. Pulverize commercieel gekocht stuifmeel tot een fijn poeder met behulp van een standaard laboratorium bal-molen. Steriliseren poedervorm stuifmeel in onderdompelen in 70% ethanol, waardoor het te verdampen 's nachts onder UV-licht. Controleert u de steriliteit van stuifmeel van plating ~0.5 mg op algemene agarmedia.
    1. Aan de droge, gesteriliseerde stuifmeel, met behulp van gesteriliseerde pipetten, toevoegen veld relevante dosering van fungicide: propiconazool op 14,3%; azoxystrobin 22,9% voor behandelingen (0.74 µL en 0,65 µL respectievelijk / dag / component). Meng goed met behulp van gesteriliseerde houten stokken.
  2. Plaats 6 experimentele netelroos (n = 3 voor controle en behandeling) in een schone, hygiënische laboratorium benchtop op kamer temperatuur gehouden. Elke dag Weeg 4,27 g van stuifmeel 34 , 35 gemengd met fungiciden (voor behandelingen) of steriel water (voor het besturingselement) binnen een kap met behulp van standaard aseptische techniek.
    1. Met behulp van de deuren van de val geboden door de kant van de kartonnen doos bijvoeging van de bijenkasten, voeren het stuifmeel in de kasten. Een aanvulling op de kasten met gesteriliseerde suikeroplossing elke week. Blijven voeden regime voor vier weken.
  3. Bij de conclusie van de studie lab gebaseerde, cool de kasten door te plaatsen in de vriezer-20 ° C gedurende 20 minuten Scrape uit de stuifmeel-bepalingen binnen brood kamers met behulp van gesteriliseerde pincet en spatels en plaats in steriele opslag buizen. Winkel bij-80 ° C. graaf en record het gewicht van de werknemers en de koningin-moeder aan het begin en einde van het experiment (stap 1.7).
  4. DNA uit stuifmeel-bepaling monster met behulp van commercieel verkrijgbare DNA isolatie isoleren kits (Zie materialen tabel voor details).
    1. Toevoegen 0,25 g van stuifmeel-bepaling met de aardgaswinning buizen, kort vortex te mengen.
    2. Maak een 200 mg/mL lysozym oplossing in gedeïoniseerd gedestilleerd water, genoeg voor 50 µL/monster. Schud krachtig om volledig formulieroplossing.
    3. 50 µL van de lysozym oplossing toevoegen aan de extractie buizen met monster in het, en meng goed door meerdere malen omkeren. Incubeer de buis gedurende 10 minuten bij 37 ° C in een waterbad. Als neerslag heeft gevormd, Verwarm de oplossing tot 60 ° C tot vóór gebruik opgelost.
    4. Toevoegen 70 µL van lysis van de waterige oplossing voor extractie buizen, veilige horizontaal op een flatbed vortex pad met tape, en vortex voor 10 min. Centrifuge buizen bij 10.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
    5. Het supernatant overbrengen in een schone 2 mL collectie buis. Voeg 250 µL van eiwit neerslag oplossing en vortex voor 5 s. Incubate bij 4 ° C gedurende 5 minuten in een ijsbad.
      Opmerking: Verwacht tussen 400 µL tot 500 µL van bovendrijvende substantie. Supernatant kan nog steeds sommige deeltjes bevatten.
    6. De buizen bij kamertemperatuur voor 1 min bij 10.000 x g centrifugeren en maximaal 600 µL van supernatans overbrengen in een schone 2 mL collectie buis. Voeg 200 µL van waterige remmer verwijdering oplossing, vortex kort, en Incubeer bij 4 ° C gedurende 5 min. Centrifuge de buizen bij kamertemperatuur voor 1 min op 10.000 x g. Pipetteer tot 750 µL van de bovendrijvende substantie in een tube van de verzameling schone 2 mL.
    7. Toevoegen 1200 µL van waterige bind oplossing voor de bovendrijvende substantie, en vortex voor 5 s. laden ongeveer 675 µL van het supernatant op een spin filter, en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Negeren van de stroom door.
    8. Herhaal 2.4.7. tweemaal.
      Let op: Een totaal van drie lasten voor elk monster verwerkt zijn verplicht.
    9. Voeg toe 500 µL ethanol en centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s bij 10.000 x g. negeren van de stroom door, en Centrifugeer nogmaals bij kamertemperatuur voor 1 min op 10.000 x g. plaats spin filter in een tube van de verzameling schone 2 mL.
    10. Voeg 100 µL van elutie buffer naar het midden van het membraan filter. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s bij 10.000 x g. negeren de filter van de draai. Winkel verzamelde DNA tussen-20 ° C en -80 ° C
  5. gebruik geïsoleerd DNA voor het rangschikken.
    1. Quantify, en geïsoleerde DNA naar 2 ng/µL normaliseren door fluorimetrische analyses.
      1. Voorbereiden reacties in drievoud voor elk uitgepakte monster om de relatieve hoeveelheden van 28 te vergelijken (plant), analyseren zijn (schimmel), en de (bacteriële) onderdelen 16S van elke stuifmeel-bepaling monster 36. Ervoor zorgen dat elke reactie 10 bevat ng van totale DNA, 2 x voor asymmetrische cyanine kleurstof gebaseerd master mix en 2.5 µL van voorwaartse en omgekeerde inleidingen paren 28KJ/28B 37 voor plant- en ITS1/ITS5.8R voor schimmel DNA 38 .
    2. Versterken DNA met de volgende parameters: pre denaturatie van de 2 min bij 50 ° C, de eerste denaturatie 2 min bij 95 ° C, 40 cycli van (15 s bij 98 ° C, 15 bij 58 ° C, 60 s s bij 72 ° C), gevolgd door een curve smelt.
    3. Bereiden een 2-step, geneste PCR protocol met behulp van de volgende generatie sequencing bibliotheken gericht op het 16S rRNA V3/V4 variabele regio en ITS / 5.8s rRNA spacer regio.
      1. Toevoegen 12,5 µL van DNA tot en met 5 pmol van elke primer en 2 x master mix. Maak aparte reacties voor elke regio (16S of ITS; Zie tabel 1). Wijzigen regio specifieke primers als eerder beschreven 39 ,, 40 sequencer-specifieke adapter overstek nucleotidesequenties toevoegen aan de gen-specifieke opeenvolgingen.
      2. Uitvoeren van eerste versterking met behulp van de volgende parameters: 3 min eerste denaturatie bij 95 ° C, 25 cycli van (30 s bij 95 ° C, 30 bij 55 ° C, 30 s s bij 72 ° C), de laatste uitbreiding van de 5 minuten op 72 ° C.
      3. Volgende eerste amplificatie, Controleer of bibliotheek grootte en hoeveelheid door elektroforetische mobiliteit en schoon met een 1 x volume vaste fase omkeerbare immobilization kralen om resterende inleidingen en reactie reagentia te verwijderen. Zwembad 16S en haar waarbij kwantitatief over in een enkele amplicon-adresgroep voor elk monster maken.
      4. Toevoegen van sequencer specifieke adapters en proef van de specifieke dual indexen met behulp van de volgende inleidingen (Zie tabel 1). 2.5 µL van versterkte DNA aan 5 pmol van elke primer en 2 x master mix toevoegen. Uitvoeren van versterking van de bibliotheek met behulp van de volgende parameters: 3 min eerste denaturatie bij 95 ° C, 8 cycli van (30 s bij 95 ° C, 30 bij 55 ° C, 30 s s bij 72 ° C), de laatste uitbreiding van de 5 minuten op 72 ° C.
    4. Volgende PCR, schoon afgewerkte bibliotheken met behulp van een 1 x volume van vaste fase omkeerbare immobilisatie parels. Beoordelen van de kwaliteit en kwantiteit van de afgewerkte bibliotheken met elektroforetische mobiliteit en fluorometry, respectievelijk. Standaardiseren van bibliotheken tot 2 µM en zwembad vóór sequencing.
    5. Volgende-generatie sequencing uitvoeren op een platform analoog aan de adapters die zijn toegevoegd in de secundaire PCR, met een passende lengte ter dekking van de gehele amplicon 41.
  6. Volgnummer annotatie en microbiële samenstelling analyse.
    1. Combineren paar-sequencing endgegevens (R1 en R2) in één contigs voor alle gesequenceerd bibliotheken. Na het samenvoegen van zowel R1 en R2 bestanden, ontstaat een enkele fasta bestand voor elk van de bibliotheken.
      Opmerking: Deze stap en de processen die hieronder worden beschreven (tenzij anders vermeld) worden uitgevoerd in Mothur versie 1.38.0 38.
    2. Scherm elk bestand fasta Schakel dubbelzinnig bases, onverwachte lange sequenties, en lange homopolymeren.
      Opmerking: De parameters voor screening, en verwijdering van de reeks zijn maxambig = 0, maxlength = 600, en maxhomop = 8 voor beide genen. Verwijderen van identieke sequenties, maar houden een contingence tabel afzonderlijk voor alle bibliotheken (alias graaf tabel in Mothur).
    3. Uitlijnen unieke reeksen van de bibliotheek van de gene 16S tegen de SILVA databaseversie 123, en de bibliotheek ITS gen tegen de verenigen zijn database 42.
      Opmerking: Sequenties moeten worden aantekeningen van het Koninkrijk niveau naar het niveau van het geslacht.
      1. Vervolgens cluster sequenties uitgelijnd met de functie pre.cluster met behulp van diff = 5, en verwijderen van chimaera.
    4. Classificeren sequenties met behulp van de methode Wang 43 gebaseerd op de SILVA (voor gene 16S) en de ITS verenigen (voor gene ITS) taxonomie bestanden (cutoff waarde van 80%).
    5. Laden in R 44 de tabellen van de contingence (één per gene) gegenereerd tijdens het classificatieproces in Mothur. Op elk taxonomische niveau, het verkrijgen van relatieve overvloed per bibliotheek voor verdere analyse van microbiële gemeenschap veranderingen.
      Opmerking: Op elk taxonomische niveau worden samengevoegd taxonomische groepen als relatieve overvloed minder dan 2% voor alle herhalingen van de experimentele is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Veld kooi studie:

Gegevens die zijn verkregen uit de kooi experimenten bleek dat de bijenvolken bumble had een significante reactie fungicide blootstelling. De kasten fungicide-behandelde geproduceerd aanzienlijk minder werknemers (12.2 ± 3,8, gemiddelde ± SE) dan de controle kasten (43,2 ± 11.2, F1,9= 6,8, p = 0,03) (Figuur 4). Bovendien, was de honingbij biomassa van het fungicide-behandelde netelroos (0.91 g ± 0,15) aanzienlijk lager is dan het besturingselement netelroos (2,36 g ± 0,55; F 1,9 = 8.3, p = 0,02). Dit patroon van verlaagde biomassa in kasten fungicide-behandeld werd ook waargenomen bij de moeder koninginnen. De koninginnen van het fungicide-behandelde kasten gepresenteerd met een aanzienlijk lagere biomassa (0,14 g ± 0,04) dan de koninginnen van de controle-kasten (0,27 g ± 0,01; Z = 2.5, p = 0,01). Fungicide blootstelling beïnvloedde echter niet het aantal larven, poppen en mannen over de behandelingen. De biomassa van discrete levensfasen (larven, poppen, werknemers en volwassen mannetjes) en individuele gewichten voor de larven, poppen en werknemers toonde geen enkel verschil over fungicide-behandeld en controle hives.

Lab gebaseerde studie:

Gegevens die zijn verkregen uit op basis van laboratorium experimenten aangegeven dat voorafgaand aan fungicide blootstelling, controle en fungicide-behandelde bijenkasten had statistisch vergelijkbare gemiddelde werknemer tellen (netelroos controle = 28.0 ± 3.1; fungicide-behandelde bijenkasten = 31.67 ± 2.0; n = 3 elk) en koningin gewicht (netelroos controle = 0.77 g ± 0,04; fungicide-behandelde bijenkasten = 0.74 g ± 0,01). Aan het einde van de studie, werknemer tellen was echter aanzienlijk hoger in controle kasten (67.67 ± 4.3), in vergelijking met fungicide-behandelde netelroos (45.33 ± 3,8) (t-4 = 3,89, p = 0,01). Werknemer bevolking steeg met ~ 150% in control kasten in vergelijking met ~ 45% in kasten fungicide-behandeld. Evenzo bleef eindgewicht van koningin-moeder relatief onveranderd in besturingselement netelroos (0,76 g ± 0,02) vergeleken met een ~ 35% afname fungicide-behandelde netelroos (0.49 g ± 0,16). Samen genomen, deze resultaten zijn in overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten25 en fungicide blootstelling kolonie fitness beïnvloed, zoals blijkt uit minder cijfers van de werknemer en verminderd van koningin-moeder gewichten (Figuur 5) aangeven.

Metagenomic analyse van stuifmeel-bepalingen aangegeven duidelijke verschillen tussen de microbiële gemeenschappen verkregen fungicide-behandeld en controle van bijenkasten (Figuur 6). Er was een daling (> 95%) in de relatieve overvloed van vaak geïsoleerd Streptomycetales, Enterobacteriales in de kasten fungicide-behandeld. Interessant, staan beide deze groepen bekend om hun antischimmel activiteit en de rol van stuifmeel-behoud30,45 binnen hommel korf omgevingen. Bacteriële leden van de orde Rickettsiales, waaronder gemeenschappelijke ziekteverwekkers van geleedpotigen46, bleek veel meer overvloed in de kasten fungicide behandeld. Fungicide-behandelde kasten had een lagere overvloed van schimmels behorend tot de orders Eurotiales en Sordariales, en een hoger aantal bestellingen Capnodiales en Ascosphaerales t.o.v. controle netelroos (Figuur 7). Zoals verwacht, voor zowel de bacteriën en de schimmels, Shannon's diversiteit index (H) en gelijkmatigheid (E) was lager in kasten met fungicide-behandeld in vergelijking met de besturingselementen, hoewel deze verschillen niet statistisch significant waren (bacteriën: H controle van de bijenkasten =1,25 ± 0,3, Hfungicide-behandelde bijenkasten = 0.82 ± 0,2, Econtrole kasten = 0,46 ± 0,1; Efungicide-behandelde bijenkasten = 0.31 ± 0,1; schimmels: Hcontrole bijenkasten =0.99 ± 0,3, Hfungicide-behandelde bijenkasten = 0,72 ± 0,4 Econtrole bijenkasten = 0.57 ± 0,2; Efungicide-behandelde bijenkasten 0,42 ± 0,2 =). Hoewel de detaillering van de metabole en functionele gevolgen van dergelijke gemeenschap verschuift was buiten het bestek van deze studie, gecombineerd met de Telling kolonies, en gewicht gegevens, deze resultaten suggereren dat fungicide blootstelling invloed kan zijn op de daling van de kolonie gezondheid door verstoren de symbiose tussen de bijen en de stuifmeel-microbiome. Verder onderzoek naar de rol van specifieke microbiële groepen op het gebied van larvale overlevingspensioen wordt aanbevolen om de rol van de stuifmeel-microbiome bij het ondersteunen van gezonde bijenvolken beter te evalueren.

Figure 1
Figuur 1: binnen het nest van een Bombus impatiens . Hoge resolutie afbeelding van de arbeiders neigt naar brood cellen. Brood cellen kunnen bevatten meerdere eieren en larven op een bepaald moment. Ontwikkeling van de larven voeden zich met de stuifmeel-bepalingen periodiek in de bedwelmingsruimte gebracht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: grote veld kooien opgetrokken naar het huis van de bijenvolken. Elke kooi mesh (N = 10) was gevuld met een commercieel gekocht Bombus impatiens korf, evenals in-bloei plantensoorten bekend voor het aantrekken van bijen. Bloemen werden aangelegd in een hoek van de kooi en het resterende gebied werd begroeide met haver gras. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Fungicide residu op een onlangs gespoten zonnebloem. Veld relevante doses van fungicide werden gespoten op dag 0 en 13 van het experiment. Met behulp van een sproeier van bestrijdingsmiddelen, werden de bloemen gelijkmatig bedekt met een fungicide oplossing in schemering/avond Voorkom direct contact met foerageren bijen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: effecten van fungicide residu op hommels in kooi experiment. Bumble bee koloniën die werden blootgesteld aan fungicide residuen op stuifmeel tentoongesteld aanzienlijke dalingen in de kolonie grootte (reductionen in volwassen vrouwelijke overvloed) in de loop van één maand. Foutbalken vertegenwoordigen ± 1SE; p < 0.05. Dit cijfer werd vanaf Bernauer et al. gewijzigd 25. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: effecten van fungicide residu op hommels in een laboratorium gebaseerde experiment. Bumble bee kolonies die werden blootgesteld aan stuifmeel fungicide-behandelde tentoongesteld aanzienlijke dalingen in de kolonie grootte (vermindering in volwassen werknemer overvloed) en de daling van de koningin-moeder gewicht in de loop van één maand. Foutbalken vertegenwoordigen ± 1SE; p = 0,03. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: cirkeldiagram van de classificatie van de metagenomic van de schimmel en bacteriële diversiteit op de volgorde van de rang. Analyses op basis van (een) 16S en (b) ITS gebaseerd classificatie van stuifmeel-bepaling monsters verzameld uit controle en fungicide-behandelde bijenkasten. Controle bijenkasten aangetoond hogere diversiteit en gelijkmatigheid in microbiële distributie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: procent wijzigen in volgorde rang relatieve overvloed van bacteriën en schimmels in reactie op blootstelling fungicide. Metagenomic classificatie van microbiële gemeenschappen met behulp van (een) 16S en (b) ITS gebaseerd inleidingen Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Primer paar Primer type Primer volgorde
28KJ/28B Plant GGC GGT AAA TTC CGT CC /
CGT CCG TGT TTC AAG ACG
ITS1 / ITS5.8 Schimmel TCC GTA GGT GAA CCT GCG G /
GAG ATC CGT TGT TGA AAG TT
16s vooruit / omgekeerde Geneste bacteriële 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTACGGGNGGCWGCAG-3 "/
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'
ITS1F primer / ITS4 Genest schimmel 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCGTAGGTGAACCTGCGG - 3'
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC - 3'
Adapter inleidingen 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC [55555555]
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [77777777]
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT -3 '

Tabel 1: lijst van primerparen en primer-sequenties gebruikt in DNA-amplificatie. Zie tekst voor verwijzingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Onderzoek naar de effecten van fungiciden op de gezondheid van de bijen zijn een understudied aspect van strategieën voor het beheer van pest gebleven. Onze studie streeft naar het overbruggen van deze kennis met behulp van een suite van complementaire technieken die expliciet het isoleren van de potentiële factoren rijden bee dalingen. De planning, beweegredenen en weergave van deze experimenten zijn hieronder.

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat geen bijen zijn toegestaan om te ontsnappen van de maaswijdte van de kooi experimenten, aangezien dit zou analyse van de demografie in gevaar brengen. Het is ook belangrijk dat de kunstmatige nesten voldoende isolatie hebben te beschermen tegen regen en direct zonlicht. Worden moet gezorgd zodat fungiciden niet rechtstreeks op de nesten gespoten zijn. De kolonies moeten worden voorzien van suiker water blazen aangevuld nectar verzameld en voorkomen van uitdroging.

Voor het laboratorium gebaseerd voeding proeven, moeten strikte aseptische condities worden gehandhaafd om verontreiniging te voorkomen bij het voorbereiden van de maaltijden van het stuifmeel. Commercieel aangeschafte stuifmeel moet worden gepoederd en UV gesteriliseerd voorafgaand aan gebruik. Korf hygiëne moet worden gehandhaafd om te voorkomen dat besmetting van vreemde parasieten zoals bijkeuken motten en kakkerlakken. Vloeibare blazen moeten worden aangevuld met gesteriliseerde suikeroplossing om uitdroging te voorkomen. Voor voorbehandeling volkstelling, moet worden gewaakt niet aan de stress de bijen door buitensporige behandeling en houden hen buiten de hived voor langdurige perioden.

DNA opbrengst hangt af van de leeftijd en het type van de grondstof, moeten alleen vers OFBEVROREN goed monsters worden gebruikt in DNA-extractie en versterking. Gewicht van het monster voor DNA-extractie mag niet meer dan 0,25 gm, als dit zal lagere opbrengst van DNA. DNA opbrengsten moeten worden gekwantificeerd aan de hand van de Elektroforese van het gel. Upfront elektroforetische kwantificering van geïsoleerde DNA is van cruciaal belang alvorens tot qPCR reacties om ervoor te zorgen efficiënte amplificatie47.

Bij de analyse van de metagenomic, kan een meer uitgebreide analyse van microbiële dynamiek worden verkregen door beperking van het bedrag van geannoteerde opeenvolgingen (door het ontspannen van de Fractie van de maximaal toelaatbare verschillen tussen reeksen) en het verminderen van het aantal taxonomische groepen, als evenals degenen waarvoor relatieve overvloed aanzienlijk laag is samenvoegen (< 2%).

De grootte van de conservatieve steekproef (N = 5 voor beide fungicide behandeld en onbehandeld kooi studie kasten) de varianties van gegevens, die zal worden geminimaliseerd in toekomstige studies met behulp van meer replicatie kan opblazen. Om grotere resolutie en statistisch onderscheidingsvermogen toevoegen aan de resultaten, zullen de bijenvolken censused en gewogen vóór en na fungicide blootstelling. Uitvoeren van het experiment van de kooi voor langere perioden kan de productie van nieuwe queens, die als een aanvullende reactie-variabele dienen kunnen. Met deze wijzigingen in het huidige protocol zorgt toekomstige studies voor meer details over de populatiedynamiek van de korf.

Het hydrofoob karakter van stuifmeel ontmoedigt het efficiënt mengen met water. Pulverizing en zeven van het stuifmeel korrels tot een fijn poeder, helpt bij het mengen proces. Het bedrag van het stuifmeel poeder kan worden aangepast om de gewenste consistentie. Zorg moet men zich grondig Meng de vloeistof (water of fungicide) om een homogene verdeling van werkzame bestanddelen en zelfs levering aan de foragers.

Zoals overtollige DNA PCR reacties remmen kan, is het aanbevolen dat monster moet niet wegen meer dan 0,25 g. buitensporige vortexing moet worden vermeden aangezien dit schaar DNA, verlaging van de opbrengst. Lage DNA opbrengst kan ook een gevolg van langdurige blootstelling aan de lysis-buffermengsel worden. Bacteriële inleidingen moeten bij voorkeur gekozen worden uit de regio V7-V9 16S rRNA om te minimaliseren van niet-specifieke versterking van chloroplast DNA48. Sequentiebepaling van andere genen, zoals het 18S ribosomaal RNA gen kan daarnaast een beter begrip van de microbiële diversiteit in stuifmeel, alsook de veranderingen van de bevolking op fungicide gebruik bieden.

Gezien de hoeveelheid bibliotheken voor het verwerken van met Mothur, kan computing tijd aanzienlijk hoog zijn. Verwijderen van singletons bij het vergelijken van sequenties tegen elkaar (als computing middelen zijn beperkt, verwijdert u deze voordat chimera filtratie) kan de vereiste tijd voor het berekenen van de operationele taxonomische eenheden aanzienlijk verminderen.

De kooi experimenten beperken het bereik van de natuurlijke vlucht van de bijen (in tegenstelling tot toelatend hen om ruwvoer wijd over het landschap), en het is onduidelijk de mate waarin dergelijke beperkingen de respons-variabelen kunnen beïnvloeden. Hoewel de controle en behandeling kooien ervaring van biotische en abiotische variabelen hetzelfde bereik, is het logistiek onmogelijk te controleren voor de communicatie binnen elke kooi.

De werkelijke omvang van de microbiële interacties binnen de Gemeenschap is veel te complex en ingewikkeld om te repliceren via experimentele proeven. Terwijl onze gegevens waarschijnlijk een subset van totale microbiële diversiteit binnen stuifmeel-bepalingen document, is het eerste inzicht in de interactieve effecten die tussen bacteriën en schimmels in de aanwezigheid/afwezigheid van fungiciden kan heersen.

49 alternatieve databases gebruikt voor het uitlijnen van sequenties of functionele metabole Staten gebaseerd op stuifmeel bacteriële diversiteit50 voorspellen een breder zicht van de stuifmeel-microbiome kan bieden. Uiteindelijk, beter karakteriseren de metabole en functionele dynamiek van microbiële gemeenschappen na fungicide toepassing, hele genoom sequentiebepaling van stuifmeel microbiome noodzakelijk is.

Cage experimenten met behulp van commercieel aangeschafte kasten bieden een van de beste frameworks voor het meten van reactie variabelen in een semi-gecontroleerde omgeving. Minimale wijziging van de bijen natuurlijke ecologie (foerageren efficiëntie, sociale structuur, nakomelingen zorg) veroorzaakt, minimaliseren kooi experimenten de misleiding en stress, geïntroduceerd door de kunstmatige omgeving en manuele hantering tijdens het laboratorium gebaseerde experimenten.

Tot de beste van onze kennis, is er nog geen studie uitgevoerd om te kunnen beoordelen van de effecten van fungiciden op microbiële Gemeenschap dynamiek binnen de stuifmeel-bepaling van hommels. Blootstelling aan fungiciden kan een of meer gevoelige diersoorten, verstoren de ecologische wapenstilstand tussen schimmels en bacteriën elimineren. Met behulp van veld- en lab-gebaseerde proeven als een smeltkroes te spelen uit deze interacties, deze studie heeft tot doel om aan te tonen dat uitroeiing van resident microbiële soorten het ecologische evenwicht van de stuifmeel-microbiome, die kan op zijn beurt compromis bee gezondheid kan verdraaien.

Cultuur afhankelijke technieken zoals verdunning en plating op standaard media vastleggenslechts een fractie van de microflora in een bepaalde omgeving. Dit kan leiden tot een bruto ondervertegenwoordiging van microbiële diversiteit en unculturable microben kunnen gaan onopgemerkt51. De breedte van de micro-organismen te studeren, moeten wetenschappers vertrouwen op cultuur-onafhankelijke technieken, die meer inclusieve en uitgebreide, voor bijvoorbeeld metagenomic analyse en sequentiebepaling van de volgende generatie. Tekening zwaar uit deze krachtige moleculaire technieken, deze studie is gericht op het verkrijgen van grotere resolutie in het stuifmeel microbiome dan die van traditionele cultuur gebaseerde technieken alleen.

Resultaten van deze studie is gebleken dat grote verliezen van het aantal werknemers binnen bumble bijenvolken blootgesteld aan fungicide. Voor een bumble bee-kolonie om succesvol te zijn, moeten de werknemers voldoende middelen verschaffen en zorg voor de moeder-koningin en met name voor de ontwikkeling van de larven. Uiteindelijk is het doel van de kolonie te maximaliseren van resource capture (stuifmeel en nectar) zodanig dat zoveel dochter-queens mogelijk kunnen worden geproduceerd door het einde van de zomer. Gezonde dochter-queens zijn de mate van geschiktheid voor een kolonie. Grote verlagingen van de werknemers, dan effectief onderstukken van de kolonie vermogen om te produceren koninginnen voor het volgende jaar. In deze studie, niet alleen waren werknemer nummers aanzienlijk gedaald, maar de moeder-koninginnen van het fungicide behandeld kasten met lagere biomassa, vermoedelijk als gevolg van onvoldoende voedselvoorziening door de foragers voorgesteld. Gezien de complexiteit van microbiële interacties binnen stuifmeel-bepalingen, is het moeilijk te onderscheiden van de exacte interactieve effecten tussen schimmels en bacteriën bij te dragen aan deze patronen. Resultaten afgeleid van gerepliceerde en herhaalde experimenten zoals hier beschreven, zal evenwel essentiële inzichten in de verschuivende symbiose tussen deze twee microbiële groepen (of concurrerende, Linge, commensale) in reactie op xenobiotische stress, en de stroomafwaartse gevolgen voor de microbiome van het stuifmeel.

Door het gebruik van krachtige moleculaire hulpmiddelen, kan de ecologische complexiteit van de stuifmeel-microbiome beter worden opgelost. De voorlopige begrip onthult een overvloed aan natuurlijk voorkomende bacteriën en schimmels, die bijdragen tot collectief kolonie fitness te handhaven. In het bijzonder is de gisten die geïsoleerd van stuifmeel-bepalingen werden bekend dat het dragen van bactericide en fermenterende eigenschappen, die beide cruciaal voor de ontwikkeling van het larven bijen zijn. Dergelijke ecologische verenigingen zijn suggestief voor een hoge mate van mutualisme tussen bijen en hun stuifmeel-microbiome. Stuifmeel-bepalingen, vormen daarom een opkomende diversiteit effect, teweeggebracht door de teelt van een microbiële Gemeenschap bestaat uit belangrijke functionele rollen. Bij gebrek aan deze belangrijke symbionten lijkt de stuifmeel-bepaling naar onbekende graden in het gedrang komen. Voortzetting van het werk in deze richting zal waarschijnlijk uitleggen van de functionele diversiteit van deze microben en hun rol als bee symbionten ontmaskert.

Recent onderzoek heeft het begrip van fungiciden als onschadelijk voor bijen19,24,52,53,,54ontkracht. Het doel van dit onderzoek is te isoleren van de mechanismen die rijden fungicide effecten op bijen, waardoor het verlichten van de oorzaak-gevolg relatie tussen fungicide gebruik en bee dalingen. De hypothesen centrum rond het concept dat bee-microbe symbiose zijn aanzienlijk wordt gewijzigd door fungicide residuen in stuifmeel. Dit werk zal uiteindelijk opnieuw frame hoe fungiciden zijn bekeken en gebruikt in de landbouw en stedelijke omgevingen. In het licht van de huidige crisis van de wereldwijde pollinator genereert het voorgestelde onderzoek nieuwe kennis over de inheemse honingbij ecologie, met betrekking tot agrarische productiepraktijken. Fungiciden blijven de laatste groep van de agrichemical te worden effectief vrijgesteld van verordeningen beperking van toepassingen op gewassen tijdens bloei. Dientengevolge, worden beheerde zowel wilde bijen consequent blootgesteld aan fungiciden. Een groeiend lichaam van literatuur suggereert dat, hoewel fungiciden niet dodelijk voor bijen op contact, bij verhoogde doses zijn blootstelling heel schadelijk zijn is, wat leidt tot hogere larvale sterfte21 en forager gedrag gewijzigd. Verwacht wordt dat dit werk zal verlichten de mechanism(s) waaraan fungiciden zijn nadelige gevolgen voor bestuivers. Bovendien zal dit onderzoek vormen de basis van wijzer pest management beleid en informeren van de telers van beste beheerpraktijken. Dit werk zal ook zijn instrumentaal in het leveren van richtsnoeren voor verbeterde pesticiden spuiten, die invloed op de bestrijdingsmiddelen wet- en regelgeving hebben kunnen. Meer in het algemeen, deze bevindingen zullen relevant zijn voor een beheerde ecosysteem waarin tweezaadlobbige planten worden bezocht door het verzamelen van stuifmeel insecten. Met globale schattingen van bee-specifieke bestuiving geleverde diensten zijn buitengewoon hoog55,56, als dit werk de daling van de bijenvolken verzachten kan, de potentiële effecten zullen aanzienlijke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteur (s) bedanken de Universiteit van Wisconsin biotechnologie Center DNA Sequencing faciliteit voor het verstrekken van versterking en sequencing faciliteiten en diensten, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto en Max Haase voor het verlenen van technische bijstand met moleculaire analyse. Dit werk werd gesteund door de USDA-agrarische zoekservice uitgetrokken middelen (huidige Research Information System #3655-21220-001). Verdere steun werd voorzien door de National Science Foundation (onder Grant nr. DEB-1442148), het DOE grote meren bio-energie Research Center (DOE Office van wetenschap BER DE-FC02-07ER64494), en de USDA nationale Instituut voor voeding en landbouw (Hatch project 1003258). C.T.H. is een geleerde van de Pew in de Biomedische Wetenschappen en een Alfred Toepfer faculteit Fellow, ondersteund door de Pew Charitable Trusts en de Alexander von Humboldt Foundation, respectievelijk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
  2. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, Suppl 1. S80-S95 (2010).
  3. Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
  4. Vanbergen, A. J. Insect Pollinators Initiative. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
  5. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
  6. Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines? Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
  7. Klein, A. -M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
  8. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  9. Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
  10. Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
  11. Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), New York, N.Y. 348-350 (2012).
  12. Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
  13. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  14. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
  15. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
  16. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
  17. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
  18. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754 (2010).
  19. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182 (2013).
  20. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  21. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547 (2014).
  22. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  23. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
  24. van Engelsdorp, D., et al. "Entombed Pollen": A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
  25. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  26. Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
  27. Huang, C. -Y., Ho, C. -H., Lin, C. -J., Lo, C. -C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
  28. Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
  29. Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
  30. Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
  31. Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
  32. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  33. Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125 (2013).
  34. Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
  35. Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency? Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
  36. ThermoFisher Scientific. User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf 3-6 (2010).
  37. Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
  38. Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
  39. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
  40. White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  41. Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. , Available from: http://ngs.biodiv.tw/NGSCore/wp-content/uploads/Documents/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017).
  42. Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
  43. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  44. Team, R. C. R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2015).
  45. Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
  46. Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
  47. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  48. Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
  49. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  50. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
  51. Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
  52. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  53. Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  54. Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
  55. Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235 (2012).
  56. Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals? Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).

Tags

Milieuwetenschappen kwestie 128 kolonie samenvouwen stoornis metagenomics microbiële diversiteit microbiome stuifmeel gist
Empirische, Metagenomic en computationele technieken verlichten de mechanismen door welke fungiciden compromis Bee gezondheid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steffan, S. A., Dharampal, P. S.,… More

Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter