Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Empirisk, gjorts och beräkningstekniker belysa mekanismerna genom vilka fungicider kompromiss bihälsa

Published: October 9, 2017 doi: 10.3791/54631
Automatic Translation
1,2, 2, 3,4, 5, 1,3, 6,7,8
1Vegetable Crop Research Unit, USDA-ARS, 2Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics, Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution, University of Wisconsin-Madison

Summary

Mikrobiell konsortier inom bumble bee bikupor berika och bevara pollen för bee larver. Detta manuskript med nästa generations sekvensering, tillsammans med laboratorium och fältbaserade experiment, och beskriver protokoll som används för att testa hypotesen att fungicid rester förändra pollen microbiom, och kolonin demografi, vilket slutligen leder till kolonin förlust.

Abstract

Odlare använder ofta fungicid sprayer under Blom för att skydda grödor mot sjukdomen som exponerar bina att fungicid rester. Även om anses ”bee-safe”, finns det montering bevis att fungicid rester i pollen är förknippade med bee nedgång (för både honung och bumble bee arter). Medan mekanismerna är fortfarande relativt okänt, har forskare spekulerat att bee-mikrob Symbiosar är inblandade. Mikrober spelar en central roll i bevarandet eller bearbetning av pollen, som fungerar som näring för larval bin. Genom att förändra mikrobiell gemenskapen, är det troligt att fungicider störa dessa mikrob-medierad tjänster, och därmed äventyra bihälsa. Detta manuskript beskriver de protokoll som används för att undersöka de indirekta mekanismerna som fungicider som orsakar kolonin nedgång. Cage experiment utsätta bina att fungicid-behandlade blommor har redan lämnat det första beviset att fungicider orsaka djupgående kolonin förluster i en native humla (Bombus impatiens). Använder fältet-relevanta doser av fungicider, en serie experiment har utvecklats för att ge en finare Beskrivning av mikrobiell gemenskapens dynamik av fungicid-exponerade pollen. Förskjutningar i strukturella sammansättning av svamp och bakteriella konstellationer inom den pollen mikrobiomet utreds av nästa generations sekvensering och gjorts analys. Experiment som framkallade häri har utformats för att ge en mekanistisk förståelse av hur fungicider påverkar mikrobiomet pollen-bestämmelser. Slutligen, dessa fynd bör belysa den indirekta vägen genom vilken fungicider som orsakar kolonin nedgångar.

Introduction

Hanteras och vilda bee arter upplever utbredda nedgångar, med stora konsekvenser för både naturliga och jordbruks system1. Trots gemensamma ansträngningar för att förstå orsakerna till problemet, är de faktorer som driver honey bee minskar fortfarande inte förstådda2,3,4. För vissa arter av vilda, inhemska bin, har situationen blivit ödesdigra5,6. Om bisamhällena inte kan upprätthållas när de skär med industriellt jordbruk, deras befolkningar kommer att fortsätta att falla och de grödor som kräver pollinatörer (35% av världsproduktionen7) kommer att uthärda minskade skördar.

Medan många potentiella faktorer såsom bekämpningsmedel exponering, sjukdom och livsmiljö förlust1,4,8,9,10 har varit inblandade i honey bee nedgång, relativt är lite känt om interaktiva effekten av dessa stressfaktorer på inhemska bin hälsa, inom eller nära jordbrukssystem. Många aktuella forskningsinsatser fortsätta att fokusera på insektsmedel, (t.ex., neonicotinoids11,12), även om tidigare forskning visar att fungicider kan också spela en roll i bee nedgång genom att försämra minnesbildning, Olfactory receptionen13, boet erkännande14, enzymaktivitet och metaboliska funktioner15,16,17. Globalt, fortsätta fungicider att tillämpas på blommande grödor under bloom. Nyare studier har dokumenterat att bina tar vanligen fungicid rester tillbaka till kupan18, i själva verket, studier har visat en stor andel av testade nässelutslag innehöll fungicid rester19,20. Ytterligare arbete har visat att fungicid rester är associerade med höga honey bee larval dödlighet21,22,23 och förekomsten av ”entombed pollen” inom kolonier, som även icke-toxisk, saknar mikrobiell aktivitet och är näringsmässigt komprometterad24. Trots att fungicider har länge ansetts vara ”bee-safe”, finns nu bevis att exponering för fungicid ensam kan orsaka svår kolonin förluster i en native bumble bee art, Bombus impatiens25.

För att fastställa orsakssamband mellan fungicid exponering och kolonin dödlighet, det modus operandi av dessa kemikalier behöver fastställas. Som framgår i jordar26, sediment27och vattenmiljöer28, genom att rikta svampar, fungicider troligen förändra svamp överflöd och mångfalden inom pollen-bestämmelser, därmed åberopa en större gemenskap SKIFT som kan starkt gynna bakterier. Utan svamp konkurrenter eller antagonister, kan vissa patogena bakterier föröka relativt oskyddad, underlätta nedbrytning av pollen-bestämmelser. Tidigare forskning har visat att mikroorganismer, särskilt jäst och filamentösa svampar, tjäna som näringsmässiga symbionter för bin29,30,31, skyddar mot parasiter och patogener32 ,33, och ger långsiktigt bevarande av pollen butiker. Fungicider, kan därför indirekt skada omogna bina genom att störa mikrobiell gemenskapen som behövs för att tillhandahålla dessa tjänster och/eller genom att öka känsligheten för opportunistiska patogener och parasiter12. Med ökande krav på livsmedelsproduktion, är grödor i världen att besprutas varje år med fungicider under Blom, vilket understryker behovet av att förstå omfattningen av sådana fungicid-inducerad effekter.

Till-datum, de primära kunskapsluckorna som avser inhemska biet mikrobiell ekologi kan representeras av följande frågor: i vilken utsträckning ändrar fungicid mikrobiell gemenskapen inom bee pollen-bestämmelser? Vad är nedströms effekterna av konsumerar pollen med en djupt förändrade mikrobiell gemenskap? I linje med dessa ekologiskt nära förbunden frågor, framkallades experiment med de primära målen för att avslöja 1) som fungicid rester ensam kan orsaka svår kolonin nedgång i en native bee arter. 2) graden som mikrobiella samhällen i pollen-bestämmelser ändras med fungicider, och 3) hur binas hälsa påverkas av en kraftigt förändrad mikrobiell gemenskap. De experimentella mål definierades för att ta itu med ovanstående frågor med en kombination av laboratorium och fält-baserade experiment. Använda state-of-the-art gjorts och molekylärbiologiska metoder parallellt med traditionella metoder för fältet observation, syftar denna forskning till att pussla ihop de potentiella effekterna av fungicider på bihälsa.

Det första syftet med denna studie är att visa att fungicid exponering ensam kan orsaka betydande kolonin förluster bland infödda bee arter. En studie på stora fältet burar användes för att undersöka effekterna av fungicid exponering på kolonin tillväxten av Bombus impatiens, en allestädes närvarande, riklig infödda bee i USA (figur 1, figur 2, figur 3). Det antogs att fungicid-behandlade bikupor skulle presentera lägre fitness och atypiska demografi jämfört med icke-exponerade nässelutslag. Data som erhållits från detta experiment stödde denna hypotes, visar att fungicid rester inom pollen kan vara den enda orsaken till djupgående kolonin förluster i en native bumble bee arter25. Det andra syftet med denna studie är att undersöka den pollen mikrobiomet svar på fungicid exponering. Det är en hypotes om att annan obehandlad pollen gemenskapen sammansättningen av mikrober inom pollen-bestämmelserna utsätts för fungicider. Medan svamp populationsstorlek och mångfald väntas minska kraftigt, bakterier eller en enda dominerande svamp art kommer sannolikt att växa okontrollerat i avsaknad av andra konkurrerande svampar. Genom en serie av in vivo - studier, kommer att dessa förskjutningar i mikrobiell gemenskapen sammansättning analyseras med metagenomik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. undersöka effekten av fungicid exponeringen på Bumble Bee kolonin framgång med bur fältexperiment

  1. uppsättning upp tio mesh burar i ett fält som är planterad med havre. Gräva ett dike runt varje bur, och gräva alla fyra kanter av mesh buren i marken för att säkerställa att bina inte kan undkomma. Lagerför burar med, blommande krukväxter som är kända för att vara attraktiv för bin (t.ex. bovete, gurkört, alyssum, kosmos och solrosor) ( figur 2).
  2. Komplettera burar med en enda bricka (36 x 42 cm) med-bloom klöver. Blommig klusterresurser inom ett hörn av buren, ockuperar en utrymme ca 2,5 m x 1 m. Vegetate återstående bur området av havre.
  3. Slumpmässigt tilldelar bumble bee kolonier, varje innehållande arbetstagare och en enda drottning, en behandling (fungicid närvarande/frånvarande, N = 5 kolonier per behandling, 10 kolonier totalt), sedan placera dem inom fältet bur (N = 1/bur) för 29 dagar (23 juni -21 juli 2014).
  4. Orient rutorna kolonin sådan att kolonin ' s öppningar pekar söderut för att ge bina med optimala navigeringsinstrument förhållanden. Subventionera kolonierna med socker vatten blåsor, placeras inuti kupan rutorna att komplettera nektar tillgänglighet.
  5. Tillämpa klorotalonil-baserade fungicid på fältet-relevant nivå (20 g/L) till blommande växter i fem fungicid behandling burar, med en hand höll bekämpningsmedel spruta, två gånger under studien (dag 0 och 13). Coat blommorna jämnt så att ingen ytterligare vätska följer blommig ytor ( figur 3).
  6. Vid avslutningen av bur fältstudien, avlägsna B. impatiens kolonierna från burarna för hand, cool kuporna genom att placera i -20 ° C frys för 20 min.
  7. Ta bort bina med steril pincett och registrera antalet larver, puppor, vuxna kvinnor (jag. e. halvöknar), och vuxna män. Med en Analysvåg registrera torr-vikten av den mor drottning, larver, puppor, vuxna kvinnor (dvs halvöknar) och vuxna hannar.

2. Undersöka effekterna av fungicid exponeringen på mikrobiella samhällen i Pollen-bestämmelserna i Bumble Bee Bon med laboratorium baserade In Vivo studier

  1. Pulverize kommersiellt köpt pollen till ett fint pulver som använder en standard laboratoriet boll-mill. Sterilisera pulveriserad pollen genom blötläggning i 70% etanol, så att den kan avdunsta över natten under UV-ljus. Verifiera sterilitet av pollen genom plätering ~0.5 mg på general-purpose agar media.
    1. Till torrt, steriliserad pollen, använda steriliserade pipetter, lägga till fältet relevanta dosering av fungicid: propikonazol på 14,3%; azoxystrobin på 22,9% för behandlingar (0.74 µL och 0,65 µL respektive / dag / bikupa). Blanda väl med steriliserad träpinnar.
  2. Plats 6 experimentella nässelutslag (n = 3 varje för kontroll och behandling) i en ren, hygieniskt laboratorium bänkmonterade underhålls i rumstemperatur. Varje dag väger 4,27 g pollen 34 , 35 blandat med fungicider (för behandlingar) eller sterilt vatten (för kontrollen) inuti en huva med standard aseptisk teknik.
    1. Med trap dörrar som tillhandahålls vid sidan av den kartong som omslutande kuporna, införa pollen inuti kuporna. Komplettera kupor med steriliserad sockerlösning varje vecka. Fortsätt mata regimen i fyra veckor.
  3. Vid avslutningen av lab-baserad studien, cool kuporna genom att placera i-20 ° C frys för 20 min. skrapa ut pollen-bestämmelserna inom barnaskara chambers med steriliserad pincett och spatlar och plats i sterilförvaring rör. Förvaras vid-80 ° C. räkna och registrera vikten av arbetarna och drottningmodern i början och slutet av experimentet (steg 1,7).
  4. Isolera DNA från pollen-bestämmelse prov med hjälp av kommersiellt tillgängliga DNA isolering Kit (se material tabell för detaljer).
    1. Lägg till 0,25 g pollen-bestämmelse till utvinning av rör, kort vortex blanda.
    2. Gör en 200 mg/mL lysozym lösning i destillerat avjoniserat vatten, tillräckligt för 50 µL/provet. Skaka kraftigt till helt form lösning.
    3. Lägga 50 µL lysozym lösningen till utvinning rören med prov i det och blanda väl genom att vända flera gånger. Inkubera röret under 10 minuter vid 37 ° C i ett vattenbad. Om fällningen har bildats, värma lösning till 60 ° C tills upplöst före användning.
    4. Lägga till 70 µL aqueous lysis lösning till utvinning rör, säkra horisontellt på en flatbed virvel-pad med tejp och virvel för 10 min. Centrifugera rör vid 10 000 x g i 30 s vid rumstemperatur.
    5. Överför supernatanten till en ren 2 mL collection tube. Tillsätt 250 µL av protein nederbörd lösning och vortex för 5 s. Inkubera vid 4 ° C i 5 min i ett isbad.
      Obs: Räkna med mellan 400 µL till 500 µL av supernatanten. Supernatanten kan fortfarande innehålla några partiklar.
    6. Centrifugera rören i rumstemperatur i 1 min vid 10 000 x g och överför upp till 600 µL av supernatanten till en ren 2 mL samling röret. Tillsätt 200 µL av vattenhaltigt hämmare avlägsnande lösning, vortex kortfattat och inkubera vid 4 ° C i 5 min. Centrifugera rören i rumstemperatur i 1 min på 10.000 x g. överför upp till 750 µL av supernatanten till en ren 2 mL collection tube.
    7. Lägga till 1200 µL aqueous bind lösning till supernatanten och virvel för 5 s. Ladda ca 675 µL av supernatanten till en spin filter och centrifugera vid 10 000 x g för 1 min i rumstemperatur. Kassera flödet genom.
    8. Upprepa 2.4.7. två gånger.
      Obs: Sammanlagt tre laster för varje prov bearbetas krävs.
    9. Lägga till 500 µL etanol och centrifugera vid rumstemperatur i 30 s vid 10.000 x g. Kassera flödet genom, och centrifugera igen i rumstemperatur i 1 min på 10.000 x g. plats spin filter i en ren 2 mL collection tube.
    10. Tillsätt 100 µL av eluering buffert till mitten av filtermembranet. Centrifugera vid rumstemperatur i 30 s vid 10.000 x g. Kassera filtret spin. Store samlas DNA mellan-20 ° C och -80 ° C
  5. användning isolerat DNA för sekvensering.
    1. Kvantifiera, och normalisera isolerad DNA till 2 ng/µL av fluorometric analyser.
      1. Förbered reaktioner i tre exemplar för varje extraherade prov att jämföra de relativa mängder 28S (växt), analysera dess (svamp), och 16S (bakteriell) komponenter i varje pollen-bestämmelse prov 36. Se till att varje reaktion innehåller 10 ng av totala DNA, 2 x av asymmetrisk cyanin färgämne baserat master mix och 2,5 µL varje framåt och bakåt primers par 28KJ/28B 37 för växt och ITS1/ITS5.8R för svamp DNA 38 .
    2. Förstärka DNA med följande parametrar: 2 min före denaturering vid 50 ° C, 2 min inledande denaturering vid 95 ° C, 40 cykler av (15 s 98 ° c, 15 s vid 58 ° C, 60 s vid 72 ° C), följt av en smälta kurva.
    3. Förbereda en 2-steg, nästlade PCR-protokoll med hjälp av nästa generations sekvensering bibliotek inriktning den 16S rRNA V3/V4 variabel region och ITS / 5.8s rRNA spacer regionen.
      1. Lägg till 12,5 µL av DNA till 5 pmol för varje grundfärg och 2 x master mix. Göra separata reaktioner för varje region (16S eller ITS; se tabell 1). Ändra region specifika primers som tidigare beskrivits 39 , 40 att lägga sequencer-specifika adapter överhäng nukleotidsekvenser till gen-specifika sekvenser.
      2. Utföra inledande förstärkning med följande parametrar: 3 min inledande denaturering vid 95 ° C, 25 cykler av (30 s vid 95 ° C, 30 s vid 55 ° C, 30 s vid 72 ° C), 5 min slutliga förlängning vid 72 ° C.
      3. Följande inledande förstärkning, kontrollera bibliotek storlek och kvantitet av elektroforetiska mobilitet och rengör med en 1 x volym fast fas reversibel immobilization pärlor att ta bort kvarvarande primers och reaktion reagenser. 16S och dess amplikoner kvantitativt för att skapa en enda amplikon pool för varje prov.
      4. Lägg till sequencer särskilda adaptrar och prova specifika dubbla index använder följande grundfärger (se tabell 1). Tillsätt 2,5 µL amplifierade DNA i 5 pmol för varje grundfärg och 2 x master mix. Utföra bibliotek förstärkning med följande parametrar: 3 min inledande denaturering vid 95 ° C, 8 cykler av (30 s vid 95 ° C, 30 s vid 55 ° C, 30 s vid 72 ° C), 5 min slutliga förlängning vid 72 ° C.
    4. Följande PCR, rena färdiga bibliotek med hjälp av en 1 x volym av fast fas reversibel immobilisering pärlor. Bedöma kvalitet och kvantitet av färdiga bibliotek använder elektroforetiska mobilitet och fluorometry, respektive. Standardisera bibliotek till 2 µM och poolen före sekvenseringen.
    5. Utföra nästa generations sekvensering på en plattform som är analoga med de adaptrar som lagts till i den sekundära PCR, med lämplig längd att täcka den hela amplikon 41.
  6. Sekvens annotering och mikrobiella sammansättningen analys.
    1. Kombinera par-end sekvensering data (R1 och R2) till enda contigs för alla sekvenserade bibliotek. Efter sammanslagning av både R1 och R2 filer, en enda fasta fil för varje bibliotek produceras.
      Obs: Detta steg och de processer som beskrivs nedan (om inte annat anges) utförs i Mothur version 1.38.0 38.
    2. Skärm varje fasta-fil för att ta bort tvetydiga baser, oväntade långa sekvenser och lång homopolymerer.
      Obs: Parametrarna för screening och sekvens borttagning är maxambig = 0, maxlength = 600 och maxhomop = 8 för både gener. Ta bort identiska sekvenser, men hålla en contingence tabell separat för alla bibliotek (aka greven tabell i Mothur).
    3. Anpassa unika sekvenser av den genen 16S mot SILVA databasversionen 123 och det genen ITS biblioteket mot förena dess databas 42.
      Obs: Sekvenser måste förses från kungariket nivå till släktet nivå.
      1. Därefter kluster justerad sekvenser med den funktion pre.cluster använder diff = 5 och ta bort chimärer.
    4. Klassificera sekvenser med metoden Wang 43 baserat på SILVA (för genen 16S) och förena dess (för genen ITS) taxonomi filer (cutoff värde av 80%).
    5. Fyll i R 44 contingence tabellerna (en per gen) alstras under klassificering i Mothur. På varje nivå för artsammansättningar, få relativa överflöd per bibliotek för vidare analys av mikrobiell gemenskapen förändringar.
      Obs: På varje nivå för artsammansättningar, sammanfogas taxonomiska grupper när relativa överflöd är mindre än 2% för alla experimentella upprepningarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cage fältstudie:

Data som erhållits från de bur experiment visade att bumble bee kolonierna hade en betydande svar på fungicid exponering. Fungicid-behandlade bikupor producerad betydligt färre arbetstagare (12,2 ± 3,8, medelvärde ± SE) än kontroll kuporna (43,2 ± 11.2, F1,9= 6,8, p = 0,03) (figur 4). Dessutom var bee biomassa av fungicid-behandlade bikupor (0,91 g ± 0,15) betydligt lägre än kontroll kuporna (2.36 g ± 0,55; F 1,9 = 8,3, p = 0,02). Detta mönster av sänkt biomassa i fungicid-behandlade bikupor observerades också bland mor queens. Drottningarna av fungicid-behandlade bikupor presenteras med en betydligt lägre biomassa (0.14 g ± 0,04) än drottningarna av kontroll kuporna (0,27 g ± 0,01; Z = 2.5, p = 0,01). Fungicid exponering påverkade dock inte antalet larver, puppor och hanar över behandlingarna. Biomassa av diskreta levnadsstadier (larver, puppor, arbetstagare och vuxna män) och individuella vikter för larver, puppor och arbetstagare visade inte någon skillnad över fungicid-behandlade och kontroll nässelutslag.

Lab-baserad studie:

Data som erhållits från laboratoriebaserade experiment visade att före fungicid exponering, kontroll och fungicid-behandlade bikupor hade statistiskt jämförbara genomsnittlig arbetstagare räknas (styra nässelutslag = 28,0 ± 3.1; fungicid-behandlade bikupor = 31.67 ± 2,0; n = 3 varje) och drottning vikt (styra nässelutslag = 0.77 g ± 0,04; fungicid-behandlade bikupor = 0.74 g ± 0,01). I slutet av studien, arbetstagaren räkna var dock betydligt högre i kontroll nässelutslag (67.67 ± 4,3), jämfört med fungicid-behandlade bikupor (45.33 ± 3,8) (t4 = 3.89, p = 0,01). Arbetaren folkmängden ökade med ~ 150% i kontroll kupor jämfört ~ 45% i fungicid-behandlade bikupor. Likaså förblev slutliga vikt av drottningmodern relativt oförändrat i kontroll nässelutslag (0,76 g ± 0,02) jämfört med en ~ 35% minskning av fungicid-behandlade bikupor (0,49 g ± 0,16). Sammantaget dessa resultat överensstämmer med tidigare publicerade resultat25 och indikerar fungicid exponering påverkas kolonin fitness vilket framgår av färre arbetare nummer och minskad drottningmodern vikter (figur 5).

Gjorts analys av pollen-bestämmelserna anges tydliga skillnader mellan de mikrobiella samhällen som samlas in från fungicid-behandlade och kontroll nässelutslag (figur 6). Det fanns en minskning (> 95%) i det relativa överflödet av vanligen isolerade Streptomycetales, Enterobacteriales i fungicid-behandlade kuporna. Intressant, är båda dessa grupper kända för deras antifungal aktivitet och roll i pollen-bevarande30,45 inom humla hive miljöer. Bakteriella medlemmar i ordningen Rickettsiales, som omfattar vanliga patogener av leddjur46, visade mycket större överflöd i fungicid behandlade bikupor. Fungicid-behandlade bikupor hade en lägre överflöd av svampar som tillhör order Eurotiales och Sordariales, och en högre förekomst av beställningar Capnodiales och Ascosphaerales jämfört med kontroll nässelutslag (figur 7). Som förväntat för både bakterier och svampar, Shannons mångfaldsindex (H) och jämnhet (E) var lägre i fungicid-behandlade bikupor jämfört med kontroller, även om dessa skillnader inte var statistiskt signifikant (bakterier: H styra nässelutslag =1,25 ± 0,3, Hfungicid-behandlade bikupor = 0,82 ± 0,2, Ekontroll nässelutslag = 0,46 ± 0,1; Efungicid-behandlade bikupor = 0,31 ± 0,1; svampar: Hkontroll nässelutslag =0,99 ± 0,3, Hfungicid-behandlade bikupor = 0,72 ± 0.4, Ekontroll nässelutslag = 0.57 ± 0,2; Efungicid-behandlade bikupor = 0,42 ± 0,2). Även om beskriver de metabola och funktionella konsekvenserna av sådan gemenskap skiftar var utanför ramen för denna studie, i kombination med antalet mikroorganismer och vikt data, tyder dessa resultat på att fungicid exponering kan påverka nedgång i kolonin hälsa genom störa symbiosen mellan bin och den pollen mikrobiomet. Ytterligare utredning av rollen av specifika mikrobiell grupper som påverkar larval survivorship rekommenderas att bättre utvärdera de pollen mikrobiomet upprätthålla friska bisamhällena roll.

Figure 1
Figur 1: inuti en Bombus impatiens nest. Högupplöst bild av arbetarna tenderar att ruva celler. Ruva celler kan innehålla flera ägg och larver vid varje given tidpunkt. Utveckla larver livnär sig på pollen-bestämmelserna regelbundet förs in i kammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: stort fält burar restes till hus i bisamhällen. Varje maska bur (N = 10) var fyllt med kommersiellt köpt Bombus impatiens registreringsdatafilen, samt i-bloom växtarter känt att locka bin. Blommor var lager i ett hörn av buren och det resterande området var vegetation med havre gräs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: fungicid rester på en nyligen besprutade solros. Fält relevanta doser av fungicid besprutas på dag 0 och 13 av experimentet. Använda ett bekämpningsmedel spruta, var blommorna jämnt belagda med ett svampborttagningslösning vid skymning/kväll för att undvika direkt kontakt med födosök bin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: effekter av fungicid restmaterialet humlor i bur experiment. Bumble bee kolonier som utsattes för fungicid rester på pollen uppvisade signifikanta nedgångar i kolonin storlek (brusreduktionjoner i vuxna kvinnliga överflöd) under loppet av en månad. Felstaplar representera ± 1SE; p < 0,05. Denna siffra ändrades från Bernauer o.a. 25. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: effekter av fungicid restmaterialet humlor i ett experiment som laboratoriebaserade. Bumble bee kolonier som utsattes för fungicid-behandlade pollen uppvisade signifikanta nedgångar i kolonin storlek (minskning av vuxna arbetare överflöd) och minskningen av drottningmodern vikt under loppet av en månad. Felstaplar representera ± 1SE; p = 0,03. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: cirkeldiagram gjorts klassificering av svamp och bakteriella mångfalden vid beställning rang. Analyser baserade på (en) 16S och (b) ITS baserat klassificering av pollen-bestämmelse prover samlas in från kontroll och fungicid-behandlade bikupor. Kontroll nässelutslag visat högre mångfald och jämnhet i mikrobiell distribution. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: procentuell förändring i ordning rang relativa överflöd av bakterier och svampar i svar på fungicid exponering. Gjorts klassificering av mikrobiella samhällen som använder (en) 16S och (b), ITS baserade primers vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Primer par Primer typ Primer sekvens
28KJ/28B Anläggningen GGC GGT AAA TTC CGT CC /
CGT CCG TGT TTC AAG ACG
ITS1 / ITS5.8 Svamp TCC GTA GGT GAA CCT GCG G /
GAG ATC CGT TGT TGA AAG TT
16s framåt / bakåt Kapslade bakteriell 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTACGGGNGGCWGCAG-3'/
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'
ITS1F primer / ITS4 Kapslade svamp 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCGTAGGTGAACCTGCGG - 3'
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC - 3'
Adapter grundfärger 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC [55555555]
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [77777777]
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT -3 '

Tabell 1: lista över primer par och primer sekvenser i DNA amplifiering. Se text för referenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Undersökningar om effekterna av fungicider på bins hälsa förblivit en understudied aspekt av pest förvaltningsstrategier. Vår studie syftar till att överbrygga denna kunskap med hjälp av en uppsättning kompletterande tekniker som uttryckligen isolerar de potentiella faktorer som driver bee nedgångar. Planering, logik, och rendering av dessa experiment beskrivs nedan.

Det är viktigt att säkerställa att inga bin tillåts fly maskorna bur experimenten, eftersom detta skulle äventyra demografi analys. Det är också viktigt att den konstgjorda Bon har tillräcklig isolering för att skydda från regn och direkt solljus. Försiktighet bör iakttas så att fungicider inte sprutas direkt på Bon. Kolonierna bör förses med socker vatten blåsor att komplettera nektar samlades och förhindra uttorkning.

För laboratoriet baserat utfodring prövningar, bör strikt aseptiska förhållanden bibehållas för att förhindra kontaminering när du förbereder de pollen måltiderna. Kommersiellt tillgängliga pollen måste vara pudrade och UV steriliseras före användning. Hive hygien måste upprätthållas för att förhindra angrepp från främmande parasiter såsom skafferi nattfjärilar och kackerlackor. Flytande urinblåsor bör kompletteras med steriliserad sockerlösning för att förhindra uttorkning. För förbehandling folkräkningen, försiktighet bör iakttas att stress inte bina genom överdriven hantering och hålla dem utanför den hived under längre perioder.

Eftersom DNA avkastning beror på ålder och typ av utgångsmaterial, måste endast färska eller väl frysta prover användas i DNA-extraktion och förstärkning. Provets vikt för DNA-extraktion bör inte överstiga 0,25 gm, eftersom detta kommer att sänka DNA avkastning. DNA avkastning ska kvantifieras med hjälp av gelelektrofores. Upfront elektroforetiska kvantifieringen av isolerad DNA är kritiska innan du fortsätter till qPCR reaktioner att säkerställa effektiv förstärkning47.

För gjorts analysen, kan en mer omfattande analys av mikrobiell dynamic erhållas genom att begränsa mängden kommenterad sekvenser (genom avkopplande fraktionen av acceptabla skillnader mellan sekvenser) och minska antalet taxonomiska grupper, som samt sammanslagning de som relativa överflöd är mycket lågt (< 2%).

Konservativa Urvalsstorleken (N = 5 för båda fungicid behandlade och obehandlade bur studie nässelfeber) kan blåsa varianserna i data, vilket kommer att minimeras i framtida studier med större replikering. För att lägga högre upplösning och statistiska kraft till resultaten, kommer bisamhällen att censused och vägde före och efter fungicid exponering. Kör bur experimentet under längre perioder kan produktionen av nya drottningar, som kan tjäna som en variabel med ytterligare svar. Med dessa ändringar av det nuvarande protokollet, kommer framtida studier ger större detaljer om Kupan populationsdynamik.

Den hydrofoba karaktären av pollen avskräcker dess effektiv blandning med vatten. Pulverisering och siktning pollen granulat till ett fint pulver, hjälpmedel i blandningen. Mängden pollen pulver kan justeras för att uppnå önskad konsistens. Vara bör försiktig att noggrant blanda vätska (vatten eller fungicid) för att uppnå en homogen fördelning av aktiva ingredienser och även leverans till halvöknar.

Som överflödigt DNA kan hämma PCR-reaktioner, rekommenderas det att prov inte bör väga mer än 0,25 g. överdriven vortexa bör undvikas eftersom detta klipper DNA, sänka avkastningen. Låg DNA avkastning kan också vara ett resultat av långvarig exponering för lyseringsbuffert. Bakteriella primers bör väljas helst från regionen V7-V9 i 16S rRNA att minimera icke-specifik amplifiering av kloroplast DNA48. Sekvensering av andra gener, såsom 18S ribosomalt RNA genen kan dessutom ge en bättre förståelse av den mikrobiella mångfalden i pollen, liksom befolkningsförändringar på fungicid utnyttjande.

Tanke på mängden bibliotek att bearbeta med Mothur, kan beräknande tid vara betydligt hög. Att ta bort singletons när jämföra sekvenser mot varandra (om computing resurser är begränsade, ta bort dem innan chimera filtrering) kan avsevärt minska den krävda tid för datorarbete operativa taxonomiska enheter.

Cage experimenten begränsa naturliga flyg spänna av bina (i motsats till att tillåta dem att födosöker ofta över landskapet), och det är oklart vilken grad som sådana begränsningar kan påverka variabler som svar. Även om kontroll- och behandlingsgrupperna burarna uppleva samma utbud av biotiska och abiotiska variabler, är det logistiskt omöjligt att kontroll för närmiljön inom varje bur.

Sanna tillämpningsområde inom gemenskapen mikrobiella interaktioner är alldeles för komplexa och intrikata att replikera genom experimentella studier. Medan våra data sannolikt dokumentera en delmängd av totala mikrobiell mångfald inom pollen-bestämmelserna, är det den första inblicken i de interaktiva effekter som kan råda mellan bakterier och svampar i närvaro/frånvaro av fungicider.

Använda alternativa databaser för att rikta sekvenser49 eller förutsäga funktionellt metabola påstår baserat på pollen bakteriell mångfald50 kan ge en bredare bild av det pollen mikrobiomet. Så småningom, för att bättre karaktärisera den metabola och funktionella dynamiskt av mikrobiella samhällen efter fungicid applicering, är hela Genomsekvensering av pollen mikrobiomet nödvändigt.

Cage experiment med hjälp av kommersiellt tillgängliga nässelutslag tillhandahålla en av de bästa ramarna att mäta svar variabler i en semi kontrollerad miljö. Orsakar minimal förändring att bina naturliga ekologi (födosökande effektivitet, social struktur, avkomma vård), minimera bur experiment manipulationer och stress, införts av konstgjord miljö och manuell hantering under laboratoriebaserade experiment.

Till bäst av vår kunskap, har ännu ingen studie utförts för att bedöma effekterna av fungicider på mikrobiell gemenskapen dynamiken inom pollen-tillhandahållande av humlor. Exponering för fungicider kan eliminera en eller flera känsliga arter, störa den ekologiska vapenvilan mellan svampar och bakterier. Med fält och lab-baserad prövningar som en degel för att spela ut dessa interaktioner, syftar denna studie till att påvisa att utrotningen av bosatta mikrobiell arter kan förvanska den ekologiska balansen i den pollen microbiom, som kan i sin tur kompromiss bihälsa.

Kultur-beroende tekniker såsom utspädning och plätering på standardmedia fångaendast en bråkdel av mikrofloran från en given miljö. Detta kan leda till en grov underrepresentationen av mikrobiell mångfald och unculturable mikrober kan gå oupptäckt51. För att studera bredden av mikroorganismer, måste forskare lita på kultur-oberoende tekniker, som är mer inkluderande och omfattande, för t.ex. gjorts analys och nästa generations sekvensering. Teckning tungt från dessa kraftfulla molekylära tekniker, syftar denna studie till att erhålla större resolution till de pollen mikrobiomet än traditionella kultur-baserade tekniker ensam.

Resultaten från denna studie har avslöjat djupgående förluster i antalet arbetstagare inom bumble bee kolonier utsätts för fungicid. För en bumble bee koloni ska lyckas, måste arbetarna tillhandahålla tillräckliga resurser och vård för mor-drottningen och särskilt för att utveckla larver. Ytterst är målet av kolonin att maximera resurs capture (pollen och nektar) så att så många dotter-queens som möjligt kan produceras i slutet av sommaren. Friska dotter-queens är ett mått på lämplighet för en koloni. Stora minskningar av arbetare, sedan effektivt undercuts kolonins förmåga att producera drottningar för följande år. I denna studie inte bara var anställd nummer minskat betydligt, men mor-queens från fungicid behandlade bikupor presenteras med lägre biomassa, förmodligen till följd av otillräckliga livsmedelsförsörjningen av halvöknar. Tanke på komplexiteten av mikrobiella interaktioner inom pollen-bestämmelserna, är det svårt att urskilja de exakta interaktiva effekterna mellan svampar och bakterier som bidrar till dessa mönster. Dock resultaten härrör från replikerade och upprepade experiment som beskrivs här, kommer att ge viktiga insikter i de skiftande symbios mellan dessa två mikrobiell grupper (oavsett om de är konkurrenskraftiga, mutualistisk eller kommensaler) svar på xenobiotiska stress, och dess efterföljande effekter på den pollen mikrobiomet.

Med hjälp av kraftfulla molekylära verktyg, kan den pollen mikrobiomet ekologiska komplexitet lösas bättre. Den preliminära överenskommelsen avslöjar en uppsjö av naturligt förekommande bakterier och svampar, kollektivt bidrar till att bibehålla kolonin konditionen. Särskilt är de jäst som isolerades från pollen-bestämmelser kända för att bära bakteriedödande och fermentativa egenskaper, vilka båda är avgörande för utvecklingen av larval bin. Sådana ekologiska föreningar är tyder på en hög grad av mutualism mellan bin och deras pollen mikrobiomet. Pollen-bestämmelser, representerar därför en framväxande mångfald verkan, följd av odling av en mikrobiell gemenskap består av viktiga funktionella roller. I avsaknad av dessa viktiga symbionter verkar pollen-bestämmelsen äventyras till okänd grader. Fortsatt arbete i denna riktning, kommer sannolikt förklara funktionella mångfalden av dessa mikrober och avslöja deras roll som bee symbionter.

Nyare forskning har krossat uppfattningen av fungicider som ofarliga för bina19,24,52,53,54. Syftet med denna forskning är att isolera drivkrafterna bakom fungicid effekter på bin, därmed lysande orsak-verkan sambandet mellan fungicid användning och bee nedgångar. Stadens hypoteser kring begreppet att bee-mikrob Symbiosar är ändras avsevärt med fungicid rester i pollen. Detta arbete kommer slutligen åter Rama hur fungicider är tittade på och används i jordbruket och urbana miljöer. Mot bakgrund av den nuvarande globala pollinerare krisen genererar den föreslagna forskningen ny kunskap om infödda bee ekologi, som avser jordbruksproduktionen praxis. Fungicider förblir den sista agrichemical-gruppen för att effektivt undantas från regler som begränsar applikationer till grödor under bloom. Som ett resultat, utsätts både hanterade och vilda bin konsekvent för fungicider. En växande mängd litteratur tyder på att, även om fungicider inte är dödliga för bin på kontakt, vid förhöjda doser, exponering är ganska skadligt, vilket leder till högre larval dödlighet21 och förändrad forager beteende. Det förväntas att detta arbete kommer att belysa de mekanismerna som fungicider skadar pollinatörer. Dessutom kommer denna forskning utgör grunden för klokare princip för hantering av pest och informera odlarna av bästa praxis. Detta arbete kommer också vara behjälplig i att leverera riktlinjer för förbättrad bekämpningsmedel sprutning, som kan påverka bekämpningsmedel lagar och förordningar. Mer generellt, dessa fynd kommer att vara relevanta för alla hanterade ekosystem där blommande växter besöks av pollen-samla insekter. Med globala uppskattningar av bee-specifika pollinering tjänster att vara utomordentligt hög55,56, om detta arbete kan mildra nedgången av bisamhällena, de potentiella effekterna kommer att vara betydande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författaren tackar University of Wisconsin bioteknik Center DNA sekvensering anläggningen för förstärkning och sekvensering faciliteter och tjänster, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto och Max Haase för tekniskt stöd med Molekylär analys. Detta arbete stöds av USDA-Agricultural Research Service avsatt medel (nuvarande forskning Information System #3655-21220-001). Ytterligare stöd tillhandahölls av National Science Foundation (under Grant nr DEB-1442148), DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office av vetenskap BER DE-FC02-07ER64494), och USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk (Hatch projektet 1003258). C.T.H. är en Pew lärd i biomedicinsk vetenskap och en Alfred Toepfer fakulteten Fellow, stöds av de Pew Charitable Trusts och Alexander von Humboldt-stiftelsen, respektive.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
  2. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, Suppl 1. S80-S95 (2010).
  3. Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
  4. Vanbergen, A. J. Insect Pollinators Initiative. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
  5. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
  6. Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines? Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
  7. Klein, A. -M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
  8. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  9. Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
  10. Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
  11. Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), New York, N.Y. 348-350 (2012).
  12. Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
  13. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  14. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
  15. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
  16. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
  17. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
  18. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754 (2010).
  19. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182 (2013).
  20. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  21. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547 (2014).
  22. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  23. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
  24. van Engelsdorp, D., et al. "Entombed Pollen": A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
  25. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  26. Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
  27. Huang, C. -Y., Ho, C. -H., Lin, C. -J., Lo, C. -C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
  28. Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
  29. Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
  30. Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
  31. Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
  32. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  33. Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125 (2013).
  34. Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
  35. Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency? Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
  36. ThermoFisher Scientific. User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf 3-6 (2010).
  37. Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
  38. Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
  39. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
  40. White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  41. Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. , Available from: http://ngs.biodiv.tw/NGSCore/wp-content/uploads/Documents/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017).
  42. Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
  43. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  44. Team, R. C. R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2015).
  45. Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
  46. Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
  47. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  48. Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
  49. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  50. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
  51. Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
  52. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  53. Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  54. Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
  55. Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235 (2012).
  56. Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals? Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).

Tags

Miljövetenskap fråga 128 kolonin kollaps sjukdom metagenomik mikrobiell mångfald microbiom pollen jäst
Empirisk, gjorts och beräkningstekniker belysa mekanismerna genom vilka fungicider kompromiss bihälsa
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steffan, S. A., Dharampal, P. S.,… More

Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter