Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Empiriske, Metagenomic og beregningsmæssige teknikker belyse mekanismerne af som fungicider kompromis biers sundhed

Published: October 9, 2017 doi: 10.3791/54631
Automatic Translation
1,2, 2, 3,4, 5, 1,3, 6,7,8
1Vegetable Crop Research Unit, USDA-ARS, 2Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics, Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution, University of Wisconsin-Madison

Summary

Mikrobielle konsortier i bumble bee nældefeber berige og bevare pollen til bee larver. Ved hjælp af næste generation sequencing, laboratorium og feltbaseret eksperimenter, beskriver dette manuskript protokoller, der bruges til at teste hypotesen at fungicid restkoncentrationer alter pollen microbiome og koloni demografi, i sidste ende fører til kolonien tab.

Abstract

Avlere bruger ofte fungicid sprays under flor til at beskytte afgrøderne mod sygdom, hvilket udsætter bier fungicid restprodukter. Selvom betragtes som "bee-safe", er der montering beviser at fungicid restkoncentrationer i pollen er forbundet med bee falder (for både honning og bumble bee arter). Mekanismerne er stadig relativt ukendt, har forskere spekuleret på, at bi-mikrobe symbioser er involveret. Mikrober spiller en central rolle i bevarelsen og/eller forarbejdning af pollen, der tjener som ernæring for larver bier. Ved at ændre den mikrobielle samfund, er det sandsynligt, at fungicider forstyrre disse mikrobe-medieret tjenester, og dermed kompromittere biers sundhed. Dette manuskript beskriver de protokoller, der bruges til at undersøge de indirekte mekanismer som fungicider kan være årsag koloni tilbagegang. Bur forsøg udsætter bier til fungicid behandlet blomster har allerede givet de første beviser at fungicider forårsage dybe koloni tab i en native humlebi (Bombus impatiens). Ved hjælp af felt-relevante doser af fungicider, en serie af eksperimenter har udviklet for at give en finere beskrivelse af mikrobielle samfund dynamics fungicid-eksponerede pollen. Forskydninger i de strukturelle sammensætning af svampe- og bakterieinfektioner assemblager inden for pollen microbiome er undersøgt af næste generation sequencing og metagenomic analyse. Eksperimenter udviklet heri har været designet til at give en mekanistisk forståelse af hvordan fungicider påvirker microbiome pollen-bestemmelser. I sidste ende, disse resultater bør kaste lys over den indirekte vej hvorigennem fungicider kan være årsag koloni falder.

Introduction

Forvaltes og vilde bee arter oplever udbredt afvisninger, med store konsekvenser for både naturlige og landbrugs-systemer1. Trods samordnet indsats for at forstå årsagerne til dette problem, er de faktorer, der styrer honey bee falder stadig ikke godt forstået2,3,4. For visse arter af vilde, native bier, er situationen blevet dire5,6. Hvis bibestandene ikke kan opretholdes, når de skærer hinanden med industrielt landbrug, deres befolkninger vil fortsætte med at falde, og de afgrøder, der kræver bestøvere (35% af verdensomspændende produktion7) vil udholde reduceret høst.

Mens mange potentielle faktorer såsom pesticider eksponering, har sygdom og habitat tab1,4,8,9,10 været impliceret i honey bee tilbagegang, relativt er lidt kendt om interaktive effekten af disse stressfaktorer på native bier sundhed, inden for eller i nærheden af landbrugssystemer. Mange nuværende forskningsindsatsen fortsat fokusere på insekticider, (fx, neonicotinoids11,12), selvom tidligere forskning indikerer at fungicider også kan spille en rolle i bee tilbagegang ved at forringe hukommelsen dannelse, olfaktoriske reception13, reden anerkendelse14, enzymaktivitet og metaboliske funktioner15,16,17. Globalt, fortsat fungicider anvendes på blomstring afgrøder under flor. Nylige undersøgelser har dokumenteret, at bier almindeligt bringe fungicid rester tilbage til bikuben18, faktisk, undersøgelser har vist en stor del af testede nældefeber indeholdt fungicid restkoncentrationer19,20. Yderligere arbejde har afsløret at fungicid rester er forbundet med høje priser af honey bee larve dødelighed21,22,23 og tilstedeværelse af "entombed pollen" inden for kolonier, som selv ikke-giftige, er blottet for mikrobielle aktivitet og er ernæringsmæssigt kompromitteret24. På trods af at fungicider har længe været betragtet "bee-safe", der er nu beviser at eksponering for fungicid alene kan forårsage alvorlige koloni tab i en native bumble bee arter, Bombus impatiens25.

For at fastslå kausalitet mellem fungicid eksponering og koloni dødelighed, modus operandi af disse kemikalier skal bestemmes. Som det fremgår i jord26, sedimenter27og vandmiljøer28, ved at målrette svampe, fungicider sandsynligvis ændre svampe overflod og mangfoldighed inden for pollen-bestemmelser, hvorved påberåbe sig et større fællesskab Skift kan kraftigt favoriserer bakterier. Uden svampe konkurrenter eller antagonister, visse sygdomsfremkaldende bakterier kan formere sig relativt ukontrolleret, lette fordærv af pollen-bestemmelser. Tidligere forskning har vist, at mikroorganismer, især gær og filamentøs svampe, tjene som ernæringsmæssige symbionter for bier29,30,31, beskytte mod parasitter og patogener32 ,33, og levere langsigtet bevaring af pollen butikker. Fungicider, derfor kan indirekte skade umodne bier ved at forstyrre den mikrobielle samfund, der er nødvendige for at yde disse tjenester og/eller ved at øge modtagelighed for opportunistiske patogener og parasitter12. Afgrøder på verdensplan ligger med stigende krav til fødevareproduktion, er der sprøjtes hvert år med fungicider under flor, hvilket understreger behovet for at forstå omfanget af sådanne fungicid-inducerede effekter.

Til dato, de primære viden huller vedrørende indfødte bee mikrobiel økologi kan være repræsenteret af følgende spørgsmål: i hvilket omfang ændrer fungicid den mikrobielle samfund i bee pollen-bestemmelserne? Hvad er downstream konsekvenserne af indtagelse af pollen med et dybt ændrede mikrobielle samfund? I overensstemmelse med disse økologisk germane spørgsmål, eksperimenter blev udviklet med de primære mål med at afsløre 1) at fungicid rester alene kan forårsage alvorlige koloni fald i en native bee arter; 2) graden som mikrobielle samfund i pollen-bestemmelser er ændret af fungicider og 3) hvordan biers sundhed påvirkes af en alvorligt ændrede mikrobielle samfund. De eksperimentelle mål blev defineret for at løse de ovenstående spørgsmål ved hjælp af en kombination af laboratorie - og felt-baserede eksperimenter. Ved hjælp af state-of-the-art metagenomic og molekylærbiologiske teknikker sammen med traditionelle metoder til feltet bemærkning, denne forskning har til formål at sammenstykke de potentielle virkninger af fungicider på biers sundhed.

Det første mål for denne undersøgelse er at vise at fungicid eksponering alene kan forårsage betydelige koloni tab blandt indfødte bee arter. En undersøgelse, der involverer store felt bure blev brugt til at undersøge virkningerne af fungicid eksponering på koloni vækst af Bombus impatiens, en allestedsnærværende, rigelige indfødte bi i USA (figur 1, figur 2, figur 3). Det var en hypotese at fungicid behandlet nældefeber ville præsentere lavere fitness og atypiske demografi i forhold til ikke-eksponerede nældefeber. Data fra dette eksperiment støttet denne hypotese, at fungicid restkoncentrationer i pollen kan være den eneste årsag til dyb koloni tab i en native bumble bee arter25. Det andet formål med denne undersøgelse er at undersøge svar af pollen microbiome fungicid eksponering. Det er en hypotese, at Fællesskabet sammensætningen af mikrober i pollen-bestemmelser udsat for fungicider vil være forskellig fra ubehandlet pollen. Mens svampe overflod og mangfoldighed forventes at falde betydeligt, vil bakterier og/eller en enkelt dominerende svampe arter sandsynligvis vokse ukontrolleret i fravær af andre konkurrerende svampe. Gennem en række in vivo forsøg, vil disse forskydninger i mikrobielle samfund sammensætning blive analyseret ved hjælp af metagenomics.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. undersøge effekten af fungicid eksponering på Bumble Bee koloni succes ved hjælp af felt bur forsøg

  1. sæt op ti mesh bure i et felt, der er beplantet med havre. Grave en grøft omkring hvert bur, og grave alle fire kanter af trådnet bur i jorden for at sikre, at bierne ikke kan undslippe. Stock bure med potteplanter, blomstrende planter, der er kendt for at være attraktive for bier (fx boghvede, Hjulkrone, alyssum, cosmos og solsikker) ( figur 2).
  2. Supplere bure med en enkelt bakke (36 cm x 42 cm) af-bloom kløver. Klynge floral ressourcer inden for et hjørne af buret, besætter en plads ca 2,5 m x 1 m. Vegetate området resterende bur af havre.
  3. Tilfældigt tildele humlebi kolonier, hver indeholdende arbejdstagere og en enkelt dronning, en behandling (fungicid øjeblikket/fraværende, N = 5 kolonier per behandling, 10 kolonier samlede), derefter placere dem inden for et felt bur (N = 1/bur) til 29 dage (23. juni -21 juli 2014).
  4. Orientere boksene koloni sådan, at kolonien ' s åbninger pege mod syd for at give bierne med optimal navigations betingelser. Subsidiere kolonier med sukker vand blærer, placeret inde i bikuben kasser at supplere nektar tilgængelighed.
  5. Anvend chlorothalonil-baserede fungicid på et felt-relevante niveau (20 g/L) til blomstrende planter i fem fungicid behandling bure, ved hjælp af en hånd holdt pesticid sprøjten, to gange i løbet af undersøgelsen (dag 0 og 13). Pels blomster ensartet, således at ingen yderligere væske overholder floral overflader ( figur 3).
  6. Ved afslutningen af bur feltundersøgelse, fjerne B. impatiens kolonier fra bure i hånden, cool bistader ved at placere i -20 ° C fryser i 20 min.
  7. Fjerne bier ved hjælp af steril pincet og registrere antallet af larver, pupper, voksne hunner (jeg. e. foragers), og voksne hanner. Ved hjælp af en Analysevægt registrere mor dronning, larver, pupper, voksne hunner (dvs. foragers) og voksne mænd tør-vægt.

2. Undersøge virkningerne af fungicid eksponering på mikrobielle samfund i Pollen-bestemmelser Bumble Bee reder bruger laboratorium baseret In Vivo forsøg

  1. Pulverize kommercielt købt pollen til et fint pulver ved hjælp af en standard laboratoriet bold-mill. Sterilisere pulveriseret pollen af iblødsætning i 70% ethanol, gør det muligt at fordampe natten under UV-lys. Kontrollere sterilitet pollen ved plettering ~0.5 mg på All-Round agar media.
    1. Til tørt, steriliseret pollen, ved hjælp af steriliseret pipetter, tilføje felt relevante dosering af fungicid: propiconazol på 14,3%; azoxystrobin på 22,9% for behandlinger (0,74 µL og 0,65 µL henholdsvis / dag / hive). Bland godt bruge steriliseret træstave.
  2. Sted 6 eksperimentelle nældefeber (n = 3 for kontrol og behandling) i en ren og hygiejnisk laboratorium benchtop vedligeholdes ved stuetemperatur. Hver dag vejer 4,27 g pollen 34 , 35 blandet med fungicider (for behandlinger) eller sterilt vand (for kontrolelementet) inde i en hætte, ved hjælp af standard aseptisk teknik.
    1. Ved hjælp af de fælde døre leveres ved siden af papkasse omslutter nældefeber, indføre pollen inde i staderne. Tillæg stader med steriliseret sukkeropløsning hver uge. Fortsat fodring regime i fire uger.
  3. Ved afslutningen af den lab-baseret undersøgelse, cool staderne ved at placere i-20 ° C fryser i 20 min. skrabe ud af pollen-bestemmelserne inden for yngel kamre ved hjælp af steriliseret pincet og spatler og sted i steril opbevaring rør. Opbevares ved-80 ° C. tælle og registrere vægten af arbejdstagere og dronningen Moder i starten og slutningen af forsøget (trin 1,7).
  4. Isolere DNA fra pollen-bestemmelse prøve ved hjælp af kommercielt tilgængelige DNA isoleret kits (Se materialer tabel for detaljer).
    1. Tilføje 0,25 g pollen-bestemmelse til udvinding rør kort vortex at blande.
    2. Gør en 200 mg/mL lysozym løsning i ionbyttet destilleret vand, nok for 50 µL/prøve. Ryst kraftigt til fuldstændig form løsning.
    3. Tilføje 50 µL af lysozym løsning til udvinding rør med prøve i det, og bland godt ved at vende flere gange. Inkuber røret i 10 minutter ved 37 ° C i et vandbad. Hvis bundfaldet har dannet, varme løsning på 60 ° C indtil opløst før brug.
    4. Tilføje 70 µL af vandige lysis løsning til udvinding rør, sikre vandret på en flatbed vortex pad med tape, og vortex for 10 min. Centrifuge rør på 10.000 x g for 30 s stuetemperatur.
    5. Overføre supernatanten til en ren 2 mL collection tube. Tilsæt 250 µL af protein nedbør løsning og vortex for 5 s. Incubate ved 4 ° C i 5 min i isbad.
      Bemærk: Forvent mellem 400 µL til 500 µL af supernatanten. Supernatanten kan stadig indeholde nogle partikler.
    6. Centrifugeres rør ved stuetemperatur i 1 minut ved 10.000 x g og overføre op til 600 µL af supernatanten til en ren 2 mL collection tube. Tilføje 200 µL af vandige hæmmer fjernelse løsning, vortex kort, og der inkuberes ved 4 ° C i 5 min. rør ved stuetemperatur i 1 minut ved 10.000 x g. overføre op til 750 µL af supernatanten ind i en ren 2 mL indsamling rør der centrifugeres.
    7. Tilføje 1200 µL af vandige binde løsning til supernatanten og vortex for 5 s. indlæse ca 675 µL af supernatanten på et spin filteret, og der centrifugeres ved 10.000 x g i 1 min. ved stuetemperatur. Kassér flow gennem.
    8. Gentage 2.4.7. dobbelt.
      Bemærk: Alt tre belastninger for hver prøve forarbejdet er påkrævet.
    9. Tilføje 500 µL ethanol, og der centrifugeres ved stuetemperatur i 30 s på 10.000 x g. kassere flow gennem, og centrifugeres igen ved stuetemperatur i 1 minut ved 10.000 x g. sted spin filteret i en ren 2 mL collection tube.
    10. Tilsættes 100 µL af eluering buffer til midten af filter membran. Der centrifugeres ved stuetemperatur i 30 s på 10.000 x g. kassere spin filteret. Butik indsamlet DNA mellem-20 ° C og-80 ° C
  5. Brug isoleret DNA til sekvensering.
    1. Tal, og normalisere isolerede DNA til 2 ng/µL af fluorometriske analyse.
      1. Forbered reaktioner i tre eksemplarer for hver udpakkede prøve at sammenligne de relative mængder af 28S (plante), analysere dens (svampe), og 16S (bakteriel) komponenter af hver pollen-bestemmelse prøve 36. Sikre, at hver reaktion indeholder 10 ng samlede DNA, 2 x asymmetrisk cyanine farvestofbaseret master mix og 2,5 µL af forward og reverse primere par 28KJ/28B 37 for anlægget og ITS1/ITS5.8R for svampe DNA 38 .
    2. Forstærke DNA ved hjælp af følgende parametre: 2 min før denaturering ved 50 ° C, 2 min indledende denaturering ved 95 ° C, 40 cyklusser af (15 s på 98 ° C, 15 s på 58 ° C, 60 s ved 72 ° C), efterfulgt af en smelte kurve.
    3. Udarbejde en 2-trins, indlejrede PCR-protokol ved hjælp af næste generation sequencing biblioteker målretning 16S rRNA V3/V4 variable region og ITS / 5.8s rRNA spacer region.
      1. Tilføje 12,5 µL DNA til 5 pmol hver primer og 2 x master mix. Foretage separate reaktioner for hver region (16S eller ITS; Se tabel 1). Ændre regionen specifikke primere som tidligere beskrevet 39 , 40 at tilføje sequencer-specifik adapter overhæng nukleotidsekvenser til gen-specifikke sekvenser.
      2. Udføre indledende forstærkning ved hjælp af følgende parametre: 3 min indledende denaturering ved 95 ° C, 25 cykler af (30 s ved 95 ° C, 30 s på 55 ° C, 30 s ved 72 ° C), 5 min endelige udvidelse på 72 ° C.
      3. Følgende indledende forstærkning, kontrollere bibliotek størrelse og mængde af elektroforese mobilitet og ren ved hjælp af en 1 x volume faste fase reversible immobilization perler fjerne resterende primere og reaktion reagenser. Pool 16S og dens amplikoner kvantitativt til at oprette en enkelt amplikon pool for hver proeve.
      4. Tilføje sequencer specifikke adaptere og prøve specifikke dual indeks ved hjælp af de følgende primere (Se tabel 1). Tilføje 2,5 µL af amplificerede DNA til 5 pmol hver primer og 2 x master mix. Udføre bibliotek forstærkning ved hjælp af følgende parametre: 3 min indledende denaturering ved 95 ° C, 8 cyklusser af (30 s ved 95 ° C, 30 s på 55 ° C, 30 s ved 72 ° C), 5 min endelige udvidelse på 72 ° C.
    4. Følgende PCR, ren færdige biblioteker ved hjælp af en 1 x antal faste fase reversible immobilisering perler. Vurdere kvaliteten og kvantiteten af de færdige biblioteker ved hjælp af elektroforese mobilitet og fluorometry, henholdsvis. Standardisere biblioteker til 2 µM og pool før sekventering.
    5. Udføre næste generation sequencing på en platform, der er analog med de adaptere, der er tilføjet i den sekundære PCR, med en passende længde til at dække hele amplikon 41.
  6. Sekvens annoteringen og mikrobielle sammensætning analyse.
    1. Kombinere par-ende sequencing data (R1 og R2) til enkelt contigs for alle sekventeret biblioteker. Efter sammenlægning både R1 og R2 filer, en enkelt fasta fil for hver af bibliotekerne er produceret.
      Bemærk: Dette trin og de processer, der er beskrevet nedenfor (medmindre andet er angivet) er udført i Mothur version 1.38.0 38.
    2. Skærm hver fasta fil for at fjerne tvetydige baser, uventede lange sekvenser og lange homopolymerer.
      Bemærk: Parametrene for screening og sekvens fjernelse er maxambig = 0, maxlength = 600, og maxhomop = 8 for begge gener. Fjerne identiske sekvenser, men husk en contingence tabel særskilt for alle biblioteker (alias tæller tabel i Mothur).
    3. Juster unikke sekvenser af det gen 16S mod SILVA databaseversion 123, og genet ITS biblioteket mod det forene sin database 42.
      Bemærk: Sekvenser skal påtegnes fra Kongeriget niveau til slægten niveau.
      1. Efterfølgende klynge justeret sekvenser med funktionen pre.cluster bruger diff = 5, og fjerne kimærer.
    4. Klassificere sekvenser ved hjælp af metoden Wang 43 baseret på SILVA (for gen 16S) og forene sin (for gen ITS) taksonomi filer (skæringsværdien på 80%).
    5. Indlæses i R 44 contingence tabellerne (én pr. gen) genereres ved klassificering i Mothur. Få relativ overflod pr. bibliotek for yderligere analyse af mikrobielle samfund ændringer på hver taksonomiske niveau,.
      Bemærk: På hver taksonomiske niveau, sammenflette taksonomiske grupper når relativ overflod er mindre end 2% for alle de eksperimentelle gentagelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Felt bur undersøgelse:

Data fra bur forsøg viste, at bumble bee kolonier havde en betydelig reaktion på fungicid eksponering. Fungicid behandlet staderne produceret betydeligt færre arbejdstagere (12,2 ± 3.8, gennemsnit ± SE) end kontrol nældefeber (43,2 ± 11.2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (figur 4). Derudover var bee biomasse af fungicid behandlet nældefeber (0,91 g ± 0,15) væsentligt lavere end kontrol nældefeber (2,36 g ± 0,55; F 1,9 = 8.3, p = 0,02). Dette mønster af sænket biomasse i fungicid behandlet nældefeber blev også observeret blandt mor queens. Dronninger af fungicid behandlet staderne præsenteret med en betydeligt lavere biomasse (0,14 g ± 0,04) end dronninger af kontrol nældefeber (0,27 g ± 0,01; Z = 2,5, p = 0.01). Fungicid eksponering påvirkede imidlertid ikke antallet af larver, pupper og hanner på tværs af behandlingerne. Biomasse af diskrete livsstadier (larver, pupper, arbejdstagere og voksne hanner) og individuelle vægte for larver, pupper og arbejdstagere viste ikke nogen forskel på tværs af fungicid behandlet og kontrol hives.

Lab-baseret undersøgelse:

Data fra laboratoriebaserede eksperimenter viste, at før fungicid eksponering, kontrol og fungicid behandlet nældefeber havde statistisk sammenlignelige gennemsnitlige arbejdstager count (styre nældefeber = 28.0 ± 3.1; fungicid behandlet nældefeber = 31.67 ± 2,0; n = 3 hver) og dronning vægt (styre nældefeber = 0,77 g ± 0,04; fungicid behandlet nældefeber = 0,74 g ± 0,01). Men i slutningen af studiet, arbejdstager tælle var betydeligt højere i kontrol nældefeber (67.67 ± 4.3), sammenlignet med fungicid behandlet nældefeber (45.33 ± 3.8) (t4 = 3,89, p = 0.01). Arbejdstager befolkning steg ~ 150% i kontrol bistader i forhold til ~ 45% i fungicid behandlet nældefeber. Tilsvarende forblev endelige vægt af enkedronning relativt uændret i kontrol nældefeber (0,76 g ± 0,02) sammenlignet med en ~ 35% fald i fungicid behandlet nældefeber (0,49 g ± 0,16). Taget sammen, disse resultater er konsistente med tidligere offentliggjorte resultater25 og angive fungicid eksponering påvirket koloni fitness, som det fremgår af færre arbejdstager numre og reduceret enkedronning vægte (figur 5).

Metagenomic analyse af pollen-bestemmelserne angivet tydelige forskelle mellem de mikrobielle samfund indsamlet fra fungicid behandlet og styre nældefeber (figur 6). Var der et fald (> 95%) i den relative forekomst af almindeligt isoleret Streptomycetales, Enterobacteriales i fungicid behandlet staderne. Interessant nok er begge disse grupper kendt for deres svampedræbende aktivitet og rolle i pollen-bevarelse30,45 i bumblebee hive miljøer. Bakteriel medlemmer af ordenen Rickettsiales, der omfatter fælles patogener af leddyr46, viste meget større overflod i fungicid behandlet nældefeber. Fungicid behandlet nældefeber havde en lavere overflod af svampe tilhører ordrer Eurotiales og Sordariales, og en højere tæthed af ordrer Capnodiales og Ascosphaerales i forhold til kontrol nældefeber (figur 7). Som forventet, for både bakterier og svampe, Shannons diversitet indeks (H) og jævnhed (E) var lavere i fungicid behandlet bistader i forhold til kontrol, selv om disse forskelle ikke var statistisk signifikant (bakterier: H styre nældefeber =1,25 ± 0,3, Hfungicid behandlet nældefeber = 0,82 ± 0,2, Ekontrol nældefeber = 0.46 ± 0,1; Efungicid behandlet nældefeber = 0.31 ± 0,1; svampe: Hkontrol nældefeber =0,99 ± 0,3, Hfungicid behandlet nældefeber = 0,72 ± 0,4, Ekontrol nældefeber = 0.57 ± 0,2; Efungicid behandlet nældefeber = 0,42 ± 0,2). Selv beskriver de metaboliske og funktionelle konsekvenser af sådanne EF skifter var uden for rammerne af denne undersøgelse, kombineret med kimtal og vægt data, disse resultater tyder på, at fungicid eksponering kan påvirke tilbagegang i kolonien sundhed ved forstyrre symbiose mellem bier og pollen microbiome. Yderligere undersøgelse rollen af specifikke mikrobielle grupper påvirker larve efterladte anbefales til bedre vurdere rollen af pollen microbiome opretholde sunde bibestandene.

Figure 1
Figur 1: indeni en Bombus impatiens reden. Høj opløsning billede af arbejdstagernes tendens til yngel celler. Yngel celler kan indeholde flere æg og larver på ethvert givet tidspunkt. Udvikle larver lever af pollen-bestemmelserne regelmæssigt føres ind i salen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: stort felt bure rejst til at huse bikolonier. Hvert mesh bur (N = 10) var fyldt op med en kommercielt købt Bombus impatiens hive, samt i bloom plantearter kendt for at tiltrække bier. Blomster blev fyldt op i et hjørne af buret og det resterende område var bevoksede med havre græs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: fungicid rester på en nyligt sprøjtet solsikke. Feltet relevante doser af fungicid blev sprøjtet på dag 0 og 13 i eksperimentet. Ved hjælp af et pesticid sprøjte, var blomsterne jævnt overtrukket med et fungicid løsning ved skumring/aften for at undgå direkte kontakt med fouragering bier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: virkningerne af fungicid rester på humlebier i bur eksperiment. Bumble bee kolonier, der blev udsat for fungicid rester på pollen udstillet betydelige fald i kolonien størrelse (reductioner i voksne kvindelige overflod) i løbet af en enkelt måned. Fejllinjer udgør ± 1SE; p < 0,05. Dette tal blev ændret fra Bernauer et al. 25. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: virkningerne af fungicid rester på humlebier i et laboratorium-baseret eksperiment. Bumble bee kolonier, der blev udsat for fungicid behandlet pollen udstillet betydelige fald i kolonien størrelse (reduktioner i voksenarbejder overflod) og nedgangen i enkedronning vægt i løbet af en enkelt måned. Fejllinjer udgør ± 1SE; p = 0,03. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: cirkeldiagram metagenomic klassifikation af svampe- og bakterieinfektioner mangfoldighed på ordre rang. Analyser baseret på (en) 16S og (b) ITS baseret klassificering af pollen-bestemmelse prøver indsamlet fra kontrol og fungicid behandlet nældefeber. Kontrol nældefeber viste højere mangfoldighed og jævnhed i mikrobiel distribution. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: procent ændre i ordren rang relativ overflod af bakterier og svampe i reaktion på fungicid eksponering. Metagenomic klassificering af mikrobielle samfund ved hjælp af (en) 16S og (b) ITS baseret primere venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Primer par Primer type Primer sekvens
28KJ/28B Plante GGC GGT AAA TTC KBRT CC /
KBRT CCG TGT TTC AAG ACG
ITS1 / ITS5.8 Svampe TCC GTA GGT GAA FTT GCG G /
GAG ATC KBRT TGT TGA AAG TT
16s frem / tilbage Indlejrede bakteriel 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTACGGGNGGCWGCAG-3'/
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'
ITS1F primer / ITS4 Indlejret svampe 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCGTAGGTGAACCTGCGG - 3'
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC - 3'
Adapter primere 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC [55555555]
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [77777777]
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT -3 '

Tabel 1: liste over primer par og primer sekvenser i DNA amplifikation. Se tekst for referencer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Undersøgelser af virkningerne af fungicider på biers sundhed er forblevet et forsømt aspekt af skadedyr strategier. Vores undersøgelse har til formål at slå bro over denne videnskløft, ved hjælp af en suite af supplerende teknikker, som udtrykkeligt isolere de potentielle faktorer køre bee falder. Planlægning, rationale og gengivelse af disse eksperimenter er nærmere beskrevet nedenfor.

Det er vigtigt at sikre, at ingen bier er tilladt at undslippe mesh bur eksperimenter, da dette ville bringe demografi analyse. Det er også vigtigt, at de kunstige reder har tilstrækkelig isolering til at beskytte mod regn og direkte sollys. Bør udvises forsigtighed, således at fungicider ikke er sprøjtes direkte på reder. Kolonierne bør være forsynet med sukker vand blærer at supplere nektar samledes og forhindre dehydrering.

For laboratoriet baseret fodring forsøg, opretholdes strenge aseptiske betingelser for at forhindre forurening, når du forbereder pollen måltider. Kommercielt købt pollen skal være pulveriseret og UV steriliseret før brug. Hive hygiejne skal opretholdes for at forhindre angreb fra uvedkommende parasitter såsom pantry møl og kakerlakker. Flydende blærer bør suppleres med steriliseret sukkeropløsning for at forhindre dehydrering. For forbehandling census, bør sikres ikke at stress bierne af overdreven håndtering og holde dem uden for den hived for længerevarende perioder.

Som DNA udbytte afhænger af alder og type starter materiale, skal kun friske eller godt frosne prøver anvendes i DNA-ekstraktion og forstærkning. Prøven vægt for DNA-ekstraktion bør ikke overstige 0,25 gm, som dette vil sænke DNA udbytte. DNA udbytter skal kvantificeres ved hjælp af gelelektroforese. Upfront elektroforese kvantificering af isolerede DNA er kritisk, før du fortsætter til qPCR reaktioner til at sikre effektiv forstærkning47.

For metagenomic analysen, kan en mere omfattende analyse af mikrobielle dynamisk opnås ved at begrænse mængden af kommenteret sekvenser (af afslappende brøkdel af tolerable forskelle mellem sekvenser) og reducere antallet af taksonomiske grupper, som godt som fletter dem som relativ overflod er betydeligt lav (< 2%).

Konservative prøvestørrelse (N = 5 for begge fungicid behandlet og ubehandlet bur undersøgelse nældefeber) kan puste afvigelser i data, som vil blive minimeret i fremtidige undersøgelser ved hjælp af større replikering. For at tilføje højere opløsning og statistiske magt til resultaterne, vil bikolonier være censused og vejes før og efter fungicid eksponering. Kører bur eksperiment i længere perioder vil give mulighed for produktion af nye dronninger, som kan tjene som en ekstra respons variabel. Med disse ændringer af den nuværende protokol, vil fremtidige undersøgelser give større detaljer om hive populationsdynamik.

Den hydrofobiske karakter af pollen afskrækker dens effektive blanding med vand. Pulverisering og sigtning pollen granulater til et fint pulver, hjælpemidler i miksningen. Mængden af pollen pulver kan justeres for at opnå den ønskede konsistens. Bør sikres blandes grundigt væske (vand eller fungicid) for at opnå en homogen fordeling af aktive ingredienser og endda levering til foragers.

Som overskydende DNA kan hæmme PCR-reaktionerne, anbefales det, at prøve ikke bør veje mere end 0,25 g. overdreven vortexing bør undgås, da dette stanseværktøj DNA, sænke udbytte. Lav DNA udbytte kan også være et resultat af langvarig udsættelse for lysisbuffer. Bakteriel primere bør vælges fortrinsvis fra regionen V7-V9 af 16S rRNA at minimere ikke-specifikke forstærkning af grønkorn DNA48. Derudover kan sekventering af andre gener såsom 18S ribosomale RNA gen give en bedre forståelse af den mikrobielle diversitet i pollen, som befolkningen ændringer på fungicid udnyttelse.

I betragtning af mængden af biblioteker til at behandle med Mothur, kan computertid være meget høj. At fjerne enebørn, når man sammenligner sekvenser mod hinanden (hvis computing ressourcer er begrænsede, fjerne dem før chimera filtrering) kan væsentligt nedsætte fristen for computing operationelle taksonomiske enheder.

Bur forsøg begrænse rækken naturlige flyvning af bier (i modsætning til at tillade dem at fouragere bredt på tværs af landskabet), og det er uklart, graden som sådanne restriktioner kan påvirke svar variabler. Selv om kontrol og behandling burene oplever den samme række biotiske og abiotiske variabler, er det logistisk umuligt at kontrollere for mikromiljø i hvert bur.

Det sande omfang af inden for Faellesskabet mikrobielle interaktioner er alt for kompliceret og indviklet at replikere gennem eksperimentelle forsøg. Mens vores data sandsynligvis dokumentere en delmængde af samlede mikrobiel diversitet inden for pollen-bestemmelser, er det det første indblik i de interaktive effekter, der kan herske mellem bakterier og svampe i tilstedeværelse/manglende fungicider.

Ved hjælp af alternative databaser til at justere sekvenser49 eller forudsige funktionelle metaboliske stater baseret på pollen bakteriel mangfoldighed50 kan give en bredere opfattelse af pollen microbiome. Til sidst, for at bedre karakterisere den metaboliske og funktionelle dynamiske af mikrobielle samfund efter fungicid ansøgning, er samlede genom sekventering af pollen microbiome nødvendige.

Bur eksperimenter ved hjælp af kommercielt købt nældefeber giver en af de bedste rammer til at måle reaktion variabler i en semi-kontrollerede omgivelser. Forårsager minimal ændring af biernes naturlige økologi (fouragering effektivitet, social struktur, afkom pleje), minimere bur forsøg påfund og stress, indført af den kunstige miljø og manuel håndtering under laboratoriebaserede eksperimenter.

Til bedste af vores viden, har ingen undersøgelse endnu blevet gennemført for at vurdere virkningerne af fungicider på mikrobielle samfund dynamikken i pollen-bestemmelse af humlebier. Eksponering for fungicider kan fjerne en eller flere følsomme arter, forstyrre den økologiske våbenhvile mellem svampe og bakterier. Brug feltet og lab-baseret forsøg som en digel for at spille ud disse interaktioner, denne undersøgelse sigter mod at påvise, at udryddelsen af hjemmehørende mikrobielle arter kan forvanske den økologiske balance i pollen microbiome, som kan igen kompromis biers sundhed.

Kultur-afhængige teknikker som fortynding og plating på standard media capturekun en brøkdel af mikrofloraen fra et givet miljø. Dette kan føre til en grov underrepræsentation af mikrobiel diversitet, og unculturable mikrober kan gå uopdaget51. For at undersøge bredden af mikroorganismer, skal forskere stole på kultur-uafhængig teknikker, som er mere inkluderende og omfattende, fx metagenomic analyse og næste generation sequencing. Tegning kraftigt fra disse kraftfulde molekylære teknikker, denne undersøgelse sigter mod at opnå højere opløsning i pollen microbiome end forudsat ved traditionelle kultur-baserede teknikker alene.

Resultaterne fra denne undersøgelse har afsløret dybe tab i antallet af arbejdstagere inden for bumble bee kolonier udsat for fungicid. For en bumble bee koloni skal lykkes, skal arbejdstagerne afsætte tilstrækkelige ressourcer og pleje for mor-dronning og især for udviklingen af larverne. I sidste ende, målet med kolonien er at maksimere ressource capture (pollen og nektar), således at så mange datter-dronninger som muligt kan fremstilles i slutningen af sommeren. Sunde datter-dronninger er mål for egnethed til en koloni. Store reduktioner i arbejdstagere, derefter, undergraver effektivt koloniens evne til at producere queens for det følgende år. I denne undersøgelse, ikke kun var arbejdstager tal betydeligt faldt, men mor-dronninger fra fungicid behandlet nældefeber præsenteret med lavere biomasse, formentlig som følge af utilstrækkelig mad levering af foragers. Betragtning af kompleksiteten af mikrobielle interaktioner i pollen-bestemmelser, er det svært at skelne de nøjagtige interaktive effekter mellem svampe og bakterier, der bidrager til disse mønstre. Men resultaterne stammer fra replikerede og gentagne eksperimenter som beskrevet her, vil give vigtig indsigt i de skiftende symbioser mellem disse to mikrobielle grupper (om konkurrencedygtige, mutualistic eller commensal) i svar til xenobiotiske stress, og dens downstream virkninger på pollen microbiome.

Ved hjælp af kraftfulde molekylære tools, kan økologiske kompleksiteten af pollen microbiome løses bedre. Den indledende forståelse afslører et væld af naturligt forekommende bakterier og svampe, kollektivt bidrager til at opretholde koloni fitness. Især er de gær, der blev isoleret fra pollen-bestemmelserne kendt for at bære bakteriedræbende og Fermentativ egenskaber, som begge er afgørende for udviklingen af larve bier. Sådanne økologiske foreninger er tyder på en høj grad af gensidighed mellem bier og deres pollen microbiome. Pollen-bestemmelser, repræsenterer derfor en emergent mangfoldighed effekt, fremkaldt af dyrkning af en mikrobielle samfund består af vigtige funktionelle roller. I mangel af disse centrale symbionter synes pollen-bestemmelse at være kompromitteret til ukendt grader. Fortsat arbejde i denne retning, vil sandsynligvis forklare den funktionelle mangfoldighed af disse mikrober og afsløre deres rolle som bee symbionter.

Nyere forskning har debunked begrebet fungicider som værende ufarlige for bier19,24,52,53,54. Formålet med denne forskning er at isolere mekanismer kørsel fungicid virkninger på bier, dermed lysende årsag og virkning forholdet mellem fungicid brug og bee falder. Byens hypoteser omkring konceptet, at bi-mikrobe symbioser, der ændres væsentligt af fungicid restkoncentrationer i pollen. Dette arbejde vil i sidste ende igen ramme hvor fungicider er set på og bruges i landbruget og bymiljøer. I lyset af den nuværende globale bestøver krise skaber den foreslåede forskning ny viden på native bee økologi, som det drejer sig om landbrugsproduktionen praksis. Fungicider forblive den sidste agrichemical gruppe effektivt fritagelse for forordninger begrænse programmer til afgrøder under flor. Som et resultat, er både administrerede og vilde bier konsekvent udsættes for fungicider. En voksende mængde af litteratur tyder på, at fungicider er ikke dødelig for bier på kontakt, ved forhøjet doser, eksponering er ganske skadelig, fører til højere larve dødelighed21 og ændret forager adfærd. Det forventes, at dette arbejde vil belyse de mekanismer som fungicider skader bestøvere. Desuden, denne forskning vil danne grundlag for klogere politik for administration af skadedyr og informere avlere af bedste praksis for styring. Dette arbejde vil også være medvirkende til at levere retningslinjer for forbedret pesticid sprøjtning, som kan påvirke pesticid love og forordninger. Mere generelt, disse resultater vil være relevante for alle administrerede økosystem, hvor blomstrende planter er besøgt af pollen-indsamling insekter. Globale skøn over bi-specifikke bestøvning tjenester at være ekstraordinært høj55,56, hvis dette arbejde kan afbøde nedgangen i bibestandene, de potentielle virkninger vil være betydelige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatter eller forfattere takke University of Wisconsin bioteknologi Center DNA-sekventering facilitet for forstærkning og sekventering faciliteter og tjenester, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto og Max Haase teknisk bistand med Molekylær analyse. Dette arbejde blev støttet af USDA-Agricultural Research Service bevilgede midler (nuværende forskning Information System #3655-21220-001). Yderligere støtte blev leveret fra National Science Foundation (under Grant nr. DEB-1442148), DOE Great Lakes bioenergi Research Center (DOE kontor for videnskab BER DE-FC02-07ER64494), og USDA National Institute for fødevarer og landbrug (Hatch projekt 1003258). C.T.H. er en Pew forsker i den biomedicinske videnskaber og en Alfred Toepfer Fakultet Fellow, støttet af Pew Charitable Trusts og Alexander von Humboldt-stiftelsen, henholdsvis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
  2. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, Suppl 1. S80-S95 (2010).
  3. Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
  4. Vanbergen, A. J. Insect Pollinators Initiative. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
  5. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
  6. Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines? Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
  7. Klein, A. -M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
  8. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  9. Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
  10. Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
  11. Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), New York, N.Y. 348-350 (2012).
  12. Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
  13. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  14. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
  15. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
  16. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
  17. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
  18. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754 (2010).
  19. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182 (2013).
  20. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  21. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547 (2014).
  22. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  23. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
  24. van Engelsdorp, D., et al. "Entombed Pollen": A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
  25. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  26. Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
  27. Huang, C. -Y., Ho, C. -H., Lin, C. -J., Lo, C. -C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
  28. Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
  29. Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
  30. Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
  31. Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
  32. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  33. Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125 (2013).
  34. Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
  35. Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency? Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
  36. ThermoFisher Scientific. User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf 3-6 (2010).
  37. Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
  38. Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
  39. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
  40. White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  41. Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. , Available from: http://ngs.biodiv.tw/NGSCore/wp-content/uploads/Documents/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017).
  42. Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
  43. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  44. Team, R. C. R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2015).
  45. Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
  46. Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
  47. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  48. Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
  49. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  50. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
  51. Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
  52. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  53. Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  54. Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
  55. Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235 (2012).
  56. Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals? Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).

Tags

Miljøvidenskab spørgsmålet 128 koloni sammenbrud disorder metagenomics mikrobiel diversitet microbiome pollen gær
Empiriske, Metagenomic og beregningsmæssige teknikker belyse mekanismerne af som fungicider kompromis biers sundhed
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steffan, S. A., Dharampal, P. S.,… More

Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter