Summary
マルハナバチ巣箱内微生物コンソーシア豊かにし、ハチの幼虫のため花粉を維持します。研究室と実験、フィールド ベースの次世代シーケンシングによるこの原稿は殺菌剤残留物変更、花粉マイクロバイ オームおよびコロニーの人口統計、コロニーに繋がること仮説をテストするために使用されるプロトコルについて説明します損失。
Abstract
生産者は、しばしば病は、殺菌剤残留物に蜂を公開に対する作物を保護するために花の中に殺菌剤散布を使用します。「蜂-安全」と考えられるが、花粉で殺菌剤の残留物が (蜂蜜とバンブレ蜂種) の蜂の減少に関連付けられている証拠があります。メカニズムは比較的知られていないまま、研究者は、蜂と微生物の共生が関与していることを推測しています。微生物は、保全や蜂の幼虫の栄養となる花粉の処理に重要な役割を再生します。微生物群集を変更すると、殺菌剤これらの微生物を介したサービスを妨害、ミツバチの健康危険にさらされる可能性が。本稿では、間接機構、殺菌剤のコロニーの低下を引き起こしている可能性を調査するために使用されるプロトコルについて説明します。殺菌剤処理の花に蜂を公開ケージの実験は既に殺菌剤がネイティブ熊蜂 (マルハナバチ インパチェンス) で深遠な植民地の損失を引き起こすという最初の証拠を提供しています。殺菌剤のフィールドに関連する線量を使用して、一連の実験は、殺菌剤にさらされた花粉群集動態の細かい説明を提供するために開発されています。次世代シーケンサーとメタゲノム解析、花粉マイクロバイ内真菌と細菌群集の構造の組成の変化を調べた。ここを開発した実験は、殺菌剤が花粉規定のマイクロバイにどのような影響を与えるかの機械的な理解を提供するために設計されています。最終的には、これらの調査結果は、間接的な経路、殺菌剤のコロニーの低下を引き起こしている可能性に光を当てる必要があります。
Introduction
管理し、野生ハナバチの種は、両方の自然と農業システムの1の主要な意味を持つ、広範な低下を経験しています。この問題の原因を理解するための努力にもかかわらず蜂蜜ミツバチ減少の要因はまだよく理解されて2,3,4。野生では、ネイティブのミツバチの特定の種、状況は悲惨な5,6になりました。産業としての農業と交差する、彼らの人口は、秋に引き続き、花粉 (世界生産の7の 35%) を必要とする作物に耐えるだろうとミツバチの人口を維持できない場合は、収穫を削減しました。
蜂蜜蜂の減少、農薬の露出、病気、および生息地の損失1,4,8,9,10など多くの潜在的な要因が関与しているとき比較的少しネイティブ蜂健康、または農業システムの近くにこれらのストレスのインタラクティブな効果について知られています。多くの現在の研究努力は、過去の研究を示していますが殺菌剤が蜂の低下で、記憶形成を損なうことによって役割再生も殺虫剤、(例えば、ネオニコチノイド11,12) に注力していきます嗅覚フロント13、巣認識14、酵素活性、代謝機能15,16,17。グローバルに、殺菌剤は満開で開花作物に適用し続けます。最近の研究は、蜂はよく戻るハイブに18、確かに殺菌剤残留物をもたらす、研究が含まれているテストのハイブ殺菌剤の残留19,20の大きい割合を示していることを記載しています。その殺菌剤の残留率が高い蜂蜜蜂幼虫死亡率21,22,23とコロニー内で「花粉の埋葬」の存在に関連付けられてそれ以上の仕事は明らかにするが、無毒微生物活性を欠いているし、栄養学的危害を受けた24です。殺菌剤「蜂セーフ」が考慮されて長いことにもかかわらず、証拠は今単独で殺菌剤への曝露ネイティブ バンブレ蜂種25マルハナバチ インパチェンスの深刻な植民地損失を引き起こす可能性が。
殺菌剤暴露と植民地との間の因果関係を確立するには、死亡率、これらの化学物質の手口を決定する必要があります。土26、堆積物中の27日、水生環境28菌をターゲットによって証明される、最も可能性の高い殺菌剤変更真菌豊富と花粉規定、それにより主要なコミュニティを呼び出す内の多様性をシフトします。細菌を強く支持可能性があります。真菌の競合他社や拮抗薬、病原性の細菌は比較的オフ、花粉規定の腐敗を促進する増殖できます。過去の研究は実証、微生物、酵母や糸状菌、特に蜂29,30,31栄養共生として、寄生虫および病原体32 からの保護 ,33, 花粉店の長期保存を提供。防かび剤、したがって、直接害を与えるかもしれないない未熟な蜂がこれらのサービスを提供するために必要な微生物群集を混乱させることによっておよび/または日和見主義の病原体や寄生虫12への感受性を高めることによって。食料生産の需要増加に伴い、世界中の作物がされて毎年殺菌剤を噴霧ブルームは、このような殺菌剤による影響の大きさを理解する必要性を強調する中に。
まで、主な知識のギャップに関するネイティブ蜂微生物生態学は次の質問によって表すことができる:どの程度は殺菌剤変更蜂花粉規定内の微生物コミュニティ?深く変えられた群集で花粉を消費の下流への影響は何ですか?これらの生態学的関係の質問を維持し、実験は、明らかに 1 の主な目標で開発された) 単独でその殺菌剤残渣ネイティブ蜂種; 重度のコロニーの低下を引き起こす可能性が2) 殺菌剤、および 3 によって変更されます花粉規定の微生物群集する程度) ミツバチの健康の深刻な変更された微生物群集による影響します。実験の目的は、実験室およびフィールド ベースの組み合わせを使用して上記の質問に対処するため定義されました。新式のメタゲノムと従来のフィールド観測の方法と一緒に分子技術を使用して、この研究はミツバチの健康に対する薬剤の潜在的な効果を一緒に作品を目指しています。
本研究の第一の目的は、殺菌剤暴露のみでネイティブ蜂種の間で重要な植民地の損失を引き起こす可能性を示すことです。大規模なフィールドのケージを含む研究は、マルハナバチ インパチェンス米国 (図 1図 2図 3) で、ユビキタス、豊富なネイティブ蜂のコロニーの成長に及ぼす殺菌剤曝露の調査に使用されました。殺菌剤処理じんましんであれば、低いフィットネスと非曝露ハイブと比較して非定型の人口統計、仮説。この実験から得られたデータは、花粉内の殺菌剤の残留物がネイティブ バンブレ蜂種25で深遠な植民地の損失の唯一の原因をすることができますを示す、この仮説をサポートされています。本研究の第二の目的は、殺菌剤の曝露に花粉マイクロバイの応答を調査するためです。それは、殺菌剤にさらされる花粉規定内微生物の群集構造が異なる未処理花粉のこと仮定されます。真菌の豊かさと多様性を期待して、大幅に低下する、細菌および/または単一の支配的な真菌種可能性が大きくなります他の競合する菌の有無のチェック。一連の生体内試験、メタを使用してこれらの微生物群集組成の変化を分析します。
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Protocol
1。 バンブレ蜂コロニーの成功を使用してフィールド ケージ実験に殺菌剤曝露の効果を調べる
フィールドで- を 10 セット
- メッシュ ケージは麦が植えられました。各ケージの周りトレンチを掘るし、蜂が逃れることができないように地面にメッシュ ケージの 4 つすべてのエッジを掘る。ハチ (例えば ソバ、ルリヂサ、ミヤマナズナ属、コスモス、ひまわり) を知られている、鉢植えな顕花植物とケージをストック ( 図 2).
- は、ブルームのクローバーのシングル トレイ (36 cm × 42 cm) とケージを補足します。スペース約 2.5 m x 1 m 単調な生活残りのケージ領域を麦でケージの 1 つのコーナー内の花のリソースをクラスターします 。 植民地、各含んでいる労働者と単一の女王、治療
- ランダム熊蜂を割り当てる (殺菌剤あり/なし、N = 治療当たり 5 植民地、植民地 10 合計)、フィールド ケージ内配置 (N = 1/ケージ) 29 日 (6 月 23 日-7 月 21 日 2014).
- オリエント コロニー ボックスその植民地 ' s 開口部がミツバチをナビゲーションの最適の条件を提供する南を指します。砂糖水の膀胱、蜜可用性を補完するハイブ ボックス内に配置を持つコロニーを補助します 。
- 適用草花 5 殺菌剤治療中にフィールドに関連するレベル (20 g/L) クロロタロニル ベース殺菌剤は手を使って研究 (一日 0 や 13) 中に 2 回農薬噴霧器を開催しました。花の表面 ( 図 3) にさらに液体の付着がありませんその花を均一にコートします 。
- ケージ調査の結論で、ケージから B. インパチェンス 植民地を手で削除、20 分-20 ° C のフリーザーに置くことによってじんましんをクールな
- を取り外して滅菌鉗子を用いたミツバチ幼虫、蛹、大人の女性の数を記録 (私 。e. 受動的探索担当)、および大人の男性。母女王、幼虫、蛹、(すなわち 受動的探索担当)、成人女性、成人男性の乾物重を記録分析用天秤を使用します 。
2。へまをする蜂の巣室を用いた In Vivo 試験の花粉対策で微生物に殺菌剤影響を調べる
標準を使用して細かい粉に- 廃タイ市販購入した花粉研究所ボールミル。粉末花粉を滅菌するには、紫外線の下で一晩蒸発することができます 70% エタノールに浸漬します。汎用寒天に ~0.5 mg をメッキすることによって花粉の不稔を確認します。
- 乾燥、滅菌ピペットを使用して滅菌の花粉を追加殺菌剤の投与量を関連するフィールド: 14.3%; propiconazole トリートメントの 22.9% でアゾキシストロビン (0.74 μ L と 0.65 μ L それぞれ/日ハイブ/)。滅菌を木の棒でよく混ぜ 。
- 場所 6 実験ハイブ (n = 3 の各コントロールと治療のため) で部屋の温度で維持されるクリーンで衛生研究所ベンチトップ。毎日花粉 34 , 35 防かび剤 (トリートメント) 用または (制御用) 標準的な無菌技術を使用してフード内の滅菌水と混合の 4.27 g の重量を量ます。
- トラップ ドアの外側のじんましん、段ボール箱の側面によって提供されるを使用してハイブ内の花粉を紹介します。毎週滅菌糖溶液とハイブを補足します。4 週間以内に政権を与え続ける 。
- 研究室での研究の結論で滅菌鉗子とへらを使用してひな部屋内に含まれる花粉規定を 20 分こすり-20 ° C のフリーザーに置き、滅菌ストレージ管場所ハイブをクールします。-80 ° c. の数と労働者と開始時と実験 (ステップ 1.7) の最後の女王の母の重量のレコード ストア 。
- 市販 DNA の隔離を使用して花粉規定サンプルからの DNA の分離キット (詳細については表を参照してください).
- 抽出への花粉提供の 0.25 g チューブ、簡単にミックスする渦を追加します 。
- は、50 μ L/サンプルについて十分な脱イオン蒸留水に 200 mg/mL のリゾチーム ソリューションを行います。完全にフォーム ソリューションを積極的に振る 。
- は、リゾチーム溶液 50 μ L を加える、それのサンプルを抽出管と複数回の反転でよく混ぜます。37 の ° C の水浴中で 10 分間のチューブを孵化させなさい。沈殿物が形成されている場合熱 60 ° C まで使用する前に溶解するソリューションです 。
- 追加 70 μ L 水溶液溶解抽出管にソリューションの保護、テープでフラット ベッド渦パッドの水平と 30 10,000 x g で 10 分間遠心分離渦管常温 s.
- は、きれいな 2 mL コレクション チューブに上清を転送します。4 ° C の氷浴で 5 分で 5, 加温のタンパク質沈殿物溶液、渦の 250 μ L を追加します
。 注: は、500 μ L の上清を 400 μ L の間期待してください。上清はまだいくつかの粒子を含めることができます 。
- 10,000 × g で 1 分間室温でチューブを遠心し、上清の最大 600 μ L をクリーン 2 mL 管に転送します。水性阻害剤除去ソリューション、簡潔に、渦の 200 μ L を追加し、, 5 分遠心 10,000 x g に 1 分間室温でチューブはクリーン 2 mL コレクション チューブに上清の 750 μ L まで転送のための 4 ° C で 。
- 培養上清と 5 の渦に水性バインド ソリューションの追加 1200 μ s. スピン フィルター、および 10,000 × g で遠心する室温で 1 分に清約 675 μ L をロードします。流れを破棄します 。
- 繰り返す 2.4.7 2 回。
。 注: 処理の各サンプルに対して 3 つの負荷の合計が必要です 。
- 追加 500 μ L エタノール、室温で遠心する 30 の 10,000 x g に s、流れを破棄し、再びクリーン 2 mL 採取管の g. 場所スピン フィルター x 10,000 で 1 分間室温で遠心分離します 。 フィルター膜の中央に
- 追加 100 μ L の溶出バッファー。30 間室温で遠心 10,000 x g に s スピン フィルターを破棄します。ストアは、-20 ° C から-80 ° C の間に DNA を集めた
- シーケンスの DNA を分離使用。
- 定量化するため、蛍光分析で 2 ng/μ L の DNA の分離を正規化します。
28 s の相対的な量を比較する抽出されたサンプルごとに 3 通
- 準備反応 (工場)、その (真菌)、分析および各花粉規定サンプル 36 の 16S (細菌) コンポーネント。各反作用に 10 が含まれていることを確認総 DNA、非対称シアニン染料ベースのマスターの組合せの 2 x および前方および逆のプライマー組 28KJ/28 b 37 植物と真菌 DNA の its 1 領/ITS5.8R 各 2.5 μ の ng 38.
- 増幅 DNA の次のパラメーターを使用して: 50 ° c、2 分初期変性 95 ° C で 2分前の変性のサイクルの 40 (15 98 ° c、15 s 58 ° c、60 s s 72 ° c)、融解曲線が続く 。
- 準備 2 ステップ、入れ子になったターゲット 16S rRNA 次世代シーケンシング ライブラリを使用して PCR のプロトコル V3 ・ V4 の可変領域と ITS/5.8 s rRNA スペーサー領域。
各プライマーのマスター ミックス × 2
- 追加 12.5 μ L DNA の 5 pmol。(16 s またはその; の表 1 を参照してください)、各地域別の反応を確認します。前述の 39 , 40 遺伝子特定シーケンスにシーケンサー固有のアダプター突出部分塩基配列を追加する領域特異的プライマーを変更します 。
- 次のパラメーターを使用して初期の増幅を行う: 3 分初期変性 95 ° c、25 サイクル (30 95 ° c、30 秒 55 ° c、30 秒 s 72 ° c)、72 で 5 分最後の拡張 ° C
- 次最初の増幅、電気泳動の移動性によってライブラリのサイズ、および量を確認、ボリューム固相リバーシブル imm x 1 を使用してきれいに残存プライマーと反応試薬を削除する obilization ビーズ。プール 16S、各サンプルの単一私アンプリコン プールを作成する定量的その amplicons 。
- は、シーケンサー特定アダプターを追加し、次のプライマー (表 1 を参照) を使用して特定のデュアル インデックスのサンプルします。各プライマーのマスター ミックス × 2 5 pmol に増幅された DNA の 2.5 μ L を追加します。次のパラメーターを使用してライブラリの増幅を実行: 3 分初期変性 95 ° c、8 サイクルの (30 95 ° c、30 秒 55 ° c、30 秒 72 ° c s)、72 で 5 分最終的な拡張 ° C
- 次の PCR、1 x 量の固相リバーシブル固定化ビーズを使用してクリーンな完成のライブラリ。電気泳動の移動性と蛍光分析、それぞれ使用して完成したライブラリの質と量を評価します。ライブラリに 2 μ M およびシーケンスの前にプールを標準化します 。
- プラットフォーム全体私アンプリコン 41 をカバーする適切な長さと、セカンダリの PCR で追加アダプターに似てに次世代シーケンスを実行します 。
- 定量化するため、蛍光分析で 2 ng/μ L の DNA の分離を正規化します。
28 s の相対的な量を比較する抽出されたサンプルごとに 3 通
- シーケンス アノテーションと微生物組成分析。
- コンバインすべてシーケンスされたライブラリの単一のコンティグにシーケンス データをペア ・ エンド (R1 及び R2)。R1 と R2 の両方のファイルをマージするには、ライブラリごとに単一の fasta ファイルが生成します
。 注: この手順およびプロセス (特記されない場合は) 下記 Mothur バージョン 1.38.0 38 で実行されます 。
- 画面のあいまいな拠点、予期しない長いシーケンス、および長いホモポリマーを削除する各 fasta ファイル
。 注: スクリーニング、およびシーケンス除去のパラメーターは、maxambig = 0、maxlength = 600、および maxhomop 両方の遺伝子の 8 を =。同一のシーケンスを削除が、個別に、すべてのライブラリ (別名 Mothur でカウント表) contingence テーブルを保持します 。
- シルバ データベース バージョン 123、に対して遺伝子 16S ライブラリとその団結データベース 42 に対して遺伝子 ITS ライブラリの一意のシーケンスを配置します
。 注: シーケンスは、属のレベルに国レベルから注釈する必要があります。- クラスターがシーケンスを配置後、diff を使って関数 pre.cluster = 5 とキメラを削除します 。
- 王 43 (遺伝子 16S) のシルバと (遺伝子 ITS) のためには、「その団結分類ファイル (80% のカットオフ値) に基づいてメソッドを使用してシーケンスを分類します。
- は Mothur の分類プロセス中に生成された contingence テーブル (1 つの遺伝子) R 44 に読み込みます。各分類レベルで、さらに微生物群集変化分析ライブラリごとの相対的な豊かさを取得します
。 注: 各分類レベルで一緒にマージ分類相対的な豊かさはすべての実験の繰り返しの 2% 未満と 。
- コンバインすべてシーケンスされたライブラリの単一のコンティグにシーケンス データをペア ・ エンド (R1 及び R2)。R1 と R2 の両方のファイルをマージするには、ライブラリごとに単一の fasta ファイルが生成します
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Representative Results
ケージ調査:
ケージの実験から得られたデータは、マルハナバチのミツバチのコロニーが殺菌剤の暴露に重要な応答を持っていたことを示した。殺菌剤処理ハイブ生産コントロールのじんましんよりも大幅に少ない労働者 (12.2 ± 3.8、平均 ± SE) (43.2 ± 11.2,= 6.8 F1, 9, p = 0.03) (図 4)。さらに、殺菌剤処理ハイブ (0.91 g ± 0.15) の蜂バイオマスはコントロール ハイブ (2.36 g ± 0.55; よりかなり低いF1, 9 = 8.3, p = 0.02)。殺菌剤処理のハイブに下げられたバイオマスのこのパターンが母女王の間で認められました。コントロール ハイブ (0.27 g ± 0.01; のクイーンズブレイドより大幅に低いバイオマス (0.14 g ± 0.04) は、殺菌処理したハイブのクイーンズZ = 2.5 p 0.01)。ただし、殺菌剤暴露しなかった治療で幼虫、蛹と男性の数を与えません。離散生活段階 (幼虫、蛹、労働者、および成人男性) と幼虫、蛹、労働者の個々 の重量のバイオマスは殺菌剤処理間での任意の違いを示さなかったし、ハイブを制御します。
研究室での研究:
実験室の実験から得られたデータは、その殺菌剤の露出の前にコントロールと殺菌剤処理ハイブは統計的に同等の平均労働者数をいた示されている (ハイブを制御 = 28.0 ± 3.1; 殺菌剤処理ハイブ = 31.67 ± 2.0; n = 3各) と妃の重量 (ハイブを制御 = 0.77 g ± 0.04; 殺菌剤処理ハイブ = 0.74 g ± 0.01)。しかし、研究の終わりに、ワーカー数有意コントロール ハイブ (67.67 ± 4.3) 殺菌剤処理ハイブ (45.33 ± 3.8) と比較して (t4 = 3.89、 p = 0.01)。労働者の人口コントロール ハイブ ハイブの殺菌治療 〜 45% と比較 〜 150% 増加しました。同様に、女王の母の最終的な重量はハイブ (0.76 g ± 0.02) ~ 35% と比較して減少殺菌剤処理ハイブ (0.49 g ± 0.16) 制御で比較的変わらずに残った。一緒に取られて、これらの結果は、以前に公開した結果25と一致しているし、殺菌剤暴露より少ない労働者数によって証明されるように植民地フィットネスを影響を受けるし、女王の母の重み (図 5) の減少を示します。
ははっきりした違いから収集した微生物殺菌剤処理し、じんましん (図 6) を制御、花粉規定のメタゲノム解析が示されます。減少した (> 95%) 殺菌剤処理ハイブに Enterobacteriales よく分離 Streptomycetales の相対的な豊富に。興味深いことに、両方のこれらのグループはの抗真菌活性と花粉保存30,45バンブルビー ハイブ環境内における役割のため知られています。順序節足動物46の一般的な病原体を含むリケッチア目の細菌のメンバー処理殺菌剤ハイブに多くの大きい豊かさを示した。Eurotiales と Sordariales、注文に属する菌類の低い豊かさと Capnodiales と Ascosphaerales コントロール ハイブ (図 7) と比較しての注文の高い豊富な殺菌剤処理ハイブがあった。細菌やカビのため、期待どおりにシャノンの多様度指数(H)と均一性(E)低かった殺菌剤処理のハイブのコントロールと比較してこれらの違いは統計的に有意ではなかったが (細菌: Hハイブを制御1.25 ± 0.3 H殺菌剤処理のハイブを = 0.82 ± 0.2、電子制御ハイブを = = 0.46 ± 0.1 となります。電子殺菌剤処理ハイブ= 0.31 ± 0.1 となります。菌: Hコントロール ハイブ0.99 ± 0.3 H殺菌剤処理のハイブを = = 0.72 ± 0.4、電子制御ハイブ= 0.57 ± 0.2電子殺菌剤処理ハイブ= 0.42 ± 0.2)。このようなコミュニティの代謝と機能への影響を詳述したシフトがこの研究の範囲を超えていた、コロニー数と重量データと組み合わせる, 示唆された殺菌剤曝露がによって植民地健康の低下に影響を与える可能性蜂と花粉マイクロバイ共生を中断すること。幼虫の生存に影響を与える特定の微生物グループの役割をさらに調査花粉マイクロバイ健康なミツバチの人口を維持する上での役割をよりよく評価する勧めします。
図 1:マルハナバチ インパチェンス巣中です。ひなセルに傾向がある労働者の高解像度画像。ひなセルは、任意の時点でいくつかの卵や幼虫を含めることができます。幼虫の開発室に定期的に導入された花粉規定にフィード。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ミツバチのコロニーの家に建てられた大規模なフィールド ケージ。各メッシュのケージ (N = 10) 商業的購入と貯蔵されたマルハナバチ インパチェンスハイブとしてブルームの植物種蜂を引き付けるために知られています。花はケージの隅に貯蔵および残りの領域だった麦草植生します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 最近溶射ひまわりに殺菌剤残渣。殺菌剤のフィールド関連する線量は、0 と実験の 13 日に散布しました。殺虫剤噴霧器を使用して、花均等にコーティングされた殺菌剤溶液で採餌蜂との直接接触を避けるために夕暮れ/夜。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ケージの実験でマルハナバチの残留影響します。殺菌剤残留花粉にさらされたバンブレ蜂コロニー コロニーのサイズ (縮約の大幅な下落を展示大人の女性の豊かさでイオン) 1 カ月にわたって。誤差範囲を表す ± 1SE。p < 0.05。この図が Bernauerらから変更されました。25.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 実験室の実験ではマルハナバチの残留影響します。殺菌剤処理した花粉にさらされたバンブル ミツバチのコロニーは、コロニーのサイズ (大人の労働者の削減) が大幅に減少、1 カ月にわたって女王の母の重量の減少を展示しました。誤差範囲を表す ± 1SE。p = 0.03。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 順ランクで真菌と細菌の多様性のメタゲノム分類の円グラフです。花粉規定サンプルの (、) 16 s ・ (b) に基づいてその分類に基づく解析は、コントロールと殺菌剤処理のハイブから収集されます。コントロール ハイブより高い多様性と微生物分布の均一性を示した。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 殺菌剤暴露への応答の細菌そして菌類の順序ランク相対量変化率。微生物を使用して (、) 16S のメタゲノム分類と ITS (b) に基づいてプライマーこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| プライマー | プライマーの種類 | プライマー シーケンス | |||
| 28KJ/28 B | 工場 | GGC GGT AAA TTC CGT CC/ | |||
| CGT CCG TGT TTC AAG ACG | |||||
| ITS 1 領/ITS5.8 | 真菌 | TCC GTA GGT GAA CCT GCG G/ | |||
| ギャグ ATC CGT TGT TGA AAG TT | |||||
| フォワード/リバースの 16s | 入れ子になった細菌 | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTACGGGNGGCWGCAG-3'/ | |||
| 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3' | |||||
| ITS1F プライマー/ITS4 | 真菌ネスト | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCGTAGGTGAACCTGCGG - 3' | |||
| 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC - 3' | |||||
| アダプター プライマー | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC [55555555] ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3' |
||||
| 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [77777777] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3' |
|||||
表 1: プライマーと DNA の増幅に使用されるプライマー シーケンスの一覧。参照のテキストを参照してください。
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Discussion
ミツバチの健康に対する薬剤の効果への調査は、害虫管理戦略の流面を残っています。ミツバチ減少の潜在的な要因を明示的に分離する相補的な技術のスイートを使用して、この知識のギャップを埋めることを目指します。計画、理論的根拠、およびこれらの実験のレンダリングは次のとおりです。
この人口統計学の分析を損なわれてしまいますので、ケージを用いた実験のメッシュを脱出する蜂が許可されないことを確認することが重要です。また、人工の巣は雨や直射日光から保護するために十分な断熱材を持つことが重要です。殺菌剤、巣に直接スプレーしないようには注意が必要があります。植民地は、蜜集めを補完し、脱水を防ぐために砂糖水膀胱が提供されなければなりません。
実験室ベースの飼育実験、花粉の食事を準備するときに、汚染を防ぐために厳格な無菌条件を維持しなければなりません。市販購入した花粉を粉末が必要し、UV 殺菌使用する前に。ハイブ衛生は、パントリー蛾やゴキブリなど余分な寄生虫からの侵入を防ぐために維持する必要があります。流体の膀胱は、脱水症状を防ぐために滅菌の糖溶液で補わなければなりません。治療前国勢調査のため注意が必要、ストレスに蜂過剰な処理し、長期のため、hived の外にそれらを保つことによって期間。
DNA の収穫は、年齢と出発物質の種類に依存すると、DNA の抽出と増幅の新鮮なまたは冷凍設備サンプルだけが使わなければなりません。としてこれは DNA の収穫をより低く、DNA の抽出のサンプルの重量は 0.25 gm を超えない。ゲル電気泳動による DNA 収量を定量化する必要があります。QPCR 反応効率増幅47を確保するために進む前に隔離された DNA の電気泳動先行の定量化が欠かせません。
メタゲノム解析の微生物ダイナミックのより包括的な解析 (シーケンス間の相違を許容量をリラックス) で注釈付きシーケンスの量を制限して、として taxonomic グループの数を減らすことで入手可能同様の相対的な豊かさはかなり低いものの結合 (< 2%)。
保守的なサンプル サイズ (N = 5 両方殺菌剤扱われ、未処理のケージ研究ハイブ) 最小となる未来の調査以上のレプリケーションを使用してデータの差異を膨らませることができます。高い解像度と統計的検出力を結果に追加するには、ミツバチのコロニーになります censused であると重量を量られた殺菌剤曝露前後。長時間ケージの実験を実行している追加の応答変数として役立つことができる新しい女王の生産になります。現在のプロトコルのように変更、将来研究ハイブの動態について詳細を提供します。
花粉の疎水性の性質は、水とその効率的な混合を躊躇させます。粉砕し、微粉末に花粉粒をふるい、混合プロセスに役立ちます。花粉粉末の量は、所望の整合性を達成するために調整できます。流体の有効成分は、月下にも配信の均一な分布を達成するために、(水または殺菌剤) を徹底的にミックスするには、注意が必要です。
過剰な DNA は PCR 反応を抑制することが、としては、サンプル必要がありますこれは DNA、歩留まりを下げる鋏として 0.25 g. 過剰なボルテックスを避けるべきより多くの重量を量るないをお勧めします。低 DNA の収穫には、換散バッファーへの長期暴露の結果することができます。葉緑体 DNA48の非特異的増幅を抑える細菌プライマーは 16S rRNA の V7 ・ V9 地域から選択できれば。さらに、18 s リボソーム RNA 遺伝子などの他の遺伝子の塩基配列決定は、殺菌剤使用率人口変更と同様に、花粉、微生物の多様性のよりよい理解を提供できます。
Mothur で処理するライブラリの量を与え、計算時間はかなり高いことができます。互いのシーケンスを比較する場合、シングルトンを削除 (コンピューティング リソースが限られている場合は、キメラろ過の前に外す) 運用上の分類単位の計算に必要な時間が大幅に短縮することができます。
ケージの実験 (とは対照的にできるように景色を渡って広く飼料)、蜂の自然な飛行範囲を閉じ込めるし、は明らかだこのような制限を応答変数に影響を与える程度。制御そして処置のケージは、生物的・非生物的変数の同じ範囲を体験、じゃないロジスティック各ケージ内微小環境をコントロールすることが可能。
コミュニティ内で微生物相互作用の真の範囲は、あまり複雑な実験的な試行を通じてレプリケートする複雑です。可能性が高いデータは、花粉規定内微生物多様性のサブセットを文書化、殺菌剤の有無で細菌やカビの間勝つ可能性がありますインタラクティブな効果に最初の洞察力です。
49のシーケンスの整列に代替データベースを使用または花粉マイクロバイのより広い視野を提供できる花粉細菌の多様性50に基づいて機能の代謝状態を予測します。最終的より良い薬剤散布後微生物の代謝と機能のダイナミックを特徴付ける、花粉マイクロバイの全ゲノム配列が必要です。
市販購入したハイブを使用してケージを用いた実験は、半制御設定では応答の変数を測定するための最高のフレームワークの 1 つを提供します。ミツバチの自然の生態 (採餌効率、社会構造、子孫ケア) 最小限の変質を引き起こし、工夫と人工環境実験室の中の処理マニュアルによって紹介されたストレスを最小限にケージを用いた実験実験。
我々 の知る限り、まだ実施されているないバンブレ蜂の花粉規定内の微生物群集の動態に対する薬剤の効果を評価します。殺菌剤への暴露は、1 つまたは複数の敏感な種、菌類と細菌の生態学的な休戦を中断することを排除可能性があります。本稿るつぼとしてフィールドと研究室での試験を使用して、これらの相互作用を再生する、常駐微生物種の根絶できる可能性がありますに妥協ミツバチの健康を向ける花粉マイクロバイの生態系のバランスを変質者を示す。
希釈など標準メディア キャプチャ上のめっきのカルチャ依存テクニック与えられた環境から微生物のほんの一部。これは微生物の多様性、総過少につながるし、培養不能な微生物が検出されない51を行くことがあります。広範な微生物を研究するには、科学者より包括的かつ包括的、メタゲノム解析、次世代シーケンサーなどのカルチャに依存しない技術に頼らなければなりません。本研究はこれらの強力な分子技術から大きく描画、だけで伝統文化に基づく技術によって提供されるよりも花粉マイクロバイにより高い解像度を取得を目指しています。
本研究の結果は、殺菌剤にさらされるバンブル ミツバチのコロニー内労働者数の深遠な損失を明らかにしました。成功するバンブルのミツバチのコロニー、労働者が十分なリソースを提供し気に母女王と幼虫を開発するため特に必要があります。植民地の目標は、できるだけ多くの娘-クイーンズは夏の終わりによって作り出すことができるようなリソース キャプチャ (花粉や花の蜜) を最大化します。健康的な娘-クイーンズは、植民地のための適性の測定です。労働者で、大幅に削減し、効果的の下に潜り込む翌年のクイーンズを生産するコロニーの能力。本研究では労働者数が有意に減少した、するだけでなく、殺菌剤から母クイーンズ治療おそらく月下で不十分な食糧補給の結果として、下のバイオマスは、じんましん。花粉規定内で微生物の相互作用の複雑さを考えると、それはこれらのパターンに貢献する細菌とカビの正確なインタラクティブな効果を識別するは難しい。ただし、レプリケートされたと繰り返し実験から得られた結果前述のように、洞察を提供する重要なシフトの共生微生物群の間に (かどうかを競争力のある、相利共生、または共生) 異物のストレス応答その下流に及ぼす花粉マイクロバイ。
強力な分子ツールを使用しては、花粉マイクロバイの生態学的複雑さをよりよく解決できます。予備的な理解では、自然に発生する細菌やカビ、総称してコロニーのフィットネスを維持するために貢献の茄多を明らかにします。特に、花粉規定から分離された酵母は蜂の幼虫の開発のために重大である、殺菌・発酵のプロパティに知られています。そのような生態学的な連合蜂の花粉マイクロバイと相利共生の高度を示唆しています。花粉-規定、したがって、微生物コミュニティの機能の重要な役割の構成員の耕作によってもたらされる創発的多様性効果を表します。これらのキーの共生の不在、不明度に危険にさらされるに花粉規定が表示されます。この方向で継続的な作業は可能性が高いこれらの微生物の機能の多様性を説明して、蜂共生としての役割の正体を暴露します。
最近の研究では、蜂19,24,52,53,54には無害であると殺菌剤の概念を否定しています。本研究の目的は、蜂、殺菌剤使用とミツバチ減少の間の因果関係をそれにより照明の殺菌剤の影響を駆動メカニズムを分離することです。蜂と微生物の共生が花粉で殺菌剤の残留物が大幅に変更されている概念のまわり仮説センター。最終的には、殺菌剤の表示および農業および都市環境で使用されるどのように、この作品はフレーム再。現在のグローバル送危機の光研究提案は農業生産の実践に関連ネイティブ蜂生態に関する新しい知識を生成します。殺菌剤は、花の中に作物にアプリケーションを制限する規制から除外される効果的に最後の農薬グループを残っています。その結果、マネージ コードと野生のミツバチは、殺菌剤に一貫して公開されます。文献の成長するボディは、殺菌剤はありませんが高用量で、接触して蜂に致命的な露出は高い致死21につながる、非常に有害、ハチの動作を変更を示唆しています。この作品は、殺菌剤は花粉の害を与えているカ所を照らすが期待されます。さらに、この研究は賢明な害虫管理ポリシーの基礎を形作る、最高の経営慣行の栽培者に通知します。この作品は、農薬の法律や規制に影響を与える可能性があります改善農薬噴霧のためのガイドラインを提供することに尽力されます。これらの調査結果は開花植物が花粉を集めることによって訪問は、任意のマネージ生態系に関連するより広く、昆虫。蜂特定の世界的な予測と受粉サービスされて非常に高い55,56, この作品は、ミツバチの人口の減少を軽減できます、潜在的な影響は実質的になります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者に感謝に関する技術的な支援を提供するため増幅とシーケンス処理設備とサービス、ケイトリン カールソン、ジェニファーのコツ、ジェイク オットー、マックス Haase を提供するウィスコンシン大学バイオ テクノロジー センター DNA シーケンスの施設分子分析。この作品は、米国農務省農業研究サービス充当資金 (現在研究情報システム #3655-21220-001) によって支えられました。これ以上のサポートは (グラント号下の国立科学財団によって提供されました。DEB-1442148)、DOE グレイト レイクス バイオ エネルギー研究センター (科学 BER デ-FC02-07ER64494 の DOE のオフィス)、および米国農務省農業研究所と農業 (ハッチ プロジェクト 1003258)。C.T.H. は医科学とそれぞれピュー慈善信託とアレクサンダー ・ フォン ・ フンボルト財団によってサポートされて、アルフレッド Toepfer の教員仲間でピュー学者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Natupol Beehive | Koppert | USRESM1 | 16 hives |
| Propiconazole 14.3 | Quali-Ppro | 60207-90-1 | Propiconazole 14.3% |
| Abound | Syngenta | 4033540 | Azoxystrobin 22.9% |
| Chlorothalonil | Syngenta | 3452 | Fungicide used for trials |
| Pollen granules | Bee rescued | B004D5650C | 3X 16oz bottles, pollen for trials |
| Bacterial strains for inoculation | Currie Lab | ||
| Yeast strains for inoculation | Hittinger lab | ||
| Primer pairs | UW Biotech Center | ||
| DNA Isolation Kit | Mo Bio | 12830-50 | Commercial DNA isolation kit |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification tool |
| Select Master Mix for CFX | Thermo Fisher | 4472952 | Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye. |
| Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855196 | Instrument used for PCR amplification |
| PCR Clean-Up Kit, | Axygen | 10159-696 | Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes |
| DNA 1000 Kit | Agilent | 5067-1504 | Used for sizing and analysis of DNA fragments |
| MiSeq Sequencer | Illumina | Used for next-generation sequencing | |
| Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) | VWR |
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