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Environment

Empírico, metagenómica y técnicas computacionales iluminarán los mecanismos por los cuales fungicidas compromiso Pathología Apícola

Published: October 9, 2017 doi: 10.3791/54631

Summary

Consorcios microbianos en las colmenas de la abeja bumble enriquecen y conservan el polen para las larvas de abeja. Utilizando la siguiente secuencia de generación, junto con laboratorio y experimentos en el campo, este manuscrito describe protocolos utilizados para probar la hipótesis de que residuos del fungicida alteran el microbioma del polen y datos demográficos de la Colonia, en última instancia conduce a la Colonia pérdida.

Abstract

Los productores a menudo usan aerosoles fungicida durante la floración para proteger los cultivos contra las enfermedades, que expone a las abejas a los residuos de fungicida. Aunque se considera "abeja-safe", hay creciente evidencia que residuos de fungicida en el polen se asocian con disminución de abeja (para especies de miel y bumble bee). Mientras que los mecanismos siguen siendo relativamente desconocidos, los investigadores han especulado que la simbiosis de abeja-microbio participan. Microbios desempeñan un papel fundamental en la preservación y procesamiento del polen, que sirve de nutrición para larvas abejas. Alterando la comunidad microbiana, es probable que los fungicidas interrumpen estos servicios mediada por el microbio y así comprometen la salud de las abejas. Este manuscrito describe los protocolos para investigar los mecanismos indirectos que fungicidas pueden causar disminución de la Colonia. Experimentos de jaula exponiendo las abejas a las flores tratadas con fungicida ya han proporcionado la primera evidencia que fungicidas causan pérdidas de Colonia profunda en un nativo de abejorro (Bombus impatiens). Utilizando dosis relevantes de campo de fungicidas, han desarrollado una serie de experimentos para proporcionar una descripción más fina de la dinámica de la comunidad microbiana de polen expuesto fungicida. Cambios en la composición estructural de ensamblajes micóticas y bacterianas en el microbioma del polen son investigados por secuenciación de próxima generación y análisis de metagenómica. Experimentos desarrollados en el presente documento han sido diseñados para proporcionar una comprensión mecanicista de cómo fungicidas afectan el microbioma de provisiones de polen. En definitiva, estos resultados deben arrojar luz sobre el camino indirecto a través del cual fungicidas pueden causar disminución de la Colonia.

Introduction

Administrado y especies de abejas silvestres están sufriendo descensos generalizados, con importantes consecuencias para ambos sistemas naturales y agrícolas1. A pesar de los esfuerzos para comprender las causas de este problema, los factores que impulsan la disminución de abejas de miel no son todavía bien entendido2,3,4. Para algunas especies de abejas silvestres, nativas, la situación se ha convertido en grave5,6. Si las poblaciones de abejas no se puede sostener cuando intersectan con la agricultura industrial, su población seguirá cayendo y los cultivos que requieren polinizadores (35% de la producción mundial7) perdurará reduce las cosechas.

Mientras que muchos factores como la exposición a los pesticidas, enfermedad y habitat pérdida1,4,8,9,10 han sido implicados en la disminución de la abeja de miel, relativamente poco se sabe sobre el efecto interactivo de estos estresores sobre la salud de las abejas nativas, dentro o cerca de los sistemas agrícolas. Muchos esfuerzos de investigación actuales seguirán centrándose en insecticidas, (p. ej., neonicotinoides11,12), aunque la última investigación indica que fungicidas también pueden desempeñar un papel en la disminución de la abeja por alterar la formación de la memoria, recepción olfativa13, nido de reconocimiento14, actividad enzimática y las funciones metabólicas15,16,17. A nivel mundial, fungicidas siguen ser aplicadas a los cultivos de flores durante la floración. Estudios recientes han documentado que las abejas traen comúnmente residuos de fungicida a la colmena18, de hecho, estudios han demostrado una gran proporción de colmenas probado contiene fungicida residuos19,20. Otro trabajo ha revelado que residuos de fungicida se asocia con altas tasas de los miel abeja mortalidad larvaria21,22,23 y la presencia de "polen entombed" dentro de las colonias, que aunque no tóxicos, carece de actividad microbiana y es nutricionalmente comprometidos24. A pesar del hecho de que fungicidas han sido considerado como "abeja-safe", ahora existe evidencia que la exposición a fungicidas solo puede causar pérdidas severas de la Colonia en una especies de abejorro nativo, Bombus impatiens25.

Para establecer causalidad entre exposición de fungicida y la Colonia mortalidad, el modus operandi de estos productos químicos deben determinarse. Como se evidencia en los suelos26,27de sedimentos y ambientes acuáticos28, dirigiéndose a hongos, fungicidas más probables alteran abundancia hongos y diversidad dentro de las disposiciones polen, invocando así una comunidad importante cambio pueden favorecer fuertemente a las bacterias. Sin hongos competidores o antagonistas, ciertas bacterias patógenas pueden proliferar relativamente sin control, facilitando la descomposición del polen-disposiciones. Más allá de la investigación ha demostrado que microorganismos, especialmente levaduras y hongos filamentosos, sirven como simbiontes nutritivos para las abejas29,30,31, protege contra parásitos y patógenos32 ,33y preservación a largo plazo de los almacenes de polen. Fungicidas, por lo tanto, indirectamente perjudiquen las abejas inmaduras interrumpiendo la comunidad microbiana necesaria para prestar estos servicios o incrementando la susceptibilidad a patógenos y parásitos oportunistas12. Con el aumento de las demandas en producción de alimentos, cultivos en todo el mundo están siendo rociados cada año con fungicidas durante la floración, lo que subraya la necesidad de comprender la magnitud de tales efectos inducidos por el fungicida.

Hasta la fecha, las lagunas de conocimiento primaria relativos a la abeja nativa microbiana ecología puede ser representada por las siguientes preguntas: ¿en qué medida cambia fungicida la comunidad microbiana dentro de polen de abeja-disposiciones? ¿Cuáles son los impactos aguas abajo de consumir polen una comunidad microbiana profundamente alterada? De conformidad con estas preguntas ecológicamente pertinentes, experimentos fueron desarrollados con los objetivos primarios de revelar 1) que residuos de fungicida solo pueden causar disminución severa de la Colonia en una especie de abeja nativa; 2) el grado en que las comunidades microbianas en las provisiones de polen son alteradas por fungicidas y 3) cómo una comunidad microbiana severamente alterada afecta salud de las abejas. Se definieron los objetivos experimentales para hacer frente a las preguntas anteriores utilizando una combinación de experimentos basados en laboratorio y campo. Mediante metagenómica de vanguardia y técnicas moleculares junto a métodos tradicionales de observación del campo, esta investigación tiene como objetivo juntar los posibles efectos de fungicidas en la salud de las abejas.

El primer objetivo de este estudio es demostrar que fungicida exposición solo puede causar pérdidas significativas de la Colonia entre especies nativas. Un estudio con jaulas de campo grande fue utilizado para investigar los efectos de la exposición de fungicidas sobre el crecimiento de colonias de Bombus impatiens, una abeja nativa ubicua, abundante en los Estados Unidos (figura 1, figura 2, figura 3). Fue presumido que colmenas tratadas con fungicida presentaría menor aptitud y Demografía atípica comparado con colmenas no expuestos. Datos obtenidos de este experimento apoyaron esta hipótesis, demostrando que residuos de fungicida dentro de polen pueden ser la única causa de las pérdidas de Colonia profunda en un nativo bumble bee especie25. El segundo objetivo de este estudio es investigar la respuesta del microbioma del polen a la exposición de fungicida. Se presume que la composición de la comunidad de microbios dentro de polen-las disposiciones expuestas a fungicidas será diferente de la de polen sin tratar. Mientras que la diversidad y abundancia de hongos se espera que disminuyan significativamente, bacterias o una sola especie fúngica dominante probablemente crecerá sin control en ausencia de otros hongos competidores. A través de una serie de ensayos in vivo , estos cambios en la composición de la comunidad microbiana se analizará mediante metagenómica.

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Protocol

1. examinar el efecto de la exposición al fungicida en Bumble Bee Colonia éxito usando jaula de experimentos de campo

  1. conjunto de hasta diez jaulas de malla en un campo sembrado con avena. Cavar una zanja alrededor de cada jaula y cavar los cuatro bordes de la jaula de malla en el suelo para asegurarse de que no pueden escapar de las abejas. Stock las jaulas con macetas, plantas con flores que son atractivas para las abejas (por ejemplo, trigo, borraja, alyssum, cosmos y girasoles) ( figura 2).
  2. Complementar las jaulas con una sola bandeja (36 cm x 42 cm) del trébol de in bloom. Racimo florales recursos dentro de una de las esquinas de la jaula, ocupando un espacio de aproximadamente 2,5 m x 1 m. Vegetate el área restante de la jaula por la avena.
  3. Asignar aleatoriamente el abejorro colonias, cada uno con los trabajadores y una sola Reina, un tratamiento (fungicida presente ausente, N = 5 colonias por tratamiento, total 10 colonias), luego los coloque dentro de una jaula de campo (N = 1/jaula) durante 29 días (23 de junio -21 2014 de julio de).
  4. Orientar las cajas de Colonia que la Colonia ' aberturas s punto hacia el sur para proporcionar a las abejas con las condiciones de navegación óptimas. Subvencionar las colonias con recipientes de agua de azúcar, dentro de las cajas de colmena para complementar la disponibilidad de néctar.
  5. Aplicar fungicida base de clorotalonil a nivel campo pertinentes (20 g/L) para plantas con flores en las jaulas de tratamiento cinco fungicida, con una mano sostuvo pulverizador de plaguicidas, dos veces durante el estudio (día 0 y 13). Capa de manera uniforme las flores que no hay más líquido se adhiere a superficies florales ( figura 3).
  6. Al concluir el estudio de campo jaula, quitar a mano las colonias B. impatiens de las jaulas, enfriar las colmenas colocando en congelador de -20 ° C por 20 min.
  7. Quitar las abejas utilizando pinzas estériles y anote el número de larvas, pupas, las hembras adultas (. e. forrajeras) y los machos adultos. Utilizando una balanza analítica grabar el seco-peso de la madre, Reina, larvas, pupas, adultos hembras (es decir, recolectoras) y machos.

2. Examinar los efectos de la exposición fungicida sobre las comunidades microbianas en las disposiciones de polen de Bumble Bee nidos utilizando laboratorio basado en los ensayos En Vivo

  1. pulverización comercialmente comprado polen a un polvo fino usando un estándar molino de bolas de laboratorio. Esterilizar en polvo polen sumergiéndolos en etanol al 70%, permitiendo que se evaporan durante la noche bajo luz UV. Verificar la esterilidad del polen por mg de ~0.5 en medios de agar para fines generales de la galjanoplastia.
    1. a la seca, polen esterilizado, utilizando pipetas estériles, añadir dosis pertinente campo de fungicidas: propiconazole 14.3%; azoxystrobin en 22,9% para los tratamientos (0,74 μl y 0.65 μl respectivamente / día / colmena). Mezclar con palillos de madera estériles.
  2. Lugar 6 colmenas experimentales (n = 3 para el control y tratamiento) en un banco de laboratorio limpio, higiénico mantenida a temperatura ambiente. Cada día pesar 4,27 g de polen 34 , 35 mezclado con fungicidas (para los tratamientos) o agua estéril (para control) dentro de una campana mediante una técnica aséptica estándar.
    1. Las puertas de trampa siempre por el lado de la caja de cartón que encierra las colmenas, introducir el polen en las colmenas. Suplemento a las colmenas con solución de azúcar esterilizados cada semana. Continúe alimentando régimen durante cuatro semanas.
  3. Al concluir el estudio de laboratorio, enfriar las colmenas por lugar en tubos de almacenamiento estéril y colocar en el congelador de-20 ° C durante 20 min raspar hacia fuera el polen dispuesto dentro de cámaras de cría utilizando pinzas estériles y espátulas. Tienda a-80 ° C. Conde y registro del peso de los trabajadores y de la reina madre al inicio y al final del experimento (paso 1.7).
  4. Aislar ADN de muestra de polen de la misma mediante el aislamiento de ADN disponible en el mercado kits (para detalles, véase tabla de materiales).
    1. Añadir 0,25 g de polen-disposición a la extracción de los tubos, brevemente vortex para mezclar el.
    2. Hacer un 200 mg/mL lisozima solución en agua destilada desionizada, suficiente para la muestra de 50 μl. Agite vigorosamente para solución de forma completamente.
    3. Añadir 50 μl de la solución de lisozima en los tubos de extracción con la muestra en él y mezclar bien por inversión varias veces. Incubar los tubos durante 10 min a 37 ° C en un baño de agua. Si ha formado el precipitado, calentar la solución a 60 ° C hasta que se disuelva antes de usar.
    4. Añadir 70 μl de solución de lisis acuosa para tubos de extracción, fije horizontalmente en una superficie plana vortex plataforma con cinta, y los tubos vortex durante 10 minutos, centrifugar a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente.
    5. Transferir el sobrenadante a un tubo de recogida limpio de 2 mL. Añadir 250 μl de solución de precipitación de proteína y de vortex por 5 s. incubar a 4 ° C por 5 min en un baño de hielo.
      Nota: Esperar entre 400 μL a 500 μl del sobrenadante. Sobrenadante puede contener algunas partículas de.
    6. Centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 1 min a 10.000 x g y transferir hasta 600 μl de sobrenadante a un tubo de recogida limpio de 2 mL. Añadir 200 μL de solución de eliminación acuosa inhibidor, vortex e incubar a 4 ° C por 5 min, centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 1 min a 10.000 x g. transferir hasta 750 μl de sobrenadante a un tubo de recogida limpio de 2 mL.
    7. Agregar 1200 μl de solución acuosa atar al sobrenadante y vortex durante 5 s. carga aproximadamente 675 μl del sobrenadante en un filtro de centrifugado y centrifugar a 10.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Deseche el flujo a través de.
    8. Repetir 2.4.7. dos veces.
      Nota: Se requiere un total de tres cargas para cada muestra procesada.
    9. Añadir 500 μl etanol y centrifugar a temperatura ambiente durante 30 s a 10.000 x g. Deseche el flujo a través y centrifugar nuevamente a temperatura ambiente durante 1 min a 10.000 x filtro de centrifugado de lugar g. en un tubo de recogida limpio de 2 mL.
    10. Buffer de
    11. Agregar 100 μl de elución al centro de la membrana del filtro. Centrifugar a temperatura ambiente durante 30 s a 10.000 x g. Deseche el filtro de centrifugado. Tienda recogidas ADN entre-20 ° C y -80 ° C
  5. uso aislado ADN para secuenciación.
    1. Cuantificar y normalizar el ADN aislado a 2 ng/μl por análisis fluorométrico.
      1. Preparar reacciones por triplicado para cada muestra extraída comparar las cantidades relativas de 28S (planta), analizar su (hongos), 16S (bacteriana) componentes y de cada muestra de polen-disposición 36. Asegúrese de que cada reacción contiene 10 ng de ADN total, 2 x de master mix de Cianina asimétrica basada tinte y 2,5 μl de cartillas de avance y retroceso pares 28KJ/28B 37 para planta y ITS1/ITS5.8R para el ADN fúngico 38 .
    2. Amplificar ADN usando los siguientes parámetros: desnaturalización previa de 2 min a 50 ° C, 2 minutos de desnaturalización inicial a 95 ° C, 40 ciclos de (15 s a 98 ° C, 15 s a 58 ° C, 60 s a 72 ° C), seguido por una curva de fusión en.
    3. Preparar un protocolo PCR 2-step, anidado utilizando bibliotecas de secuenciación de próxima generación dirigido a rRNA 16S región variable V3/V4 y ITS / 5.8s región del espaciador de rRNA.
      1. Agregar 12,5 μl de DNA 5 pmol de cada primer y 2 x master mix. Hacen reacciones diferentes para cada región (16S o ITS; ver tabla 1). Modificar iniciadores específicos de la región descrita 39 , 40 para agregar secuencias de nucleótidos específicas de secuenciador adaptador saliente a las secuencias específicas del gen.
      2. Realizar amplificación inicial usando los siguientes parámetros: 3 minutos de desnaturalización inicial a 95 ° C, 25 ciclos de (30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 30 s a 72 ° C), extensión final de 5 min a 72 ° C.
      3. Siguiente inicial amplificación, verificar el tamaño de la biblioteca y la cantidad de movilidad electroforética y limpiar con un 1 x volumen fase sólida imm reversibleobilization granos para quitar cebadores residual y reactivos de la reacción. La piscina 16S y sus amplicones cuantitativamente para crear un pool de productos individuales para cada muestra.
      4. Añadir adaptadores específicos de secuenciador y muestra índices duales específicos utilizando los siguientes iniciadores (ver tabla 1). Añadir 2,5 μl de ADN amplificado a 5 pmol de cada primer y 2 x master mix. Realizar la amplificación de la biblioteca utilizando los siguientes parámetros: 3 minutos de desnaturalización inicial a 95 ° C, 8 ciclos de (30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 30 s a 72 ° C), extensión final de 5 min a 72 ° C.
    4. PCR siguientes, bibliotecas limpio acabadas usando un volumen de 1 x de granos de inmovilización reversible la fase sólida. Evaluar la calidad y cantidad de las bibliotecas terminadas con movilidad electroforética y fluorometría, respectivamente. Estandarizar las bibliotecas para 2 μm y piscina antes de la secuencia.
    5. Realizar la secuenciación de próxima generación en una plataforma similar a los adaptadores en la PCR secundaria, con una longitud apropiada para cubrir el entero amplicon 41.
  6. Secuencia anotación y análisis de la composición microbiana.
    1. Combinar par secuencia datos (R1 y R2) en único contigs de bibliotecas todo secuenciadas. Después de combinar los archivos R1 y R2, se produce un archivo fasta individual para cada una de las bibliotecas de.
      Nota: Este paso y los procesos que se describen a continuación (salvo indicación en contrario) se realizaron en Mothur versión 1.38.0 38.
    2. Pantalla cada archivo fasta para eliminar bases ambiguas, inesperadas secuencias largas y homopolímeros largo.
      Nota: Los parámetros para la detección y eliminación de la secuencia son maxambig = 0, maxlength = 600 y maxhomop = 8 para ambos genes. Quitar secuencias idénticas, pero mantener una tabla de contingencia por separado para todas las bibliotecas (también conocido como tabla de Conde en Mothur).
    3. Alinear secuencias únicas de la biblioteca de genes 16S contra la versión de base de datos SILVA 123 y la biblioteca de su gen contra la base de datos se unen su 42.
      Nota: Las secuencias deben anotarse desde el nivel unido al nivel de género.
      1. Posteriormente, clúster alineados secuencias con la función pre.cluster con diff = 5 y quitar quimeras.
    4. Clasificar secuencias usando el método de Wang 43 basado en los archivos de taxonomía unen sus (por su gen) (valor de corte de 80%) y SILVA (para el gen 16S).
    5. Carga en R 44 las tablas de contingencia (uno por cada gen) generadas durante el proceso de clasificación en Mothur. En cada nivel taxonómico, obtener abundancia relativa por la biblioteca para su posterior análisis de los cambios de la comunidad microbiana.
      Nota: En cada nivel taxonómico, fusionar grupos taxonómicos cuando abundancia relativa es inferior al 2% para todas las repeticiones experimentales.

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Representative Results

Estudio de la jaula del campo:

Datos obtenidos de los experimentos de jaula demostraron que las colonias de abeja bumble tuvieron una respuesta significativa a la exposición de fungicida. Las colmenas tratadas con fungicida produjeron significativamente menos trabajadores (12,2 ± 3.8, media ± SE) que las colmenas de control (43,2 ± 11.2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (figura 4). Además, la biomasa de abejas de las colmenas tratadas con fungicida (0,91 g ± 0,15) fue significativamente menor que las colmenas de control (2,36 g ± 0,55; F 1,9 = 8.3, p = 0,02). Este patrón de baja biomasa en las colmenas tratadas con fungicida se observó también entre las reinas madre. Las reinas de las colmenas tratadas con fungicida presentadas con una biomasa significativamente menor (0,14 g ± 0,04) que las reinas de las colmenas de control (0,27 g ± 0,01; Z = 2.5, p = 0,01). Sin embargo, la exposición fungicida no afectó el número de larvas, pupas y los machos a través de los tratamientos. La biomasa de discreta estadios (larvas, pupas, los trabajadores y los machos adultos) y pesos individuales de larvas, pupas y los trabajadores no mostraron ninguna diferencia a través de tratados con fungicida y control de colmenas.

Estudio de laboratorio:

Datos obtenidos de experimentos de laboratorio indicaron que antes de la exposición de fungicida, control y tratados con fungicida colmenas tenían cuenta trabajador promedio estadísticamente comparable (control colmenas = 28.0 ± 3.1; urticaria tratados con fungicida = 31.67 ± 2.0; n = 3 cada uno) y peso de la reina (control colmenas = 0,77 g ± 0,04; colmenas tratadas con fungicida = 0,74 g ± 0,01). Sin embargo, al final del estudio, conteo de trabajadores fue significativamente mayor en las colmenas de control (67.67 ± 4.3), en comparación con colmenas tratadas con fungicida (45.33 ± 3.8) (t4 = 3,89, p = 0,01). Población trabajadora por ~ 150% en control colmenas comparado ~ 45% en las colmenas tratadas con fungicida. Del mismo modo, el peso final de la reina madre seguía siendo relativamente sin cambios en el control de urticaria (0,76 g ± 0.02) en comparación con un ~ 35% disminución en las colmenas tratadas con fungicida (0,49 g ± 0.16). Tomados en conjunto, estos resultados son consistentes con resultados previamente publicados25 e indican exposición fungicida afectados gimnasio Colonia según lo evidenciado por la menor cantidad de trabajadores y reducido peso de reina madre (figura 5).

Análisis metagenómicos de polen-disposiciones indican distintas diferencias entre las comunidades microbianas de trataron con fungicidas y controlan de colmenas (figura 6). Hubo una disminución (> 95%) en la abundancia relativa de Streptomycetales comúnmente aislado, Enterobacteriales en las colmenas tratadas con fungicida. Curiosamente, ambos grupos son conocidos por su actividad antifúngica y papel en la conservación de polen30,45 dentro de entornos de colmena de abejorros. Bacterianos miembros de la orden Rickettsiales, que incluye patógenos comunes de artrópodos46, demostraron mucho mayor abundancia en las colmenas de fungicida tratado. Colmenas tratadas con fungicida tuvieron una menor abundancia de hongos pertenecientes a los órdenes Eurotiales y Sordariales y una mayor abundancia de órdenes Capnodiales y Ascosphaerales en comparación con el control colmenas (figura 7). Como era de esperar, para bacterias y hongos, índice de diversidad (H) y uniformidad (E) de Shannon fue menor en las colmenas tratadas con fungicida en comparación a los controles, aunque estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (bacterias: H control de colmenas =1,25 ± 0.3, Hcolmenas tratadas con fungicida = 0,82 ± 0.2, Econtrol colmenas = 0.46 ± 0,1; Eurticaria tratados con fungicida = 0.31 ± 0,1; hongos: Hcontrol colmenas =0.99 ± 0.3, Hcolmenas tratadas con fungicida = 0,72 ± 0.4, Econtrol colmenas = 0.57 ± 0,2; Eurticaria tratados con fungicida = 0.42 ± 0.2). Aunque cambios de detalle las implicaciones metabólicas y funcionales de esa comunidad fue más allá del alcance de este estudio, combinado con el recuento de colonias y los datos de peso, estos resultados sugieren que la exposición fungicida podría afectar declive en la salud de la Colonia por interrumpir la simbiosis entre el microbioma de polen y abejas. Más investigación sobre el papel de grupos microbianos específicos que afectan a la supervivencia larvaria se recomienda para evaluar mejor el papel de la microbioma de polen en el sostenimiento de las poblaciones de abejas sanas.

Figure 1
Figura 1: dentro de un nido de Bombus impatiens . Imagen de alta resolución de los trabajadores tiende a células de cría. Las células de cría pueden contener varios huevos y larvas en un momento dado. Desarrollo de las larvas se alimenta de polen-disposiciones periódicamente introducidas en la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: jaulas de campo grande erigieron para albergar las colonias de abejas a. Cada jaula de malla (N = 10) fue abastecido con uno comprado comercialmente Bombus impatiens colmena, así como en la floración de la planta especie conocida para atraer a las abejas. Flores fueron colocadas en una esquina de la jaula y el área restante fue vegetación con hierba de avena. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: residuos de fungicida en un girasol recientemente pulverizado. Dosis correspondientes campo del fungicida fueron rociados en el día 0 y 13 del experimento. Usando un pulverizador de plaguicidas, las flores fueron uniformemente recubiertas con una solución de fungicida en el atardecer/noche para evitar el contacto directo con las abejas libadoras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: impacto de residuos de fungicida en los abejorros en el experimento de la jaula. Colmenas de abejorros que estuvieron expuestos a residuos de fungicida en polen exhibieron disminuciones significativas en el tamaño de la Colonia (reductiones en abundancia femenino adulto) en el transcurso de un mes. Barras de error representan ± 1SE; p < 0.05. Esta figura fue modificada de Bernauer et al. 25. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: impactos de los residuos de fungicida en los abejorros en un experimento de laboratorio. Colmenas de abejorros que fueron expuestos a polen tratados con fungicida exhibieron disminuciones significativas en el tamaño de la Colonia (reducciones en la abundancia de adultos trabajadores) y disminución en el peso de la reina madre en el transcurso de un mes. Barras de error representan ± 1SE; p = 0,03. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: gráfico de metagenómica clasificación de la diversidad de hongo y bacterias en el orden de la fila. Análisis basados en (una) 16S y (b) basado en su clasificación de las muestras de polen de la misma recogieron de control y de las colmenas tratadas con fungicida. Colmenas de control demostraron mayor diversidad y uniformidad en la distribución microbiana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: variación porcentual en orden fila relativa abundancia de bacterias y hongos en respuesta a la exposición de fungicida. Clasificación de metagenómica de comunidades microbianas con (un) 16S y (b) su base de cartillas haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Par de la cartilla Tipo de cartilla Secuencia de primer
28KJ/28B Planta GGC GGT AAA TTC CGT CC /
CGT CCG TGT TTC AAG ACG
ITS1 / ITS5.8 Hongos TCC GTA GGT GAA CCT GCG G /
MORDAZA ATC CGT TGT TGA AAG TT
16S adelante / atrás Bacterias anidadas 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTACGGGNGGCWGCAG-3'/
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'
Cartilla de ITS1F / ITS4 Anidar hongos 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCGTAGGTGAACCTGCGG - 3'
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC - 3'
Cartillas de adaptador 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC [55555555]
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [77777777]
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT -3 '

Tabla 1: lista de pares de cartilla y primer secuencias utilizadas en la amplificación de la DNA. Ver texto para las referencias.

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Discussion

Las investigaciones sobre los efectos de fungicidas en la salud de las abejas se han mantenido un estudiado aspecto de estrategias de manejo de plagas. Nuestro estudio pretende brecha este conocimiento mediante el uso de un conjunto de técnicas complementarias que explícitamente aislar los factores potenciales que impulsan abeja disminuye. La planificación, razonamiento y representación de estos experimentos se detallan a continuación.

Es importante asegurarse de que no las abejas se les permite escapar de la malla de los experimentos de la jaula, ya que esto podría comprometer el análisis de la demografía. También es importante que los nidos artificiales tienen suficiente aislamiento para proteger de la lluvia y la luz solar directa. Debe tenerse cuidado para que los fungicidas no se rocían directamente en los nidos. Las colonias deben proporcionarse con vejigas de agua azúcar suplemento néctar se reunieron y evitar deshidratación.

Para el laboratorio de pruebas de alimentación, se deben mantener estrictas condiciones de asepsia para evitar la contaminación durante la preparación de las comidas de polen. Debe ser en polvo polen comercialmente comprado y UV esterilizarse antes de su uso. Higiene de la colmena se debe mantener para prevenir la infestación de parásitos extraños como despensa polillas y cucarachas. Recipientes de líquido deberían complementarse con solución de azúcar esterilizados para evitar la deshidratación. Censo de tratamiento previo, se debe no al estrés las abejas por excesiva manipulación y mantenerlos fuera de la hived para prolongado períodos.

Como rendimiento de ADN depende de la edad y el tipo de material de partida, deben utilizarse únicamente muestras frescas o bien congeladas en amplificación y extracción de ADN. Peso de la muestra para la extracción de ADN no debe exceder 0,25 gm, esto reducirá el rendimiento de ADN. Rendimientos de ADN deben ser cuantificados usando la electroforesis del gel. Inicial cuantificación electroforética de ADN aislado es fundamental antes de proceder a las reacciones de qPCR para amplificación eficiente47.

Para el análisis de metagenómica, un análisis más exhaustivo de la dinámica microbiana puede obtenerse limitando la cantidad de secuencias anotadas (relajando la fracción de diferencia tolerable entre secuencias) y reducir el número de grupos taxonómicos, como así como aquellos cuya abundancia relativa es considerablemente baja fusión (< 2%).

El tamaño de muestra conservador (N = 5 por tanto fungicida tratados y sin trata urticaria estudio de jaula) puede inflar las varianzas en los datos, que se minimizará mediante el uso de replicación mayor en futuros estudios. Para agregar una mayor resolución y potencia estadística a los resultados, las colonias de abejas serán censados y pesado antes y después de la exposición de fungicida. Ejecutar el experimento de la jaula durante períodos más largos permitirán la producción de nuevas reinas, que puede servir como una variable de respuesta adicional. Con estas modificaciones en el actual protocolo, estudios futuros proporcionará mayores detalles sobre la dinámica de población de la colmena.

La naturaleza hidrofóbica de polen impide su eficaz mezcla con el agua. Pulverización y tamizado de los gránulos de polen en un polvo fino, ayuda en el proceso de mezcla. La cantidad de polvo de polen puede ajustarse para lograr la consistencia deseada. Debe tener cuidado de mezclar bien el líquido (agua o fungicida) para lograr una distribución homogénea de los ingredientes activos y entrega incluso a los forrajeadores.

Como el ADN sobrante puede inhibir reacciones de PCR, se recomienda que muestra no deberá pesar más de Vortex excesiva de 0.25 g. debe evitarse como tijeras de ADN, disminuyendo el rendimiento. Rendimiento de ADN bajo también puede ser consecuencia de una exposición prolongada al buffer de lisis. Iniciadores de bacterias deben elegirse preferentemente de la región de V7-V9 de 16S rRNA para minimizar la amplificación no específica de DNA de cloroplasto48. Además, la secuencia de otros genes como el gen de ARN ribosomal 18S puede proporcionar una mejor comprensión de la diversidad microbiana en el polen, así como los cambios de la población sobre la utilización de fungicidas.

Dada la cantidad de bibliotecas para procesar con Mothur, tiempo de computación puede ser considerablemente alta. Eliminación de solteros cuando se comparan secuencias de uno contra el otro (si informática los recursos son limitados, retírelas antes de filtración quimera) puede disminuir considerablemente el tiempo requerido para computar unidades taxonómicas operacionales.

Los experimentos de jaula limitan el rango de vuelo natural de las abejas (en lugar de permitirles forraje ampliamente en todo el panorama), y no está claro el grado en que tales restricciones pueden influir en las variables de respuesta. Aunque las jaulas control y tratamiento experimentan la misma gama de variables bióticas y abióticas, es logísticamente imposible de controlar para el microambiente dentro de cada jaula.

El verdadero alcance de las interacciones microbianas dentro de la comunidad es demasiado complejo e intrincado para replicar a través de ensayos experimentales. Aunque nuestros datos probablemente documentan un subconjunto de la diversidad microbiana total en provisiones de polen, es la primera visión de los efectos interactivos que puede prevalecer entre bacterias y hongos en la presencia/ausencia de fungicidas.

Utilizando bases de datos alternativos para alinear secuencias49 o predecir estados metabólicos funcionales basados en la diversidad bacteriana de polen50 puede proporcionar una visión más amplia de la microbioma de polen. Finalmente, para mejor caracterizar la dinámica metabólica y funcional de comunidades microbianas después de la aplicación de fungicida, secuenciación del genoma entero de polen microbioma es necesario.

Experimentos de la jaula usando colmenas compradas comercialmente proporcionan uno de los mejores frameworks para medir las variables de respuesta en un ambiente semi controlado. Causar mínima alteración a la ecología natural de las abejas (eficiencia de forrajeo, estructura social, cuidado de la prole), experimentos de jaula minimizan la invención y el estrés, presentado por el ambiente artificial y manual de manejo en laboratorio experimentos.

A lo mejor de nuestro conocimiento, ningún estudio se ha realizado aún para evaluar los efectos de fungicidas en la dinámica de la comunidad microbiana en la provisión de polen de abejorros. Exposición a los fungicidas puede eliminar una o más especies sensibles, interrumpir la tregua ecológica entre hongos y bacterias. Mediante ensayos basados en laboratorio y campo como un crisol para jugar a estas interacciones, este estudio pretende demostrar que el exterminio de la especie microbiana residente puede pervertir el equilibrio ecológico de la microbioma de polen, que puede a su vez compromiso salud de las abejas.

Técnicas dependientes de la cultura como dilución y en captura de medios estándarsólo una fracción de la microflora de un entorno determinado. Esto puede conducir a una grave subrepresentación de diversidad microbiana y microbios unculturable pueden ir desapercibido51. Para estudiar la extensión de microorganismos, los científicos deben basarse en técnicas independientes de la cultura, más inclusivo y comprensivo, por ejemplo, análisis de metagenómica y secuenciación de próxima generación. Dibujo pesadamente de estas poderosas técnicas moleculares, este estudio pretende obtener una mayor resolución en el microbioma del polen que proporcionados por técnicas basadas en la cultura tradicionales solamente.

Los resultados de este estudio han puesto de manifiesto profundas pérdidas en el número de trabajadores dentro de colmenas de abejorros expuestos a fungicida. Para que una colonia de abeja bumble tener éxito, los trabajadores deben proporcionar recursos suficientes y cuidado para la reina madre y particularmente para el desarrollo de las larvas. En última instancia, el objetivo de la Colonia es maximizar la captura de recursos (polen y néctar) que hija-queens tantos como sea posible pueden ser producidos por el final del verano. Hija sanas-reinas son la medida de la aptitud para una colonia. Reducciones importantes en los trabajadores, entonces, efectivamente debilita la capacidad de la Colonia para producir reinas para el año siguiente. En este estudio, no sólo fueron disminuidos perceptiblemente números del trabajador, pero las reinas de la madre del fungicida trataron colmenas presentado con menor biomasa, probablemente como resultado de insuficiente alimentación de los forrajeros. Dada la complejidad de las interacciones microbianas en disposiciones de polen, es difícil discernir los exactos efectos interactivos entre hongos y bacterias que contribuyen a estos patrones. Sin embargo, resultados derivados de experimentos repetidos y repetidos como se describe aquí, proporcionará penetraciones vitales en el cambiantes simbiosis entre estos dos grupos microbianos (ya sea competitivo, mutualistas o comensales) en respuesta a xenobióticos, y sus efectos posteriores en el microbioma del polen.

Mediante el uso de herramientas moleculares de gran alcance, la complejidad ecológica de la microbioma de polen puede resolverse mejor. La comprensión preliminar revela una plétora de natural de bacterias y hongos, contribuyendo colectivamente para mantener la aptitud de la Colonia. En particular, las levaduras que fueron aisladas de polen-disposiciones son conocidas por tener propiedades bactericidas y fermentativas, que son cruciales para el desarrollo de las abejas larvales. Tales asociaciones ecologistas son sugestivos de un alto grado de mutualismo entre las abejas y su polen microbioma. Polen-disposiciones, por lo tanto, representan un efecto emergente de la diversidad, provocado por el cultivo de una comunidad microbiana de roles funcionales claves. En ausencia de estos simbiontes claves, el suministro de polen parece estar comprometida a grados desconocidos. Trabajo continuado en este sentido, es probable que explicar la diversidad funcional de estos microbios y desenmascarar su papel como simbiontes de abeja.

La investigación reciente ha desacreditado la noción de fungicidas como inofensivo a las abejas19,24,52,53,54. El objetivo de esta investigación es aislar los mecanismos de conducción fungicida impactos en las abejas, iluminando así la relación de causa-efecto entre fungicida uso y abeja disminuye. El centro de hipótesis alrededor del concepto que simbiosis abeja-microbio son ser alteradas significativamente por los residuos de fungicida en el polen. En última instancia, este trabajo será nuevamente el marco cómo fungicidas se han consultado y utilizados en agricultura y entornos urbanos. A la luz de la actual crisis mundial de polinizadores, la investigación propuesta genera nuevos conocimientos sobre la ecología de abejas nativas, lo que se refiere a las prácticas de producción agrícola. Fungicidas siguen siendo el último grupo de agroquímicas a efectivamente exentos de regulaciones limitando aplicaciones a los cultivos durante la floración. Como resultado, abejas manejadas y silvestres están expuestas constantemente a fungicidas. Un creciente cuerpo de literatura sugiere que, aunque los fungicidas no son letales para las abejas en contacto, en dosis elevadas, la exposición es bastante perjudicial, llevando a mayor mortalidad larvaria21 y alterado comportamiento cazador. Se espera que este trabajo iluminará los mecanismos que fungicidas están dañando polinizadores. Además, esta investigación se forman la base de la política de manejo de plagas más sabia e informar a los productores de las mejores prácticas de gestión. Este trabajo también será instrumental en la entrega de pautas para rociar pesticidas mejorados, que pueden influir en la legislación de pesticidas. En términos más generales, estos resultados serán relevantes para cualquier ecosistema administrado en que plantas con flores son visitadas por la recogida de polen insectos. Con las estimaciones mundiales de abejas específicas servicios de polinización siendo extraordinariamente alta55,56, si este trabajo puede mitigar la decadencia de las poblaciones de abejas, los impactos potenciales serán sustanciales.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El autor (es) gracias a la Universidad de Wisconsin biotecnología centro DNA secuencia instalación para proporcionar amplificación secuenciación instalaciones y servicios, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto y Max Haase para asistencia técnica con Análisis molecular. Este trabajo fue apoyado por fondos de USDA-Agricultural Research Service apropiado (actual investigación sistema de información #3655-21220-001). Apoyo adicional fue proporcionado por la National Science Foundation (bajo la subvención no. DEB-1442148), el DOE grandes lagos Bioenergy Research Center (DOE oficina de ciencia DE BER-FC02-07ER64494) y el Instituto Nacional de alimentos de USDA y la agricultura (proyecto 1003258 de la portilla). C.T.H. es un erudito de Pew en las ciencias biomédicas y Alfred Toepfer facultad miembro, apoyada por la Pew Charitable Trusts y la Fundación Alexander von Humboldt, respectivamente.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR

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Empírico, metagenómica y técnicas computacionales iluminarán los mecanismos por los cuales fungicidas compromiso Pathología Apícola
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Steffan, S. A., Dharampal, P. S.,More

Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).

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