Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Ampirik, Metagenomic ve bilgisayar teknikleri mekanizma hangi mantar ilaçları uzlaşma arı sağlık ile aydınlatmak

Published: October 9, 2017 doi: 10.3791/54631
Automatic Translation
1,2, 2, 3,4, 5, 1,3, 6,7,8
1Vegetable Crop Research Unit, USDA-ARS, 2Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics, Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution, University of Wisconsin-Madison

Summary

Bumble arı kovanlarını içinde mikrobiyal konsorsiyumlar zenginleştirmek ve polen arı larvaları için korumak. Laboratuvar ve deneyler, alan bazlı ile birlikte sonraki nesil sıralama kullanarak bu el yazması mantar ilacı artıkları polen microbiome ve koloni demografi, sonuçta koloni için önde gelen alter varsayımını sınamak için kullanılan iletişim kurallarını açıklar kaybı.

Abstract

Yetiştiriciler kez çiçeklenme sırasında bitkileri mantar ilacı artıkları arılara sunar hastalığa karşı korumak için mantar ilacı spreyler kullanın. Ne kadar "arı için güvenli" olarak, mantar ilacı kalıntılarında polen arı düşüşler (için bal ve bumble bee tür) ile ilişkili montaj kanıtlar var. Mekanizmaları nispeten bilinmeyen kalırken, araştırmacılar arı-mikrop symbioses katılan spekülasyonlar var. Mikroplar koruma ve/veya işleme polen, larva arılar için beslenme olarak hizmet veren çok önemli bir rol oynamaktadır. Mikrobiyal topluluk değiştirerek, bu mantar ilaçları bu mikrop aracılık hizmetlerini kesintiye uğratamaz ve böylece arı sağlık uzlaşma için muhtemeldir. Bu el yazması hangi-ebilmek var olmak mucip mantar ilaçları koloni düşüş dolaylı mechanism(s) araştırmak için kullanılan iletişim kurallarını açıklar. Kafes deneyler için mantar ilacı tedavi çiçekler arılar açığa zaten mantar ilaçları bir yerel bumble bee (Bombus Impatiens) derin koloni kayıplara neden ilk kanıt sağladı. Mantar ilaçları alan ilgili dozlarda kullanılarak, bir dizi deney geliştirilmiştir daha ince bir mantar ilacı maruz polen mikrobiyal topluluk dinamiklerini sağlamak için. Mantar ve bakteri buluntu polen microbiome içinde yapısal bileşimi nöbetleşe yeni nesil sıralama ve metagenomic analiz tarafından incelenmiştir. Burada geliştirilen deneyler mantar ilaçları polen-hükümler microbiome etkilemesi mekanik bir anlayış sağlamak için tasarlanmıştır. Sonuçta, bu bulgular dolaylı yolu üzerinden koloni düşüşler mantar ilaçları neden olabilecek ışık.

Introduction

Yönetilen ve yabani arı türü her ikisi de doğal ve tarım sistemleri1için önemli etkileri ile yaygın düşüşler yaşandığı. Bu sorunun nedenleri anlamak için uyumlu çabaları rağmen bal arı düşüşler sürüş hala değil iyi anlaşılan2,3,4etmenlerdir. Vahşi, yerli arıları belirli türler için durum korkunç5,6haline gelmiştir. Arı nüfusu ile endüstriyel tarım kesiştiği, nüfusları düşmeye devam edecek ve bitkileri polinatörler (dünya çapında üretim%735) gerektiren tahammül edecek sürekli olamaz eğer hasat azaltılmış.

Böcek ilacı pozlama gibi birçok potansiyel faktörler hastalık ve habitat kaybı1,4,8,9,10 bal arı düşüş karıştığı olmuştur, nispeten az etkileşimli etkisi bu stresler yerli arılar sağlık, içinde veya yakınında tarım sistemleri hakkında bilinir. Birçok mevcut araştırma çabalarının böcek öldürücüler, (örneğin, neonicotinoids11,12üzerinde), mantar ilaçları da bir rol arı düşüş bellek oluşumu bozulması tarafından oynayabilir ki son araştırma gösterir rağmen odaklanmaya devam, koku alma13, yuva tanıma14, enzim aktivitesi ve metabolik işlevleri15,16,17. Genel olarak, mantar ilaçları çiçeklenme sırasında çiçekli bitkiler için uygulanmaya devam. Son yıllarda yapılan çalışmalarda arılar genellikle mantar ilacı artıkları geri kovan18için gerçekten de getirmek., çalışmalar test kurdeşen bulunan mantar ilacı artıkları19,20büyük bir kısmı göstermiştir belgeledi. Daha fazla çalışma ortaya çıkar o mantar ilacı tortu yüksek oranda bal arı larva ölüm21,22,23 ve "entombed polen" koloniler içinde varlığı ile ilişkili olan, ancak toksik olmayan, mikrobiyal aktiviteyi yoksun ve beslenme güvenliği aşılan24. Mantar ilaçları uzun süre "arı için güvenli" olarak kabul edilmiştir ki rağmen hiçbir şey şimdi kanıt için mantar ilacı yalnız bu maruz kalma ciddi koloni kayıp bir yerel bumble bee türler, Bombus Impatiens25neden olabilir.

Ölüm, bu kimyasalların modus operandi nedensellik arasında mantar ilacı pozlama ve koloni kurmak için belirlenecek gerekir. Toprak26, çökeller27ve su ortamları28, mantarlar hedefleyerek kanıtladığı, mantar ilaçları olasılıkla mantar bereket alter ve çeşitlilik içinde polen-hükümler, böylece büyük bir topluluk çağırma kaydır güçlü bakteri lehine olabilir. Mantar rakip veya antagonistleri bazı Patojen bakteriler nispeten denetlenmeyen, polen-hükümler bozulma kolaylaştırmak prolifere. Araştırmalar göstermiştir mikroorganizmalar, özellikle Mayalar ve ipliksi Mantarlar, arılar29,30,31için beslenme simbiont olarak hizmet, parazitler ve patojenler32 karşı koruma ,33ve polen mağazaların uzun vadeli koruma sağlar. Mantar ilaçları, bu nedenle, dolaylı olarak olgunlaşmamış arılar bu hizmetleri sağlamak için gerekli mikrobiyal topluluk kesintiye tarafından ve/veya duyarlılık fırsatçı patojenler ve parazitler12artırarak zarar verebilir. Gıda üretim talepleri artan ile bitkileri dünya çapında her yıl mantar ilaçları ile mantar ilacı kaynaklı etkileri büyüklüğünü anlamak gerek vurgulayan bloom sırasında püskürtme.

Yerel arı mikrobiyal ekoloji temsil tarafından aşağıdaki soruları ile ilgili birincil bilgi boşlukları, Tarih: ne ölçüde mantar ilacı mikrobiyal toplum içinde arı polen-hükümler değişir mi? Polen derinden değişmiş bir mikrobiyal toplulukla tüketen aşağı akım etkileri nelerdir? Bu ekolojik konu ile ilgili sorular ile tutarak, deneyler 1 açığa birincil hedefleri ile geliştirilmiştir) Yalnız o mantar ilacı tortu ciddi koloni düşüş bir yerli arı türler; neden olabilir 2) derecesi için polen-hükümler mikrobiyal topluluklarda değiştirilmiş mantar ilaçları ve 3) nasıl arı sağlık ciddi biçimde değiştirilmiş bir mikrobiyal topluluk tarafından etkilenir. Deneysel amaçlar deney Laboratuvarı ve alan bazlı bir birleşimini kullanarak yukarıdaki sorulara yönelik olarak tanımlanmış. State-of--art metagenomic ve alan gözlem geleneksel yöntemleri yanında moleküler teknikleri kullanarak, bu araştırma mantar ilaçları olası etkilerini arı sağlığı üzerinde bir araya toplamaya amaçlamaktadır.

Bu çalışmanın ilk hedefi mantar ilacı pozlama yalnız yerli arı türler arasında önemli koloni kayıp neden olabilir göstermektir. Büyük alan kafesleri içeren bir çalışma Bombus Impatiens, (Resim 1, Resim 2, şekil 3) ABD'de her yerde, bol yerli arı koloni gelişimini mantar ilacı pozlama etkilerini araştırmak için kullanıldı. Bu mantar ilacı tedavi kovanları düşük fitness ve atipik demografi maruz olmayan yığınlar için karşılaştırıldığında sunacak olan. Mantar ilacı artıkları polen içinde derin koloni kayıp bir yerel bumble bee türler25tek nedeni olabilir gösteren bu hipotez desteklenen bu deneyden elde edilen veri. Polen microbiome yanıt için mantar ilacı pozlama araştırmak için bu çalışmanın ikinci amacı olduğunu. Mikroplar polen-hükümler için mantar ilaçları maruz içinde topluluk bileşimi tedavi edilmezse polen farklı olacak olan. Mantar bolluk ve çeşitlilik önemli ölçüde düşüş bekleniyor olsa da, bakteri ve/veya tek bir baskın mantar türü büyük olasılıkla diğer rakip mantarlar yokluğunda denetlenmeyen büyüyecek. In-vivo deneyler bir dizi sayesinde, bu vardiya mikrobiyal topluluk bileşiminde metagenomics kullanarak analiz edilecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. mantar ilacı pozlama etkisi Bumble Bee Colony başarı kullanarak alan kafes deneyler incelemek

  1. Set on kadar kafes kafes bir alanda dikildi yulaf ile. Her kafes çevresinde bir siper kazmak ve kafes kafes tüm dört kenarları arılar kurtuluş yok emin olmak için zemine kazmak. Arılara (örneğin buğday, hodan, alyssum, evren ve ayçiçeği) çekici olduğu bilinmektedir saksı, çiçekli bitkiler ile kafesleri stok ( Şekil 2).
  2. Bloom yonca tek tepsi (36 cm x 42 cm) ile kafesleri ek. Küme köşelerinden yulaf tarafından yaklaşık 2.5 m x 1 m. Vegetate kalan kafes alan bir yer kaplayan kafesin içinde çiçek kaynakları.
  3. Rasgele koloniler, içeren her işçi ve tek bir Kraliçe, bir tedavi bumble bee atama (mantar ilacı hediye/yok, N = tedavi başına 5 koloniler, 10 kolonileri toplam), sonra onları bir alan kafes içinde yer (N = 1/kafes) 29 gün (23 Haziran -21 Temmuz 2014).
  4. Şark koloni kutuları öyle ki koloni ' s açıklıklar gelin arılar ile en uygun seyir koşulları sağlamak için güneyde. Şeker su mesane, nektar kullanılabilirlik ek olarak kovan kutularının içinde yerleştirilir ile kolonileri sübvanse.
  5. Uygula chlorothalonil tabanlı fungisit çiçekli bitkiler beş mantar ilacı tedavi kafeslerde alan ilgili bir seviyeye (20 g/L) adlı bir el kullanarak böcek ilacı püskürtme, iki kez çalışma (gün 0 ve 13) sırasında düzenlenen. Öyle ki hiçbir daha fazla sıvı çiçek yüzeylere ( şekil 3)'in çiçekleri düzgün kat.
  6. Ve sonuç alan kafes çalışmanın B. Impatiens kolonileri kafesleri üzerinden el ile kaldırmak, -20 ° C-dondurucu 20 dakika süreyle yerleştirerek kurdeşen serin
  7. Kaldırmak steril forseps kullanarak arılar ve larva, Pupa, Yetişkin kadın kaydedin (ı. e. toplayıcılar) ve yetişkin erkekler. Bir analitik denge kullanarak kaydetmek Kuru Ağırlık annesi Kraliçe, larva, Pupa, Yetişkin kadın (Yani toplayıcılar) ve yetişkin erkekler.

2. In Vivo çalışmalarda Bumble Bee yuvalarını kullanarak laboratuvar dayalı polen hükümleri mikrobiyal topluluklar üzerinde mantar ilacı pozlama etkileri incelemek

  1. ticari olarak satın Pulverize polen bir standart kullanarak ince bir toz için Laboratuvar top-mill. Toz polen % 70 etanol, gecede UV ışık altında buharlaşır izin ıslatarak sterilize. Kısırlık polen ~0.5 mg genel amaçlı agar medya üzerinde kaplama tarafından doğrulayın.
    1. Kuru için sterilize polen, steril Pipetler, kullanarak eklemek mantar ilacı alan ilgili doz: %14,3; propiconazole azoxystrobin %22,9 tedaviler için (0,74 µL ve 0.65 µL sırasıyla / gün / hive). İyi sterilize edilmiş ahşap çubukları kullanarak karıştırın.
  2. Yer 6 deneysel kurdeşen (n = 3 her kontrol ve tedavi için) bir temiz, hijyenik laboratuar benchtop oda sıcaklığında muhafaza içinde. Her gün mantar ilaçları (için Tedaviler) veya standart aseptik tekniği kullanarak bir başlık içinde (Denetim için) steril su ile karıştırılarak polen 34 , 35 4.27 g tartmak.
    1. Tuzak kapı kovanlar, kapsayan karton kutu yan tarafından sağlanan kullanarak tanıtmak polen kovanlar içinde. Kurdeşen sterilize şeker çözeltisi ile her hafta ek. Dört haftadır rejim besleme devam.
  3. -20 ° C-dondurucu 20 dk. Scrape sterilize forseps ve spatula kullanarak damızlık Odaları içinde yer polen hükümler dışarı yerleştirip steril depolama tüpler yerinde kovanlar laboratuar tabanlı çalışma sonucunda, serin. Mağaza-80 ° C. sayısı ve kayıt ağırlığı işçiler ve başlangıç ve bitiş deneme (Adım 1,7), Ana Kraliçe.
  4. İzole DNA'ları piyasada bulunan DNA yalıtım kullanarak polen tedariki örnek kitleri (malzemeler tablo ayrıntılar için bakınız).
    1. Polen-hükmün ayıklama için 0, 25 g tüpler, kısa bir süre karıştırmak için girdap ekleyin.
    2. 200 mg/mL deiyonize distile su, 50 µL/örnek için yeterli lizozim çözüm olun. Shake şiddetle tamamen formu çözüm.
    3. Bu örnekte ayıklama tüplerini 50 µL lizozim çözüm eklemek ve de birkaç kez ters çevirme ile karıştırın. Bir su banyosu içinde 37 ° C'de 10 dakika için tüp kuluçkaya. Çökelti oluşturmuştur Eğer çözüm kullanmadan önce eriyene kadar 60 ° c ısı.
    4. Ayıklama tüpler, sulu lizis çözüm eklemek 70 µL güvenli yatay bandı ile bir Kafesli döşeme girdap yastık üzerinde ve girdap için 10 dk santrifüj tüpleri 10.000 x g 30 için de oda sıcaklığında s.
    5. Süpernatant temiz 2 mL toplama tüp aktarın. 5 dakika içinde bir buz banyosu için 4 ° C'de 5 s. Incubate protein yağış çözüm ve girdap 250 µL add.
      Not: süpernatant ile 500 µL için 400 µL arasında bekliyoruz. Süpernatant hala içeriyor olabilir bazı parçacıklar.
    6. 10.000 x g, 1 dk. için oda sıcaklığında tüpler santrifüj kapasitesi ve 600 µL olan süpernatant temiz 2 mL toplama tüp aktarın. Sulu inhibitörü kaldırma çözüm, kısaca, girdap 200 µL ekleyin ve 5 dk. 10.000 x g., 1 dk. için oda sıcaklığında tüpler Transfer süpernatant ile 750 µL kadar temiz 2 mL koleksiyonu tüpüne santrifüj 4 ° C'de kuluçkaya.
    7. Ekle 1200 µL sulu bağlama çözüm süpernatant ve 5 için girdap s. yaklaşık 675 µL süpernatant üstüne bir spin filtre ve oda sıcaklığında 1 dk. için 10.000 x g, santrifüj, yük. Aracılığıyla akış atın.
    8. Tekrar 2.4.7. ikinci kez.
      Not: Toplam üç yükler işlenen her örnek için gereklidir.
    9. Ekle 500 µL etanol ve oda sıcaklığında santrifüj 30 s 10.000 x g. aracılığıyla akış atmak ve santrifüj kapasitesi tekrar g. yer spin filtre bir temiz 2 mL toplama tüp x 10.000 ' 1 dakika oda sıcaklığında.
    10. Ekle 100 µL elüsyon, arabellek filtre membran ortasına. 30 oda sıcaklığında santrifüj 10.000 x g. s atma spin filtre. Mağaza toplanan DNA-20 ° ve-80 ° C arasında
  5. kullanmak için sıralama DNA izole.
    1. Miktarını ve Fluorometrik analizi ile izole DNA 2 ng/µL'normalleştirmek. Nüsha 28S göreli miktarlarını karşılaştırmak ayıklanan her örnek için
      1. hazırla reaksiyonlar (bitki), onun (mantar), analiz ve 16S (bakteri) bileşenleri her polen tedariki örnek 36. Her reaksiyon 10 içerdiğinden emin olun ng toplam DNA, asimetrik siyanür boya göre ana Mix 2 x ve 2.5 µL her bitki için ileriye ve geriye doğru astar çiftleri 28KJ/28B 37 ve ITS1/ITS5.8R mantar DNA'ın 38 .
    2. DNA'sı aşağıdaki parametreleri kullanarak yükseltmek: 40 50 ° c, 2 dk ilk denatürasyon 95 ° C'de 2 dk öncesi denatürasyon döngüleri (15 98 ° c, 15 s s 58 ° c, 60 s 72 ° c), ardından bir erime eğrisi.
    3. Hazırlamak yeni nesil sıralama kitaplıkları 16S rRNA hedefleme kullanan bir 2-adım, iç içe geçmiş PCR Protokolü V3/V4 değişken bölge ve Its / 5.8s rRNA spacer bölge. Her astar ve 2 ana mix x
      1. ekleyin 12.5 µL DNA'ın 5'e pmol. (16S veya Its; bkz. Tablo 1) her bölge için ayrı reaksiyonlar olun. Gene özel sıraları için sequencer özel bağdaştırıcı çıkıntı nükleotit dizileri eklemek için yukarıda açıklanan 39 , 40 olarak bölge belirli astar değiştirmek.
      2. İlk amplifikasyon aşağıdaki parametreleri kullanarak gerçekleştirmek: 25 3 dk. ilk denatürasyon 95 ° c döngüleri (30 s 95 ° c, 30 s 55 ° c, 30 s 72 ° c), 5 min son uzantısı ' 72 ° C.
      3. Aşağıdaki ilk amplifikasyon, Kütüphane boyutu ve miktar tarafından elektroforetik hareketlilik doğrulayın ve 1 birim katı faz ters çevrilebilir imm x kullanılarak temizleArtık astar ve reaksiyon Kimyasalları kaldırmak için obilization boncuk. Havuz 16S ve kantitatif her örnek için bir tek amplicon havuzu oluşturmak için amplicons.
      4. Sequencer belirli bağdaştırıcıları eklemek ve belirli ikili dizinler (bkz. Tablo 1) aşağıdaki primerler kullanılarak örnek. Güçlendirilmiş DNA'ın 2.5 µL her astar ve 2 ana mix x 5 pmol ekleyin. Aşağıdaki parametreleri kullanarak kütüphane amplifikasyon gerçekleştirmek: 8 3 dk. ilk denatürasyon 95 ° c döngüleri (30 s 95 ° c, 30 s 55 ° c, 30 s 72 ° c), 5 min son uzantısı ' 72 ° C.
    4. Aşağıdaki PCR, temiz bitmiş kitaplıkları bir 1 x birim katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon boncuk için. Kalite ve miktar elektroforetik hareketlilik ve fluorometry, sırasıyla kullanarak bitmiş kütüphanelerin değerlendirmek. 2 µM ve sıralama önce havuzu için kitaplıklarına standartlaştırmak.
    5. Tüm amplicon 41 karşılamak için uygun bir uzunlukta ikincil PCR eklenen bağdaştırıcılarına benzer bir platform üzerinde yeni nesil sıralama gerçekleştirmek.
  6. Sıra ek açıklama ve mikrobiyal kompozisyon analizi.
    1. Birleştirme çift uçlu sıralama veri (R1 ve R2) tüm sıralı kitaplıkları için tek contigs. R1 ve R2 dosyalarını birleştirdikten sonra her kitaplık için bir tek fasta dosyası üretilir.
      Not: Mothur sürüm 1.38.0 38 bu adım ve (aksi belirtilmedikçe) aşağıda açıklanan işlemler gerçekleştirilir.
    2. Belirsiz bazlar, beklenmedik uzun serileri ve uzun homopolymers kaldırmak için her fasta dosya ekran.
      Not: Tarama ve sıra kaldırma maxambig parametreleridir = 0, maxlength = 600 ve maxhomop = 8 her iki genler için. Aynı sıraları kaldırmak, ancak bir contingence tablo tüm kitaplıkları (aka Mothur sayısı tablo) için ayrı ayrı devam.
    3. SILVA veritabanı sürümü 123 karşı gen 16S Kütüphane ve gen Its Kütüphanesi birleştirmek Its veritabanı 42 karşı benzersiz sıraların hizalayın.
      Not: Dizileri cins seviyeye Krallık düzeyden açıklanmalıdır.
      1. Daha sonra küme uyumlu dizileri diff kullanarak işlev pre.cluster ile = 5 ve chimeras kaldırın.
    4. İstimal belgili tanımlık yöntem SILVA (için gen 16S) ve onun birleştirmek (için gen Its) taksonomi dosyalarını (kesme biçimi değerini % 80) göre Wang 43 dizileri sınıflandırmak.
    5. R 44 Mothur sınıflandırma işlemi sırasında oluşturulan contingence tabloları (gen başına bir adet) yükleyin. Taksonomik her düzeyde, mikrobiyal topluluk değişiklikleri daha iyi inceleyebilmemiz için kütüphane başına göreli bereket almak.
      Not: göreli bereket tüm deneysel yinelemeleri için % 2'den az olduğunda taksonomik her düzeyde, taksonomik grupların birleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Saha kafes çalışması:

Kafes deneylerden elde edilen veriler bumble arı kolonileri mantar ilacı maruz kalma önemli bir tepki olduğunu göstermiştir. Mantar ilacı tedavi kovanlarını kontrol kovanları daha önemli ölçüde daha az işçi (12,2 ± 3,8, ortalama ± SE) üretilen (43,2 ± 11,2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (şekil 4). Ayrıca, arı biyokütle mantar ilacı tedavi kurdeşen (0,91 g ± 0,15) denetim kurdeşen (2,36 g ± 0,55; önemli ölçüde daha düşük F 1,9 8.3, p = 0.02 =). Bu desen yapılan kovanlarını mantar ilacı tedavi indirdi biyokütle Ayrıca anne kız arasında gözlendi. Queens denetim kurdeşen (0,27 g ± 0,01; daha önemli ölçüde daha düşük bir biyokütle (0,14 g ± 0,04) mevcuttur mantar ilacı tedavi kurdeşen queens Z 2.5, p = 0,01 =). Ancak, mantar ilacı pozlama tedaviler arasında larva, Pupa ve erkek sayısını etkilemedi. Ayrı yaşam evreleri (larva, Pupa, işçiler ve yetişkin erkekler) ve bireysel ağırlık larva, Pupa ve işçiler için biyokütle mantar ilacı tedavi arasında herhangi bir fark yoktu ve denetim hives.

Laboratuar tabanlı çalışma:

Laboratuvar tabanlı deneylerden elde edilen veriler belirtilen mantar ilacı pozlama önce istatistiksel olarak karşılaştırılabilir ortalama çalışan sayısı kontrol ve mantar ilacı tedavi kovanları vardı (kontrol kurdeşen = 28.0 ± 3.1; mantar ilacı tedavi kurdeşen = 31.67 ± 2.0; n = 3 her) ve kraliçe ağırlık (kontrol kurdeşen = 0,77 g ± 0,04; mantar ilacı tedavi kurdeşen = 0,74 g ± 0,01). Ancak, çalışma sonunda, işçi sayısı kontrol kurdeşen (67.67 ± 4.3), mantar ilacı tedavi kurdeşen (45.33 ± 3.8) göre anlamlı olarak daha yüksek oldu (t4 3.89, p = 0,01 =). Çalışan nüfus kontrol kovan kovan mantar ilacı tedavi ~ %45 göre ~ %150 artmış. Benzer şekilde, Ana Kraliçe son ağırlığı nispeten % ~ 35'e göre kurdeşen (0,76 g ± 0,02) mantar ilacı tedavi kurdeşen (0,49 g ± 0,16) azaltmak denetimindeki değişmemiştir. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar daha önce yayımlanmış sonuçları25 ile tutarlı ve mantar ilacı pozlama olarak daha az sayıda işçi sayılarla kanıtlanan koloni fitness etkilenen ve Ana İmparatoriçe ağırlık (şekil 5) azaltılmış gösterir.

Polen-hükümler analizini Metagenomic toplanan mikrobiyal topluluklar arasında belirgin farklılıklar mantar ilacı tedavi ve kurdeşen (şekil 6) kontrol göstermiştir. Bir azalma oldu (> % 95) yaygın olarak izole Streptomycetales, Enterobacteriales mantar ilacı tedavi kovan içinde göreli bolca. İlginçtir, her iki bu grubu antifungal etkinlik ve polen-koruma30,45 eşek arısı kovanı ortamlar içinde rol için bilinir. Bakteriyel Rickettsiales, eklembacaklılar46ortak patojenler içeren sipariş üyeleri daha fazla bolluk içinde tedavi mantar ilacı kurdeşen gösterdi. Mantar ilacı tedavi kovan Eurotiales ve Sordariales siparişe ait mantarlar daha düşük bir bolluk ve emir Capnodiales ve Ascosphaerales kontrol kurdeşen (Şekil 7) göre daha yüksek bir bolluk vardı. Bakteri ve mantar, için beklendiği gibi Shannon'ın çeşitlilik indeksi (H) ve düzgünlüğünü (E) alt mantar ilacı tedavi kurdeşen kontrollere, göre her ne kadar bu farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildi (bakteri: H kontrol kovan =1,25 ± 0,3, Hmantar ilacı tedavi kurdeşen = 0,82 ± 0.2, EDenetim kurdeşen = 0,46 ± 0,1; Emantar ilacı tedavi kurdeşen = 0.31 ± 0,1; mantarlar: HDenetim kurdeşen =0.99 ± 0,3, Hmantar ilacı tedavi kurdeşen = 0,72 ± 0,4, EDenetim kurdeşen = 0,57 ± 0.2; Emantar ilacı tedavi kurdeşen = 0,42 ± 0.2). Her ne kadar böyle topluluk metabolik ve fonksiyonel sonuçları ayrıntılı vardiya bu çalışmanın kapsamı dışındadır, koloni sayımı ve ağırlık veri ile birlikte, bu sonuçlar mantar ilacı pozlama koloni sağlık tarafından düşüş etkileyebilecek öneririm Arılar ve polen microbiome arasındaki sembiyoz dağıtmak. Larva yaşayanlar etkileyen belirli mikrobiyal gruplarının rolü içine daha fazla araştırma sağlıklı arı nüfus sürdürülmesi, polen microbiome rolünün daha iyi değerlendirmek için önerilir.

Figure 1
Şekil 1: Bombus Impatiens yuva içinde. Yüksek çözünürlüklü görüntü damızlık hücrelere eğilimi işçilerin. Damızlık hücreleri herhangi bir anda birkaç yumurta ve larva içerebilir. Larva geliştirme düzenli olarak odanın içine tanıttı polen hükümler beslenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: büyük alan kafes inşa arı kolonileri evine. Her kafes kafes (N = 10) ile bir ticari satın Aralık Bombus Impatiens kovan yanı sıra bloom bitki arılar çekmek için bilinen türler. Çiçekler kafesin bir köşede stoklanmayacaktır ve kalan alan yulaf çim vegetated. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: son zamanlarda püskürtülür ayçiçeği üzerinde mantar ilacı kalıntı. Mantar ilacı alan ilgili doz günde 0 ile 13 deneme püskürtülür. Bir böcek ilacı püskürtme kullanarak, çiçekler eşit bir mantar ilacı çözüm alacakaranlık/akşam saatlerinde yiyecek arılar ile doğrudan temas önlemek için kaplı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: mantar ilacı kalıntı kafes deneyinde bumble arılar üzerinde etkileri. Mantar ilacı kalıntıları üzerinde polen sinin bumble bee kolonilerin koloni boyutu (reduct önemli düşüşler sergilediyetişkin kadın bereket iyonu) tek bir ay boyunca. Hata çubukları ± 1SE temsil eder; p < 0,05. Bu rakam Bernauer ve ark. güncellenmiştir 25. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Laboratuvar tabanlı bir denemede bumble arılar üzerinde mantar ilacı kalıntı etkileri. Mantar ilacı tedavi polen sinin bumble arı kolonileri tek bir ay boyunca koloni boyutu (yetişkin alt bereket indirimleri) önemli düşüşler ve Ana İmparatoriçe ağırlık düşüş sergiledi. Hata çubukları ± 1SE temsil eder; p = 0.03. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: pasta grafiği metagenomic sınıflandırma sipariş rütbe, mantar, küf ve bakteriyel çeşitliliğin. (Bir) 16S ve (b) dayalı ITS sınıflandırma polen tedariki örnekleri üzerinde dayalı analizleri denetim ve mantar ilacı tedavi kurdeşen toplanan. Denetim kovanları daha yüksek çeşitlilik ve düzgünlüğünü mikrobiyal dağıtım gösterdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: yüzde değiştirmek sipariş rütbe göreli bolca bakteri ve mantar mantar ilacı pozlama cevaben. Metagenomic (bir) 16S kullanarak mikrobiyal topluluklar sınıflandırılması ve (b) Its esaslı astar Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Astar çifti Astar türü Astar sıra
28KJ/28B Bitki GGC GGT AAA TTC CGT CC /
CGT MOLDOVA'DA TGT TTC AAG ACG
ITS1 / ITS5.8 Mantar TCC GTA GGT GAA SKK GCG G /
ATC CGT TGT TGA AAG TT GAG
16s ileri / geri İç içe geçmiş bakteriyel 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTACGGGNGGCWGCAG-3'/
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'
ITS1F astar / ITS4 Mantar iç içe 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCGTAGGTGAACCTGCGG - 3'
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC - 3'
Bağdaştırıcı astar 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC [55555555]
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [77777777]
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT -3 '

Tablo 1: astar çiftleri ve DNA amplifikasyon içinde kullanılan astar dizileri listesi. Başvurular için metnine bakın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etkisi soruşturmalar arı sağlığı üzerinde mantar ilaçları, böcek Yönetim Stratejileri çöküşünde bir yönünü kalmıştır. Bizim çalışma a maiyet-in açıkça arı düşüşler sürüş potansiyel faktörler izole tamamlayıcı teknikleri kullanarak bu bilgi boşluğu amaçlamaktadır. Planlama, mantığı ve işleme bu deneyler aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Hayır arılar bu demografi analiz taviz verecek bu yana kafes kafes deneyleri kaçmasına izin emin olmak önemlidir. Yapay yuva yağmur ve doğrudan güneş ışığından korumak için yeterli yalıtım var önemlidir. Böylece mantar ilaçları yuva üzerinde doğrudan püskürtülür değil dikkat edilmelidir. Koloniler ile şeker su sidiktorbası toplanan nektar ek ve su kaybı önlemek için sağlanmalıdır.

Laboratuvar besleme denemeler tabanlı için polen yemek hazırlarken kontaminasyonu önlemek için sıkı aseptik koşullar sağlanmalıdır. Ticari olarak satın alınan polen toz ve UV kullanılmadan önce sterilize. Kovan hijyen istila yabancı parazitler kiler pervane ve hamam böcekleri gibi gelen önlemek için muhafaza edilmelidir. Sıvı sidiktorbası sterilize şeker çözeltisi ile su kaybı önlemek için takıma. Ön arıtma nüfus sayımı için değil stres için arılar aşırı işleme ve uzun süreli için hived dışında tutarak özen gösterilmelidir dönemleri.

DNA verim yaş ve malzeme başlama türü üzerinde bağlı olarak, sadece taze veya dondurulmuş iyi örnekleri DNA ekstraksiyon ve amplifikasyon içinde kullanılması gerekir. Bu DNA verimi düşürür gibi örnek ağırlık DNA ekstraksiyon 0,25 gm, aşmaması gerekir. DNA verimleri Jel Elektroforez kullanarak sayısal. Ayarlıyoruz elektroforetik miktar izole DNA'ın verimli amplifikasyon47emin olmak için qPCR reaksiyonlar geçmeden önce önemlidir.

Metagenomic analiz için daha kapsamlı bir analiz mikrobiyal dinamik (dizileri arasındaki tolere edilebilir farklar kısmını rahatlatıcı tarafından) Açıklama eklediğiniz dizileri miktarını sınırlayarak ve taksonomik grup sayısı olarak azaltarak elde edilebilir su kuyusu aynı derecede o göreli bereket oldukça düşük olduğu birleştirme (< % 2).

Muhafazakar örnek boyutu (N = 5 için her iki mantar ilacı tedavi ve tedavi edilmezse kafes çalışma kurdeşen) gelecek çalışmalarda büyük çoğaltma kullanarak minimize verilerdeki farklarını şişirmek. Daha fazla çözünürlük ve istatistiksel güç sonuçlar ekleyin, arı kolonileri önce ve mantar ilacı maruz kaldıktan sonra censused ve asılı olacaktır. Kafes deneme için daha uzun süre çalışan bir ek yanıt değişken olarak hizmet verebilir yeni kraliçelerin üretim izin verir. Geçerli protokol için bu değişiklikleri ile gelecekteki çalışmaları kovan nüfus dinamikleri hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlar.

Polen hidrofobik doğası onun verimli su ile karıştırılarak engeller. Ezildiği ve polen tanecikler için ince bir toz eleme, karıştırma sürecinde yardımcı olur. Polen tozu miktarını istenilen kıvama ulaşmak için ayarlanabilir. İyice karıştırın sıvı (su veya mantar ilacı) aktif maddeler ve toplayıcılar bile teslim homojen bir dağılım elde etmek için özen gösterilmelidir.

Aşırı DNA PCR reaksiyonları inhibe olabilir gibi bu örnek bu DNA, verim düşürücü kesmeleri 0,25 g. aşırı vortexing kaçınılmalıdır daha tartmak gerekir değil önerilir. Düşük DNA verim lizis arabellek için uzun süreli maruz kalma sonucu da olabilir. Bakteriyel astar, non-spesifik amplifikasyon kloroplast DNA48en aza indirmek için tercihen 16S rRNA V7-V9 bölgeden seçilmelidir. Ayrıca, sıralama 18S ribozomal RNA geni gibi diğer genlerin mikrobiyal çeşitlilik polen içinde hem de mantar ilacı kullanımı üzerine nüfus değişiklikleri daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir.

Mothur ile işlemek için kitaplıklarına miktarı göz önüne alındığında, bilgisayar zaman oldukça yüksek olabilir. Tek çocuk dizileri birbiriyle karşılaştırırken kaldırma (kaynakları sınırlı bilgi işlem, onları chimera filtrasyon önce kaldırın) operasyonel taksonomik birim bilgi işlem için gerekli zamanı önemli ölçüde azaltabilirsiniz.

Kafes deneyler (aksine onları yaygın olarak manzara karşısında yem için izin) arılar doğal uçuş aralığını sınırlandırmak ve belirsiz gibi sınırlamalar için yanıt değişkenler etkileyebilir derecesi. Kontrol ve tedavi kafesleri biyotik ve abiyotik değişkenleri aynı aralıkta deneyim rağmen lojistik her kafes içinde microenvironment için kontrol etmek mümkün değildir.

Gerçek topluluk içindeki mikrobiyal etkileşimleri çok karmaşık ve deneysel çalışmadan çoğaltmak için karmaşık kapsamıdır. Polen-hükümler içinde toplam mikrobiyal çeşitliliğin bir alt belge büyük olasılıkla bizim veri, bakteri ve mantar mantar ilaçları varlığı/yokluğu arasında geçerli olabilir etkileşimli etkileri ilk içgörü iken.

Hizalamak için alternatif veritabanlarını kullanma49 dizileri veya polen bakteri çeşitliliği50 üzerinde alan fonksiyonel metabolik durumlar tahmin polen microbiome daha geniş bir görünümünü sağlayabilir. Sonunda, mikrobiyal topluluklar metabolik ve fonksiyonel dinamik mantar ilacı uygulamadan sonra daha iyi karakterize etmek için tüm genom sıralama polen microbiome, gereklidir.

Kafes deneyler ticari olarak satın alınan kurdeşen kullanarak bir yanıt değişkenler yarı kontrollü bir ortamda ölçmek için en iyi çerçeveler sağlamak. Arılar doğal ekoloji (yiyecek verimlilik, sosyal yapı, çoluk çocuk bakım) için en az değişiklik neden, kafes deneyler entrika ve stres, yapay çevre ve laboratuvar tabanlı sırasında işleme Kılavuzu tarafından tanıtılan en aza indirmek deneyler.

Bizim bilgi en iyi şekilde, hiçbir çalışma henüz mikrobiyal topluluk dinamikleri bumble arı polen sağlanması içinde mantar ilaçları etkilerini değerlendirmek için yapılmıştır. Mantar ilaçları maruz bir veya daha fazla hassas türler arasında mantar ve bakteri ekolojik ateşkes engellemeden, ortadan kaldırabilir. Alan ve laboratuar tabanlı deneme sürümleri bu etkileşimler oynamaya bir pota kullanarak, bu çalışma ikamet mikrobiyal türlerin yok oluşu uzlaşma arı sağlık sırayla polen microbiome ekolojik dengesini sapık göstermek amaçlamaktadır.

Seyreltme ve standart medya yakalama üzerine kaplama gibi kültür bağımlı teknikleriyalnızca bir kısmını mikroflorası gelen belirli bir ortamda. Bu mikrobiyal çeşitlilik brüt bir underrepresentation için açabilir ve unculturable mikrop tespit edilmeden51gidebilir. Mikroorganizmaların genişliğini çalışmaya, bilim adamları daha kapsayıcı ve kapsamlı, örneğin metagenomic analiz ve yeni nesil sıralama için kültür bağımsız teknikleri güvenmek gerekir. Ağır bu güçlü moleküler teknikleri çizim, bu çalışma daha geleneksel kültür tabanlı teknikleri tarafından yalnız sağlanan polen microbiome içine daha fazla çözünürlük elde amaçlamaktadır.

Bu çalışmada sonuçlarından çalışanları için mantar ilacı maruz bumble arı kolonileri içinde sayısı derin kayıplar ortaya çıkardı. Bumble bee colony başarılı olmak işçiler yeterli kaynakları sağlamak ve anne-Kraliçe'nin ve özellikle larva geliştirmek için bakım gerekiyor. Sonuçta, koloni amacı mümkün olduğunca çok sayıda kızı-queens yaz sonunda üretilen öyle ki kaynak yakalama (polen ve nektar) maksimize etmektir. Sağlıklı kızı-queens bir koloni uygunluk ölçüsü vardır. İşçiler, büyük düşüşler sonra etkili bir şekilde koloni'nın yetenek queens ertesi yıl üretmek için kesme. Bu çalışmada sadece işçi sayıları önemli ölçüde azalma vardı ama muhtemelen bir sonucu olarak yetersiz gıda tedariki toplayıcılar tarafından alt biyokütle ile sunulan kurdeşen mantar ilacı anne Queens'den tedavi. Polen-hükümler içinde mikrobiyal etkileşim karmaşıklığı göz önüne alındığında, bu kalıpları için katkıda bulunan bakteri ve mantarlar arasında tam etkileşimli efektleri ayırt etmek zordur. Ancak, çoğaltılmış ve yinelenen deneylerden elde edilen sonuçları burada açıklandığı gibi bu iki mikrobiyal gruplar arasında değişen symbioses hayati anlayışlar (rekabet, ilişkilerden, komensal ya da) sağlayacaktır xenobiotic stres için yanıt ve aşağı akım etkileri polen microbiome.

Güçlü moleküler araçlar kullanılarak, polen microbiome ekolojik karmaşıklığı daha iyi çözülebilir. Ön anlayışı doğal olarak meydana gelen bakteri ve mantar, topluca koloni fitness korumak için katkıda bulunan bir bolluk ortaya koymaktadır. Özellikle, polen-hükümler izole edildi Mayalar ayı bakteri yok edici ve fermantatif özellikleri, ikisi de larva arılar gelişimi için çok önemli olduğu bilinmektedir. Arılar ve onların polen microbiome arasında mutualizm yüksek derecede düşündüren ekolojik böyle ilişkilerdir. Polen-hükümler, bu nedenle, anahtar işlevsel rolleri oluşan bir mikrobiyal topluluk ekimi tarafından getirdiği bir acil çeşitlilik etkisi temsil eder. Bu anahtar simbiont yokluğunda, polen tedariki için bilinmeyen derece tehlikeye görünüyor. Bu yönde devam etmek iş büyük olasılıkla bu mikropların işlevsel çeşitlilik açıklamak ve arı simbiont olarak meydana çıkarmak.

Son araştırmalar arılar19' a,24,52,53,54zararsız varlık olarak mantar ilaçları kavramı debunked. Bu araştırmanın amacı mantar ilacı etkileri arılar, böylece mantar ilacı kullanımı ve arı düşüşler neden-sonuç ilişkisi ışıklı sürüş mekanizmaları izole etmektir. Hipotezler Merkezi arı-mikrop symbioses önemli ölçüde tarafından polen mantar ilacı kalıntılarında değiştirilmiş bu konsept etrafında. Sonuçta, bu iş nasıl mantar ilaçları görüntülenebilir ve tarım ve kentsel ortamlarda kullanılan yeniden çerçeve. Tarımsal üretim uygulamaları için ilgili olarak mevcut küresel tozlayıcı kriz ışığında önerilen araştırma yerel arı ekoloji, yeni bilgi üretir. Mantar ilaçları çiçeklenme sırasında bitkileri uygulamaları sınırlama düzenlemeler etkili muaf için son agrichemical grup kalır. Sonuç olarak, yönetilen ve vahşi arılar sürekli mantar ilaçları için sunulur. Edebiyat büyüyen vücut mantar ilaçları temas, yüksek dozda, arılar ölümcül olmamakla birlikte pozlama oldukça zararlı, daha yüksek larva ölüm21 ' e lider olduğunu ve forager davranış değişmiş, öneriyor. Bu eser hangi polinatörler mantar ilaçları zarar mechanism(s) yanacaktır bekleniyor. Ayrıca, bu araştırma daha akıllıca haşere yönetim ilkesi oluşturmaktadır ve yetiştiricileri en iyi yönetim uygulamaları bilgilendirmek. Bu eser de hangi pestisit yasa ve yönetmeliklere etkileyebilir geliştirilmiş böcek ilacı püskürtme, yönergeleri teslim vesile olacaktır. Daha geniş, bu bulgular içinde çiçekli bitkiler ziyaret edildi polen toplama tarafından yönetilen herhangi bir ekosistem ile ilgili olacaktır böcekler. Arı özel küresel tahminler ile olağanüstü yüksek55,56, varlık Bu eser arı nüfus düşüş vektörünün etkileri azaltılabilir Eğer tozlaşma Hizmetleri olası etkileri önemli olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazar(lar) amplifikasyon ve sıralama özellikleri ve Hizmetleri, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto ve Max Haase ile teknik yardım sağlamak için sağlamak için Wisconsin Üniversitesi biyoteknoloji Merkezi DNA sıralama tesis teşekkür Moleküler analizi. Bu eser USDA tarımsal araştırma Servisi tahsis fonlar (geçerli araştırma bilgi sistemi #3655-21220-001) tarafından desteklenmiştir. Daha fazla destek (altında Grant No Ulusal Bilim Vakfı tarafından sağlanan Deb-1442148), DOE büyük göller biyoenerji Araştırma Merkezi (Office DOE bilim BER DE-FC02-07ER64494) ve USDA Ulusal Enstitüsü gıda ve Tarım (Hatch projesi 1003258). C.T.H. biyomedikal Bilimleri ve bir Alfred Toepher öğretim görevlisi, sırasıyla Pew Charitable güvenir ve Alexander von Humboldt Vakfı tarafından desteklenen bir Pew yazardır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Natupol Beehive Koppert USRESM1 16 hives
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Abound Syngenta 4033540 Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil Syngenta 3452 Fungicide used for trials
Pollen granules Bee rescued B004D5650C 3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation Currie Lab
Yeast strains for inoculation Hittinger lab
Primer pairs UW Biotech Center
DNA Isolation Kit Mo Bio 12830-50 Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX Thermo Fisher 4472952 Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855196 Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit, Axygen 10159-696 Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer Illumina Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters) VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
  2. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, Suppl 1. S80-S95 (2010).
  3. Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
  4. Vanbergen, A. J. Insect Pollinators Initiative. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
  5. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
  6. Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines? Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
  7. Klein, A. -M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
  8. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  9. Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
  10. Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
  11. Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), New York, N.Y. 348-350 (2012).
  12. Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
  13. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  14. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
  15. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
  16. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
  17. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
  18. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754 (2010).
  19. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182 (2013).
  20. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  21. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547 (2014).
  22. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  23. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
  24. van Engelsdorp, D., et al. "Entombed Pollen": A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
  25. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  26. Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
  27. Huang, C. -Y., Ho, C. -H., Lin, C. -J., Lo, C. -C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
  28. Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
  29. Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
  30. Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
  31. Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
  32. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  33. Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125 (2013).
  34. Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
  35. Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency? Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
  36. ThermoFisher Scientific. User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf 3-6 (2010).
  37. Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
  38. Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
  39. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
  40. White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  41. Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. , Available from: http://ngs.biodiv.tw/NGSCore/wp-content/uploads/Documents/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017).
  42. Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
  43. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  44. Team, R. C. R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2015).
  45. Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
  46. Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
  47. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  48. Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
  49. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  50. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
  51. Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
  52. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  53. Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  54. Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
  55. Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235 (2012).
  56. Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals? Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).

Tags

Çevre Bilimleri sayı: 128 Koloni Daralt bozukluğu metagenomics mikrobiyal çeşitlilik microbiome polen Maya
Ampirik, Metagenomic ve bilgisayar teknikleri mekanizma hangi mantar ilaçları uzlaşma arı sağlık ile aydınlatmak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steffan, S. A., Dharampal, P. S.,… More

Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L., Currie, C. R., Zalapa, J., Hittinger, C. T. Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health. J. Vis. Exp. (128), e54631, doi:10.3791/54631 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter