Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Studier av virale vektorer i et tredimensjonalt Liver Modell repopulated med Human leverkreft cellelinje HepG2

Published: October 24, 2016 doi: 10.3791/54633

Abstract

Denne protokollen beskriver generering av en tredimensjonal (3D) ex vivo lever modell og dens anvendelse i studier og utvikling av virale vektorsystemer. Modellen blir oppnådd ved repopulating den ekstracellulære matriks av en decellularized rottelever med en human hepatocytt-cellelinje. Modellen tillater studier i en vaskularisert 3D cellesystem, erstatte potensielt skadelige eksperimenter med levende dyr. En annen fordel er det humaniserte arten av den modell, som er nærmere human fysiologi enn dyremodeller.

I denne studien demonstrerer vi transduksjon av denne lever modell med en viral vektor avledet fra adeno-assosiert virus (AAV vektor). Perfusjon kretsen som forsyner 3D leveren modell med media gir en enkel måte å søke vektoren. Systemet tillater overvåkning av de viktigste metabolske parametre i leveren. For endelige analysen, kan vevsprøver tas for å fastslå omfanget av recellularizasjon ved histologiske teknikker. Fordeling av viruset vektoren og ekspresjon av transgenet levert kan analyseres ved kvantitativ PCR (qPCR), Western blotting og immunhistokjemi. Tallrike anvendelser av vektoren modellen i grunnleggende forskning og utvikling av genet terapeutiske anvendelser kan tenkes, inkludert utvikling av nye antivirale terapeutiske midler, kreftforskning, og studiet av virale vektorer og deres potensielle bivirkninger.

Protocol

MERK: RL fått etisk godkjenning for explantation av organer fra Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Livers ble eksplantert fra Wister rotter. Inferior vena cava og portalvenen til leveren ble kanylert med en 22 G kanyle. Metoder for decellularization av eksplanterte lever har blitt beskrevet tidligere. 4,5 Den ekstracellulære matriser brukes her ble oppnådd ved overdreven perfusjon av en rottelever med 1% natrium deoxycholate.

1. Recellularization av ekstracellulær matriks (ECM) av et rottelever

  1. Utvidelse av levercellelinjen HepG2
    1. Kultur den leverkreft cellelinje HepG2 i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium supplert med 10% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin, og 2 mM av penicillin og streptomycin, hver.
    2. Seed 1,5 x 10 7 celler i T175 flasker og dyrke cellene ved 37 ° C og 5% CO2 5% CO2.
    3. Spinne ned cellene ved 300 xg og resuspender dem i 4 ml PBS og tell cellene med et Neubauer kammer under et mikroskop. En T175 flaske vil gi ca 4,5 x 10 7 celler.
      MERK: Pass på at kulturen inneholder tilstrekkelig antall celler for recellularization av rottelever ECM med 6 x 10 8 HepG2 celler per ECM (10 x 175 cm 2 kultur kolber med 4-5 x 10 8 celler hver).

Figur 1
Figur 1. Bioreactor system. A) Dette bioreaktor systemet var skreddersydd. Det opprettholder modeller orgel ved 37 ° C og 5% CO 2. Strømningshastighetene for de peristaltiske pumper kan reguleres individuelt. B) Leveren er plassert i et vekstkammer og kobleed til perfusjon krets, som består av en peristaltisk pumpe, et medium reservoar, en boble felle og en trykksensor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Recellularization av ECM
    1. Sett opp bioreaktor system, inneholdende en lever perfusjon kammer, en perfusjon system, et reservoar av medium og en boblefelle. Steril bioreaktoren systemet (121 ° C, 15 min).
    2. Koble bioreaktor systemet med en peristaltisk pumpe og legg den i en inkubator tilby egnede forhold (37 ° C, 5% CO 2). Plasser decellularized rottelever stillas 8 i leveren perfusjon kammeret i bioreaktoren system (figur 1).
    3. Koble cannulated portvenen og vena cava med tube klipp til perfusjon system. Ekvilibrere stillas med 150 ml RPMI-medium (som beskrevet under 1.1)i løpet av 5 d med en strømningshastighet på 1,25 ml / min.
    4. Koble fra leveren stillaset fra mediekretsen og inokuler stillaset med 3 x 10 8 HepG2-celler (i 5 ml) via portalvenen ved anvendelse av en 5 ml sprøyte, unngå luftbobledannelse og tillate cellene å repopulere ECM ved å inkubere dem for 1 time i stillaset med pumpen slått av.
    5. Gradvis øke strømningshastigheten ved å justere pumpen, og starter med 1,25 ml / min i 10 min; 2,5 ml / min i 20 min og til slutt 3,75 ml / min i 30 min.
    6. Gjenta trinn 1.2.4-1.2.5 å nå en total celle nummer av 6 x 10 8.
    7. Kjør bioreaktor systemet ved en strømningshastighet på 3,75 ml / min. Kultur recellularized rottelever i 2 uker.
      MERK: Erstatt en tredjedel av mediet med friskt medium (50 ml) annen hver dag. Smak på kulturmediet for å måle fysiologiske parametre, som for eksempel laktat dehydrogenase-aktivitet, pH i medium prøver og konsentrasjonen av glukose og laktat.

2. Transduksjon av Recellularized rottelever

  1. Storskala produksjon av AAV vektorer
    1. Fremstille, rense og kvantifisere AAV-vektorer som er beskrevet tidligere: 11
      1. Kort, produsere AAV vektorer i rulleflasker og rense dem ved iodixanol gradient sentrifugering. Fjerne gjenværende iodixanol ved filtrering over PD10 gel filtrerings kolonner. Bestem AAV vektor-konsentrasjonen ved hjelp av qPCR genomisk DNA AAV som en standard.
        NB: Den selvkomplementære, pseudotyped AAV2 / 6-vektoren som brukes i den foreliggende undersøkelse kodet EmGFP som en reporter for å demonstrere transduksjon effektivitet og et shRNA ekspresjonskassett for knockdown av et endogent uttrykte genet (human cyklofilin B (hCycB), Figur 2) . Sikre en tilstrekkelig mengde pseudotyped scAAV vektorer av serotype 6 (2,7 x 10 13 AAV vektorer per leveren modell).

Figur 2
Figur 2. Kart over den selv-komplementære, pseudotyped AAV2 / 6-vektoren som brukes i den foreliggende undersøkelse. Genomet består av inverterte terminale gjentakelser (ITR) av AAV2 og koder EmGFP under kontroll av CMV-promoteren, så vel som en shRNA under kontroll av en U6 promoter. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Transduksjon av Liver Model
    1. Juster AAV vektor oppløsning til en endelig konsentrasjon på 2,7 x 10 13 vektorgenomer i 5 ml ved å tilsette de respektive volum av PBS.
    2. Koble fra leveren fra mediekretsen ved å fjerne produksjonsrøret fra kanylen. Koble til en 5 ml sprøyte til kanylen fra portvenen og injisere den komplette AAV vektor-løsning (5 ml).
      MERK: Optionally, tilsett fenolrødt (5 ug / ml) for å følge fordelingen av AAV vektor oppløsningen gjennom leveren.
    3. Inkuber i 1 time uten pumping. Gradvis øke strømningshastigheten, med utgangspunkt i 1,25 ml / min i 10 min; 2,5 ml / min i 20 min og 3,75 ml / min i 30 min. Kultur recellularized rottelever over 6 dager.
      MERK: Bytt ut en tredjedel av mediet som gitt i note under 1.2.7

3. Vurdering av Recellularized transduced Rat Liver

  1. Hematoxylin og eosin (HE) farging og Immunhistokjemisk analyse
    1. Ta prøver (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) fra hvert leverlapp med en skalpell.
    2. Inkuber prøver (fra 3.1.1) i 4% paraformaldehyd (PFA) + 4% sukrose-løsning i 1,5 timer ved 4 ° C. (OBS: PFA er giftig og kreftfremkallende Hold alltid PFA innenfor et avtrekksskap og bruke egnet verneutstyr..) Vask tre ganger med PBS (1 min per vask trinn) og inkuberes i 8%sukrose natten ved 4 ° C.
    3. Hell fikse medium i plast cryomolds, plassere prøvene til å fikse medium uten luftbobler. Legg fikse medium til prøven er godt dekket. Lagres innleiret prøver ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
    4. Forbered kryo-seksjoner (10 mikrometer) med en cryotome 12. Vurdere recellularization av hematoxylin + eosin farging 8. Vurdere transduksjon effektiviteten ved immunhistokjemisk farging for genet-of-interesse (her: EmGFP).
  2. Molekylær biologisk prøvetaking
    1. Sample hver leverlapp med en biopsi stempel (4 mm i diameter). Isoler total RNA, DNA og proteiner i henhold til produsentens instruksjoner for vurdering av transgenet uttrykk for EmGFP, og hCycB slå ned 8.

Representative Results

For å vurdere omfanget av recellularization, ble kryo-seksjoner preparert fra hver lapp av hver recellularized leveren modell. Seksjonene ble så analysert med hematoxylin og eosin-farging. Som det kan ses på figur 3 har hver flik av de tre modellene leveren, betegnet som TLM1, TLM2 (transdusert lever modeller 1 2) og Ctrl (kontroll leveren modell som ble recellularized, men ikke transduserte), ble repopulated med HepG2-celler. Dette leverkreft cellelinje ble etablert fra svulstvev av en 15 år gammel argentinsk gutt. Noen områder av leveren modellene ble mer intensivt recellularized enn andre. Årsakene til disse variasjonene gjenstår å bli bestemt.

Figur 3
Figur 3. Hematoxylin og eosin flekken på hver lapp av de tre analyserte lever modeller TLM1 + 2. Transduced leverenmodellene 1 og 2; Ctrl .: kontroll leveren modell som ble recellularized men ikke transduced. Skala: 200 mikrometer. (Re-trykt med tillatelse fra Ref. 8.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I det neste trinnet ble det transduksjon av leveren modellene vurderes. For dette formål ble DNA fremstilt fra 28 hull biopsier av hver av leveren modellene og vektoren titer ble kvantifisert ved qPCR. I gjennomsnitt ble 55 og 90 intern vektorgenomer per celle (VG / celle) målt for de to omsatte lever modeller. Eksperimenter i 2D cellekultur har vist 30 VG / celle er tilstrekkelig for sterke transgene uttrykk og RNAi-mediert stanse. Produksjonen av EmGFP ble analysert ved RT-PCR og Western blotting. Faktisk var ekspresjonen av reporter påvist i 80-90% av biopsier på mRNA og proteinnivå, respektivt.8 For å få et helhetlig bilde av transduksjon effektivitet, ble kryo-seksjoner immunohistologically analysert. Som det kan ses i figur 4, deler av leveren modellen som ble vellykket recellularized, som visualisert etter DAPI-farging, ga også sterke fluorescente signaler i immunhistokjemisk analyse av EmGFP uttrykk. Som forventet, kontroll leveren modellen, ikke behandlet med AAV-vektorer, ikke viste noen EmGFP uttrykk.

Figur 4
Figur 4. Immunhistokjemisk analyse av EmGFP uttrykk Celler som repopulated leveren modellene ble visualisert ved farging DAPI (blå).; EmGFP ekspresjon ble visualisert ved hjelp av immunokjemiske farging (rød). TLM1 + 2: omsatte lever modeller 1 og 2; Ctrl .: kontroll leveren modell som ble recellularized men ikke transduced. Skala: 200 mikrometer. (Re-trykt med tillatelsefra Ref. 8.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I et siste forsøk ble AAV-mediert knockdown av hCycB analysert ved QRT-PCR. Knockdown av hCycB ble funnet å være mellom 70 og 90%, i gjennomsnitt over alle flikene av de to transduserte levermodeller (figur 5).

Figur 4
Figur 5. RNAi-mediert knockdown av hCycB i AAV-omformet 3D lever modeller. Stanse av hCycB ble bestemt ved QRT-PCR. Middelverdi og standardavvik (SD) ble beregnet for alle prøver av hver transdusert 3D-modell leveren (TLM1 og 2, henholdsvis) og normalisert til gjennomsnittsverdien av den ikke-transduserte kontroll (Ctrl.). (Re-trykt med tillatelse fra Ref. 8.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

De rekonstituerte 3D lever som er beskrevet her tilveiebringe en modell for å studere virale vektorer i et humanisert system. Repopulation av ECM av et rottelever med en human leverkreft cellelinje som frembringer et vaskularisert system som tillater studiet av store biologiske. Disse resultatene gir en proof-of-concept som rekonstituert leveren modellen kan effektivt transduced med en viral vektor.

For forsøkene er vist her, er hver flik av leveren transdusert av AAV vektor. Men i noen foreløpige eksperimenter, enkle lapper ble ikke repopulated med celler. Det er derfor viktig for å forebygge cellerester eller andre komponenter fra okkludering av det vaskulære system. For å teste om alle lappene kan dynket, kan en ikke-giftig fargestoff som fenol rødt spyles gjennom leveren modell.

En annen viktig sak er å holde leveren stillaset sterile. Mens behandling med etanol eller antibiotika er disadvantageous for det vaskulære system, bestråling av den ekstracellulære matriks med γ-stråling bevart fartøyene og sterilisert prøven.

Videre vil størrelsen av eksplanterte lever forskjellig, slik at antall celler som anvendes for recellularization fremgangsmåte og repopulation tid kan måtte justeres for å oppnå reproduserbare resultater.

Rottelever anvendt i foreliggende studie er forholdsvis stor og krever store mengder celler og test reagenser (f.eks AAV vektorer). I tillegg repopulation prosedyren tok mer enn to uker. Dette begrenser antall gjentak som kan gjøres med rimelig innsats. Vi er for tiden å etablere modell for muselever, som kun er omtrent en femtedel av volumet av rottelever, som tillater bruk av færre celler og mindre test reagenser. Selv om proporsjonal skala ned av celletallet synes rimelig, de nøyaktige beløpene må bestemmes i furthennes eksperimenter.

En annen mangel ved den foreliggende modell er anvendelsen av HepG2 levercellelinje. Forsøk pågår for å utvikle bruken av hepatocytter differensiert fra induserte pluripotente stamceller, som vil gi en fysiologisk mer relevant modell. Videre leveren består av flere celletyper i tillegg til hepatocyttene, f.eks, Kupffer celler og sinosoids. Vi antar at de ulike celletyper vil befolke sine naturlige omgivelser når en ECM er recellularized med flere celletyper.

3D leveren modellen kombinerer flere fordeler. En vesentlig ulempe ved konvensjonelle in vivo-modeller er at dyret fysiologi skiller seg vesentlig fra human fysiologi. Toksiske bivirkninger av behandling av en human pasient kan derfor forbli uoppdaget. Dette brist kan overvinnes ved rekonstituering av 3D leveren modell med menneskeceller som nærmere reflektere biologi humann pasienter.

Den andre fordelen av leveren modellen er dens bidrag til dyrevelferd. Selv om dyre komponenter er nødvendig for oppløsning eksperimenter, fortsatt følger den tilnærmingen målene i 3R-prinsippet (erstatning, reduksjon, raffinement), som overskudd dyr kan brukes som ble ofret for andre dyreforsøk, det vil si, er ingen ekstra dyr nødvendig og tilnærming unngår fullstendig lider av dyr som ofte er forbundet med in vivo eksperimenter. Sfæroidene er et alternativt verktøy for å studere cellulære prosesser i et 3D-system. Imidlertid er sfæroider ikke vaskularisert slik at store biologiske stoffer og ikke trenge dypt inn i de indre delene av strukturen. Disse problemene har blitt overvunnet med vaskularisert 3D leveren modell.

I eksperimentene som beskrives her, ble AAV vektorer undersøkt, siden de er blant de mest lovende kandidater for genterapeutiskapplikasjoner. Som tallrike genet terapeutiske metoder tar sikte på å målrette leveren, for eksempel, for behandling av infeksjoner med hepatittvirus eller alfa-1-antitrypsin-mangel, kan det 3D leveren bli brukt i prosessen med disse AAV vektor utvikling. Det er selvsagt også egnet for studier av andre hepatotrope virale vektorer, f.eks, adenovirale vektorer. I tillegg kan den brukes til å studere smittsom hepatitt virus som hepatitt B- eller C-virus. Den kan for eksempel bli anvendt for å designe nye antivirale strategier. Videre 3D organ modeller representerer lovende verktøy for å utvikle nye cytostatisk terapi for å behandle kreft og å gjennomføre toksikologiske studier. På lang sikt kan kunstige lever brukes i regenerativ medisin som transplantasjoner. 3D leveren modellen Til sammen tilbyr et bredt spekter av applikasjoner i infeksjonsbiologi og andre felt av biomedisinsk forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator Fraunhofer /
Peristaltic Pump Fraunhofer /
Flange with groove Duran 2439454 modified by gaffer
O-Ring Transparent Duran 2922551
Quick Release Clamp Duran 2907151
Flat Flange Lid Duran 2429857 modified by gaffer
Screw thread Tube Duran 2483802 modified by gaffer
Screw thread Tube Duran 2483602 modified by gaffer
Silicone sealing Ring Duran 2862012
Screw Cap Duran 2924013
Screw Cap Duran 2924008
Screw Cap with aperture Duran 2922709
Screw Cap with aperture Duran 2922705
Filter Sarstedt 831,826,001
Silicone Tubing VWR 228-1500
Tube connector Ismatec ISM556A
Biocompatible Tubing Ismatec SC0736
T175 culture flasks Greiner bio-one 660 160
RPMI 1640 BioWest SAS (Th. Geyer) L0501-500
glutamine BioWest SAS (Th. Geyer) X0551-100
Trypsin BioWest SAS (Th. Geyer) L0940-100
penicillin/streptomycin BioWest SAS (Th. Geyer) L0022-100
fetal calf serum cc pro S-10-M
Tissue-Tek O.C.T. Weckert-Labortechnik 600001
HepG2 DSMZ ACC 180
Cryomold 15 x 15 x 5 mm Sakura 4566
Biopsy punch 4 mm pfm medical 48401
Nucleospin miRNA Macherey & Nagel 740971.10
Nucleospin RNA/DNA Buffer Set Macherey & Nagel 740944

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes. Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).
  2. Butler, D., Callaway, E. Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal. Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).
  3. Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).
  4. Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
  5. Hillebrandt, K., et al. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029 (2015).
  6. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  7. Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).
  8. Wagner, A., et al. Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors. J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).
  9. Kay, M. A. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).
  10. Yla-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).
  11. Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard. Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).
  12. Takagi, H., et al. Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).

Tags

Cancer Research adeno-assosiert virus vektorer ekstracellulære matrise lever recellularization RNA interferens kort hårnål RNA bioteknologi
Studier av virale vektorer i et tredimensjonalt Liver Modell repopulated med Human leverkreft cellelinje HepG2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hiller, T., Röhrs, V., Dehne,More

Hiller, T., Röhrs, V., Dehne, E. M., Wagner, A., Fechner, H., Lauster, R., Kurreck, J. Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2. J. Vis. Exp. (116), e54633, doi:10.3791/54633 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter