Abstract
Este protocolo describe la generación de un tridimensional (3D) ex vivo modelo de hígado y su aplicación al estudio y desarrollo de sistemas de vectores virales. El modelo se obtiene mediante la repoblación de la matriz extracelular de un hígado de rata descelularizado con una línea celular de hepatocitos humanos. El modelo permite estudios en un sistema de células 3D vascularizado, en sustitución de los experimentos potencialmente dañinos con animales vivos. Otra de las ventajas es la naturaleza humanizada del modelo, que está más cerca de la fisiología humana que los modelos animales.
En este estudio, hemos demostrado la transducción de este modelo de hígado con un vector viral derivado de virus adeno-asociados (AAV vector). El circuito de perfusión que suministra el modelo 3D del hígado con los medios de comunicación es un medio sencillo de aplicar el vector. El sistema permite la supervisión de los principales parámetros metabólicos del hígado. Para el análisis final, las muestras de tejido se pueden tomar para determinar la extensión de recellularización por técnicas histológicas. Distribución del vector de virus y la expresión del transgén entregado puede analizarse por PCR cuantitativa (qPCR), inmunotransferencia de tipo Western e inmunohistoquímica. Numerosas aplicaciones del modelo del vector en la investigación básica y en el desarrollo de aplicaciones terapéuticas de genes se pueden prever, incluyendo el desarrollo de nuevas terapias antivirales, la investigación del cáncer, y el estudio de los vectores virales y sus efectos secundarios potenciales.
Protocol
NOTA: RL obtuvo la aprobación ética para el explante de órganos de la Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Los hígados fueron explantadas de ratas Wistar. La vena cava inferior y la vena portal del hígado fueron canuladas con una cánula 22 G. Los métodos para la descelularización de hígados explantados se han descrito anteriormente. 4,5 Las matrices extracelulares utilizados aquí se obtuvieron mediante perfusión excesiva de un hígado de rata con desoxicolato de sodio al 1%.
1. recelularización de la matriz extracelular (ECM) de un hígado de rata
- Expansión de la línea celular HepG2 hepática
- Cultura la línea celular de carcinoma hepatocelular HepG2 en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% de suero de ternero fetal, glutamina 2 mM, y 2 mM de penicilina y estreptomicina, cada uno.
- Sembrar 1,5 x 10 7 células en frascos T175 y hacer crecer las células a 37 ° C y 5% de CO2 2.
- Centrifugar las células a 300 xg y volver a suspender en 4 ml de PBS y contar las células con una cámara de Neubauer bajo un microscopio. Una botella T175 producirá aproximadamente 4,5 x 10 7 células.
NOTA: Asegúrese de que el cultivo contiene el número de células suficientes para recelularización de la ECM de hígado de rata con 6 x 10 8 células HepG2 por ECM (10 x 175 cm 2 frascos de cultivo con 4-5 x 10 8 células de cada uno).
Figura 1. El sistema de biorreactor. A) Este sistema de biorreactor fue medida. Mantiene los modelos de órganos a 37 ° C y 5% de CO2. Los caudales de las bombas peristálticas pueden ser reguladas individualmente. B) El hígado se coloca en una cámara de crecimiento y se conectaned al circuito de perfusión, que consiste en una bomba peristáltica, un contenedor de medios, una trampa de burbujas y un sensor de presión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Recelularización de la MEC
- Establecer el sistema de biorreactor, que contiene una cámara de perfusión hepática, un sistema de perfusión, un depósito de medio y una trampa de burbujas. Esterilizar el sistema de biorreactor (121 ° C, 15 min).
- Conectar el sistema de biorreactor con una bomba peristáltica y colocarlo en una incubadora proporcionando las condiciones adecuadas (37 ° C, 5% de CO 2). Coloque los andamios de hígado de rata descelularizado 8 en la cámara de perfusión del hígado del sistema de biorreactor (Figura 1).
- Conectar la vena porta y la vena cava canulado con clips de tubo para el sistema de perfusión. Equilibrar andamio con 150 ml de medio RPMI (como se describe en 1.1)durante 5 d con una velocidad de flujo de 1,25 ml / min.
- Desconectar el andamio hígado desde el circuito de los medios de comunicación e inocular el andamio con 3 x 10 8 células HepG2 (en 5 ml) a través de la vena portal utilizando una jeringa de 5 ml, evitar la formación de burbujas de aire y permitir que las células para repoblar la ECM por incubación de las mismas para 1 h en el andamio con la bomba desconectada.
- Aumentar gradualmente la velocidad de flujo mediante el ajuste de la bomba, a partir de 1,25 ml / min durante 10 min; 2,5 ml / min durante 20 min y, finalmente, 3,75 ml / min durante 30 min.
- Repita los pasos 1.2.4-1.2.5 para llegar a un número total de células de 6 x 10 8.
- Ejecutar el sistema de biorreactor con un caudal de 3,75 ml / min. Cultura del hígado de la rata recelularizado durante 2 semanas.
Nota: reemplazar un tercio del medio con medio fresco (50 ml) cada dos días. Muestra el medio de cultivo para medir parámetros fisiológicos, como la actividad de lactato deshidrogenasa, el pH de muestras de medio y la concentración de glucosa y lactato.
2. La transducción de la rata de hígado recelularizado
- La producción a gran escala de vectores AAV
- Producir, purificar y cuantificar vectores AAV como se ha descrito anteriormente: 11
- En pocas palabras, producir vectores AAV en botellas de rotación y purificarlos por centrifugación en gradiente de iodixanol. Eliminar iodixanol residual por filtración sobre PD10 columnas de filtración en gel. Determinar la concentración de vector de AAV por qPCR utilizando ADN genómico de AAV como un estándar.
NOTA: La auto-complementaria, pseudotyped AAV2 / 6 vector utilizado en el presente estudio codificado EmGFP como reportero para demostrar la eficacia de transducción y un casete de expresión shRNA por la caída de un gen expresado de forma endógena (ciclofilina B humana (hCycB), la Figura 2) . Asegurar una cantidad suficiente de vectores pseudotyped VAAac de serotipo 6 (2,7 x 10 13 vectores AAV por modelo hígado).
- En pocas palabras, producir vectores AAV en botellas de rotación y purificarlos por centrifugación en gradiente de iodixanol. Eliminar iodixanol residual por filtración sobre PD10 columnas de filtración en gel. Determinar la concentración de vector de AAV por qPCR utilizando ADN genómico de AAV como un estándar.
- Producir, purificar y cuantificar vectores AAV como se ha descrito anteriormente: 11
Figura 2. Mapa de la auto-complementaria, pseudotyped AAV2 / 6 vector utilizado en el presente estudio. El genoma consiste en las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2 y codifica EmGFP bajo el control del promotor de CMV, así como un shRNA bajo control de un promotor U6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- La transducción de hígado Modelo
- Ajustar la solución del vector AAV a una concentración final de 2,7 x 10 13 genomas de vector en 5 ml añadiendo el volumen respectivo de PBS.
- Desconectar el hígado desde el circuito de los medios de comunicación mediante la eliminación del tubo de la cánula. Conectar una jeringa de 5 ml a la cánula de la vena portal e inyectar la solución del vector AAV completa (5 ml).
NOTA: Optionally, poner rojo fenol (5 g / ml) para seguir la distribución de la solución del vector AAV por todo el hígado. - Incubar durante 1 hora sin bombear. Gradualmente aumentar la velocidad de flujo, a partir de 1,25 ml / min durante 10 min; 2,5 ml / min durante 20 min y 3,75 ml / min durante 30 min. Cultura del hígado de la rata recelularizado más de 6 días.
NOTA: Reemplazar un tercio del medio como se indica en la nota bajo 1.2.7
3. Evaluación del hígado de la rata transducidas recelularizado
- Hematoxilina y eosina (HE) tinción inmunohistoquímica y análisis
- Tomar muestras (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) de cada lóbulo del hígado utilizando un bisturí.
- Incubar las muestras (de 3.1.1) en 4% de paraformaldehído (PFA) + solución de sacarosa al 4% durante 1,5 horas a 4 ° C. (Precaución: PFA es tóxico y cancerígeno Siempre tenga PFA dentro de una campana de extracción y uso de ropa protectora adecuada..) Lavar tres veces con PBS (1 min por paso de lavado) y se incuba en un 8%sacarosa durante la noche a 4 ° C.
- Verter la fijación en medio criomoldes de plástico, colocar las muestras en la fijación de un medio libre de burbujas de aire. Se añade medio de fijación hasta que la muestra está bien cubierta. Tienda incrustado muestras a -80 ° C hasta su uso posterior.
- Preparar crio-secciones (10 micras) con un 12 cryotome. Evaluar recelularización por hematoxilina eosina + 8. Evaluar la eficacia de transducción por tinción inmunohistoquímica para el gen de interés-de-(aquí: EmGFP).
- muestreo biológico molecular
- Muestra cada lóbulo del hígado con un punzón de biopsia (4 mm de diámetro). Aislar el ARN total, ADN y proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la evaluación de la expresión transgénica de EmGFP, y hCycB tumbar 8.
Representative Results
Para la evaluación de la extensión de la recelularización, crio-secciones se preparan a partir de cada lóbulo de cada modelo de hígado recelularizado. Las secciones fueron analizadas por tinción de hematoxilina y eosina. Como puede verse en la Figura 3, cada lóbulo de los tres modelos de hígado, denotado como SLT1, TLM2 (transducidas modelos de hígado 1 2) y Ctrl (modelo de hígado de control que se recelularizado, pero no transducidas), se repoblada con células HepG2. Esta línea celular de carcinoma hepatocelular se estableció a partir del tejido tumoral de un niño argentino de 15 años de edad. Algunas áreas de los modelos de hígado fueron más intensamente recelularizado que otros. Las razones de estas variaciones no se habían determinado.
Figura 3. Hematoxilina y eosina de cada lóbulo de los tres modelos analizados hígado SLT1 + 2:. Transducidas hígadomodelos 1 y 2; Ctrl .: modelo de hígado de control que fue recelularizado pero no transducidas. Barra de escala: 200 micras. (Re-impreso con el permiso de la Ref. 8.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En el siguiente paso, se evaluó la transducción de los modelos de hígado. Con este fin, el ADN se preparó a partir de 28 biopsias de perforación de cada uno de los modelos del hígado y el título de vector se cuantificó por qPCR. En promedio, se midieron 55 y 90 genomas de vector internalizadas por célula (VG / célula) para los dos modelos de hígado transducidas. Los experimentos en cultivos celulares han demostrado 2D 30 VG / célula son suficientes para una fuerte expresión del transgen y el silenciamiento mediado por RNAi. Producción de EmGFP se analizó por RT-PCR y Western Blot. De hecho, no se detectó expresión del reportero en el 80-90% de las biopsias en los niveles de ARNm y de proteína, respectivamente.8 Para obtener una imagen completa de la eficacia de transducción, crio-secciones se analizaron inmunohistoquímicamente. Como puede verse en la Figura 4, las áreas del modelo de hígado que fueron recelularizado con éxito, como se visualiza mediante tinción con DAPI, también dieron señales fluorescentes fuertes en el análisis inmunohistoquímico de la expresión EmGFP. Como era de esperar, el modelo de hígado de control, no tratados con vectores AAV, no mostró ninguna expresión EmGFP.
Figura 4. El análisis inmunohistoquímico de la expresión EmGFP Las células que repoblaron los modelos de hígado se visualizaron por tinción con DAPI (azul).; expresión EmGFP se visualizó por tinción inmunoquímica (rojo). SLT1 + 2: Modelos de hígado transducidas 1 y 2; Ctrl .: modelo de hígado de control que fue recelularizado pero no transducidas. Barra de escala: 200 micras. (Re-impreso con el permisode Ref. 8.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En una prueba final, caída mediada por AAV de hCycB se analizó mediante qRT-PCR. La caída de hCycB se encontró que era entre 70 y 90%, como media de todos los lóbulos de los dos modelos de hígado transducidas (Figura 5).
Figura 5. RNAi mediada desmontables de hCycB en modelos 3D del hígado AAV transducidas. Silenciamiento de hCycB se determinó mediante qRT-PCR. Los valores medios y las desviaciones estándar (SD) se calcularon para todas las muestras de cada modelo 3D del hígado transducidas (SLT1 y 2, respectivamente) y se normalizaron al valor medio del control no transducidas (Ctrl.). (Re-impreso con el permiso de Ref. 8.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los hígados 3D reconstituidas descritas aquí proporcionan un modelo para estudiar los vectores virales en un sistema humanizado. Repoblación de la ECM de un hígado de rata con una línea celular de carcinoma hepatocelular humano genera un sistema vascularizado que permite el estudio de grandes biológicos. Estos resultados proporcionan una prueba de concepto de que el modelo de hígado reconstituida se puede transducir eficientemente con un vector viral.
Para los experimentos que se muestran aquí, todos y cada lóbulo del hígado fue transducida por el vector AAV. Sin embargo, en algunos experimentos preliminares, los lóbulos individuales fueron no repoblado con células. Por tanto, es importante evitar que los desechos celulares u otros componentes de la oclusión del sistema vascular. Para probar si todos los lóbulos pueden ser perfundidos, un colorante no tóxico, tal como rojo de fenol se puede lavar a través del modelo de hígado.
Otra cuestión fundamental es mantener el andamio hígado estéril. Mientras que el tratamiento con etanol o antibióticos es disadvantageous para el sistema vascular, la irradiación de la matriz extracelular con γ-radiación conserva los vasos y se esteriliza la muestra.
Además, el tamaño de los hígados explantados será diferente, de modo que el número de células utilizadas para el procedimiento de recelularización y el tiempo de repoblación puede tener que ser ajustada para obtener resultados reproducibles.
Los hígados de ratas utilizadas en el presente estudio son relativamente grandes y requieren grandes cantidades de células y reactivos de prueba (por ejemplo, vectores AAV). Además, el procedimiento de repoblación tomó más de dos semanas. Esto limita el número de réplicas que se pueden hacer con un esfuerzo razonable. Actualmente estamos estableciendo el modelo de hígados de los ratones, que son sólo aproximadamente una quinta parte del volumen de hígado de rata, lo que permite el uso de un menor número de células y menos reactivos de la prueba. Aunque proporcional a escala reducida del número de células parece razonable, las cantidades exactas deben ser determinados en Furtsus experimentos.
Otro defecto de la presente modelo es el uso de la línea celular HepG2 hepatocelular. Los experimentos están en curso para desarrollar el uso de hepatocitos diferenciados a partir de células madre pluripotentes inducidas, que proporcionarán un modelo fisiológicamente más relevante. Además, el hígado consiste en múltiples tipos de células, además de los hepatocitos, por ejemplo, células de Kupffer y sinosoids. Suponemos que los diferentes tipos de células se repoblar sus entornos naturales cuando un ECM se recelularizado con múltiples tipos de células.
El modelo 3D del hígado combina varias ventajas. Una desventaja importante de convencional en modelos in vivo es que la fisiología animal difiere sustancialmente de la fisiología humana. Los efectos secundarios tóxicos del tratamiento de un paciente humano, por lo tanto pueden no ser detectados. Esta deficiencia puede superarse mediante la reconstitución del modelo de hígado 3D con células humanas que reflejan más estrechamente la biología de hulos pacientes por el hombre.
La segunda ventaja del modelo de hígado es su contribución al bienestar de los animales. Aunque se requieren componentes de animales para los experimentos de reconstitución, el enfoque todavía sigue los objetivos de la principio 3R (sustitución, reducción, refinamiento), como animales excedentes se pueden utilizar que fueron sacrificados para otros experimentos con animales, es decir, no se necesitan animales adicionales y el enfoque evita por completo el sufrimiento de los animales que con frecuencia se asocian con experimentos in vivo. Los esferoides son una herramienta alternativa para estudiar procesos celulares en un sistema 3D. Sin embargo, esferoides no están vascularizados de modo que grandes sustancias y productos biológicos no penetran profundamente en las partes interiores de la estructura. Estos problemas han sido superados con el modelo 3D del hígado vascularizado.
En los experimentos descritos aquí, se investigaron los vectores de VAA, ya que se encuentran entre los candidatos más prometedores para terapia génicaaplicaciones. Como numerosos genes enfoques terapéuticos apuntan a la orientación del hígado, por ejemplo, para el tratamiento de infecciones con virus de la hepatitis o de la deficiencia de alfa-1-antitripsina, el hígado 3D se puede utilizar en el proceso de desarrollo estos AAV vector. Es, por supuesto, también es adecuado para el estudio de otros vectores virales hepatotropos, por ejemplo, vectores adenovirales. Además, puede ser usado para estudiar virus de la hepatitis infecciosas, como la hepatitis B o el virus C. Se puede, por ejemplo, ser empleado para el diseño de nuevas estrategias antivirales. Por otra parte, los modelos 3D de órganos representan herramientas prometedoras para el desarrollo de nuevas terapias para tratar el cáncer citostáticos y llevar a cabo estudios toxicológicos. En el largo plazo, hígados artificiales pueden ser utilizados en la medicina regenerativa como trasplantes. En su conjunto, el modelo 3D del hígado ofrece una amplia gama de aplicaciones en biología infección y otros campos de la investigación biomédica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4 mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
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