Abstract
Bu protokol, üç boyutlu (3D) üretilmesini eks vivo karaciğer modeli ve viral vektör sistemleri çalışma ve gelişime uygulamaları açıklanmıştır. Model, insan hepatosit hücre hattı ile hücresizleştirilmiş sıçan karaciğer dışı matris repopulating ile elde edilir. Model yaşayan hayvanların potansiyel olarak zararlı deneyler yerine, bir vaskülarize 3D hücre sistemi çalışmaları izin verir. Diğer bir avantajı hayvan modellerinde daha insan fizyolojisi yakın olan modelin, insanlaştınlmış doğasıdır.
Bu çalışmada, adeno-ilişkili virüs (AAV vektörü) elde edilen bir viral vektör ile karaciğer modelinin transdüksiyonunu göstermektedir. medya ile 3D karaciğer modeli malzemeleri perfüzyon devre vektör uygulamak için kolay bir yol sağlar. Sistem karaciğer başlıca metabolik parametrelerin izlenmesini sağlar. Nihai analiz için, doku örnekleri recellulariza kapsamını belirlemek için alınabilirhistolojik teknikler ile yon. teslim transgenin virüs vektörü ve ekspresyon dağılımı kantitatif PCR (qPCR), Western blot ve immünohistokimya ile analiz edilebilir. Temel araştırma ve gen terapötik uygulamalarının geliştirilmesi vektör modelinin çok sayıda uygulama yeni antiviral terapötik maddelerin geliştirilmesi, Cancer Research, ve viral vektörlerin çalışma ve potansiyel yan etkileri de dahil olmak üzere, tasavvur edilebilir.
Protocol
NOT: RL Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo) organlarının eksplantasyonu etik onay aldı. Karaciğerler Wister sıçanları eksplante edildi. inferior vena kava ve karaciğer portal ven 22 G kanül ile kanüle edildi. Çıkarılan karaciğerin Decellularization yöntemleri daha önce tarif edilmiştir.% 1 sodyum deoksikolat, bir sıçan karaciğer aşın perfüzyon ile elde edilmiştir Burada kullanılan 4,5 hücre dışı matrisler.
Bir Sıçan Karaciğer Ekstrasellüler Matriks (ECM) 1. Recellularization
- karaciğer hücre hattı HepG2 genişletilmesi
- Kültür Roswell Park Memorial Institute (RPMI),% 10 fetal dana serumu, 2 mM glutamin, penisilin ve streptomisin, 2 mM her biri ile takviye 1640 ortamında hepatoselüler karsinom hücre çizgisi HepG2.
- T175 şişelerde 1.5 x 10 7 hücre Tohum ve 37 ° C ve% 5 CO 2 hücreleri büyümek CO2.
- 300 xg'de hücreleri aşağı spin ve 4 ml PBS onları tekrar süspansiyon ve mikroskop altında Neubauer odasına sahip hücreleri saymak. Bir T175 şişesi yaklaşık 4,5 x 10 7 hücreleri verecektir.
NOT: kültür ECM başına 6 x 10 8 HepG2 hücrelerinde (4-5 x 10 8 hücre her 10 x 175 cm 2 kültür şişeleri) ile sıçan karaciğer ECM recellularization için yeterli hücre numaralarını içerir emin olun.
Şekil 1. Biyoreaktör sistemi. A) Bu biyoreaktör sistemi ısmarlama oldu. Bu, 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde organ modelleri tutar. Peristaltik pompaların debileri karaciğer büyüme odasına yerleştirilir) Oda. Ayrı ayrı düzenlenir ve bağlantı olabilirbir peristaltik pompa, orta rezervuar, bir kabarcık kapanı ve basınç sensörü oluşan perfüzyon devresine ed. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- ECM'nin Recellularization
- Bir karaciğer perfüzyon odasına, bir perfüzyon sistemi, orta bir rezervuar ve kabarcık tuzak içeren, biyoreaktör sistemi kurmak. biyoreaktör sistemi (121 ° C, 15 dakika) sterilize edin.
- Peristaltik bir pompa ile biyoreaktör sistemi bağlayın ve bir inkübatör uygun koşulları sağlayarak yerleştirin (37 ° C,% 5 CO 2). Biyoreaktör sistemi (Şekil 1) karaciğer perfüzyon odasında decellularized sıçan karaciğer inşaat iskelesi 8 yerleştirin.
- Perfüzyon sistemine tüp klipleri kullanılarak kanüle portal ven ve vena kava bağlayın. (1.1 'de tarif edildiği gibi) 150 ml RPMI ortamı ile iskele dengeye/ Dakika 1.25 ml bir akış oranı ile 5 gün boyunca.
- Ortam devresi karaciğer iskele çıkarın ve 5 ml'lik bir şırınga kullanılarak portal ven aracılığıyla (5 ml) 3 x 10 8 HepG2 hücreleri ile iskele inoküle, hava kabarcığı oluşumunu önlemek ve hücreler için inkübe edilerek ECM yeniden doldurmak için izin pompa ile iskele 1 saat kapalı.
- Yavaş yavaş 10 dakika boyunca 1.25 ml / dakika ile başlayarak, pompa ayarlanması sureti ile akış hızını artırır; 20 dakika boyunca 2.5 mL / dakika ve son olarak 3.75 ml / 30 dakika min.
- Yineleyin 6 x 10 8 toplam hücre sayısına ulaşmak için 1.2.4-1.2.5 adımları.
- / Dakika 3.75 ml bir akış hızında biyoreaktör sistemi çalıştırın. Kültür 2 hafta recellularized sıçan karaciğeri.
Not: taze ortam (50 mi) her gün ortam üçte birini değiştirin. Böyle laktat dehidrogenaz aktivitesi, orta örneklerin pH ve glukoz ve laktat konsantrasyonu gibi fizyolojik parametreleri ölçmek için kültür ortamı tadabilirsiniz.
Recellularized Sıçan Karaciğer 2. İletimi
- AAV vektörlerinin büyük ölçekli üretimi
- Daha önce tarif edildiği gibi, üretmek, saflaştırmak ve AAV vektörleri ölçmek: 11
- Kısaca, silindir şişelerde AAV vektörleri üretmek ve iyodiksanol dereceli santrifüj yoluyla onları arındırmak. PD10 jel filtrasyon sütunları üzerinde süzme ile artık iyodiksanol çıkarın. Standart olarak genomik AAV DNA kullanılarak qPCR AAV vektörü konsantrasyonunu belirlemek.
NOT: Bu çalışmada kullanılan kendi kendini tamamlayan, pseudotyped AAV2 / 6 vektör transdüksiyon verimliliği ve endojen olarak ifade edilen genin demonte bir ShRNA ifade kaseti (insan siklofilin B (hCycB), Şekil 2) göstermek için bir muhabir olarak EmGFP kodlanmış . Serotip 6 (karaciğer model başına 2.7 x 10 13 AAV vektörleri) pseudotyped scAAV vektörlerinin yeterli bir miktarını sağlamak.
- Kısaca, silindir şişelerde AAV vektörleri üretmek ve iyodiksanol dereceli santrifüj yoluyla onları arındırmak. PD10 jel filtrasyon sütunları üzerinde süzme ile artık iyodiksanol çıkarın. Standart olarak genomik AAV DNA kullanılarak qPCR AAV vektörü konsantrasyonunu belirlemek.
- Daha önce tarif edildiği gibi, üretmek, saflaştırmak ve AAV vektörleri ölçmek: 11
Bu çalışmada kullanılan kendi kendini tamamlayan, pseudotyped AAV2 / 6 vektör Şekil 2. ilk. Genom AAV2 ters çevrilmiş terminal tekrarları (ITR) oluşur ve kontrolü altında bir shRNA yanı sıra, CMV promoterinin kontrolü altında EmGFP kodlayan bir U6 organizatörü evi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Karaciğer Modelinin İletimi
- PBS, ilgili hacim ilave edilerek 5 ml 2.7 x 10 13 vektör genomlarının bir son konsantrasyon elde etmek için, AAV vektörü solüsyonunun ayarlayın.
- kanül hortumunu kaldırarak medya devre karaciğeri ayırın. portal ven kanül 5 ml'lik bir şırınga bağlayın ve tam AAV vektörü çözeltisi (5 mi) enjekte edilir.
NOT: OptionallY, karaciğer boyunca AAV vektörü solüsyonunun dağıtımı takip fenol kırmızısı (5 ug / ml) ekleyin. - Pompa açık olarak 1 saat süre ile inkübe edilir. Yavaş yavaş 10 dakika boyunca / 1.25 ml dk başlayarak akış hızını artırır; 2.5 ml / 20 dakika ve 30 dakika boyunca 3.75 ml / dakika min. Kültür 6 gün boyunca recellularized sıçan karaciğeri.
NOT: orta üçte birini yerine 1.2.7 altında NOT verilen
Recellularized kalıt aktarımlı Sıçan Karaciğer 3. Değerlendirme
- Hematoksilen ve eosin (HE) boyama ve immünohistokimyasal analizi
- Bir neşter kullanılarak her bir karaciğer lobunun örnekleri (0.5 x 0.5 x 1.5-2 cm) alın.
- % 4 paraformaldehit (PFA), 4 ° C de 1.5 saat +% 4 sakroz çözeltisi içinde (3.1.1 den) örnekler inkübe edin. (Dikkat:.. PFA daima davlumbaz içinde PFA tutmak ve uygun koruyucu elbise giyin toksik ve kanserojen) yıkayın PBS ile üç kez (yıkama adım başına 1 dk) ve% 8 inkübe4 ° C'de bir gece boyunca sakroz.
- Plastik cryomolds içine orta sabitleme dökün hava kabarcıkları orta serbest sabitleme içine örnekleri yer. Numune iyi kaplıdır kadar sabitleme orta ekleyin. Mağaza sonraki kullanıma kadar -80 ° C 'de numuneler gömülü.
- Bir kriyotom 12 cryo-bölümleri (10 mikron) hazırlayın. Hematoksilen + eosin boyaması 8 ile Recellularization değerlendirin. (: EmGFP burada) geninin-faiz için immünohistokimyasal boyama ile transdüksiyon etkinliğini değerlendirmek.
- Moleküler biyoloji örnekleme
- biyopsi yumruk (çapı 4 mm) her karaciğer lobu Örnek. EmGFP transgen ifadesinin değerlendirilmesi için, üreticinin talimatlarına uygun olarak, toplam RNA, DNA ve protein izole ve 8 yıkmak hCycB.
Representative Results
recellularization derecesinin değerlendirilmesi için, kriyo-bölümleri, her recellularized karaciğer modelinin her lobun hazırlandı. Kesitler daha sonra hematoksilin ve eozin boyama ile analiz edilmiştir. Şekil 3'te görülebileceği gibi, TLM1, TLM2 olarak belirtilen üç karaciğer modellerin her lob, (recellularized ama transduse değil kontrol karaciğer modeli) ve Ctrl (karaciğer modeller 1 +2 transduse) HepG2 hücreleri ile yeniden doldurulur edildi. Bu hepatosellüler karsinom hücre hattı 15 yaşındaki Arjantinli çocuk tümör dokusundan kurulmuştur. Karaciğer modellerinin bazı alanlarda daha yoğun diğerlerinden daha recellularized bulundu. Bu varyasyonların nedenleri belirlenmelidir.
Şekil 3. Hematoksilen ve her üç lob eozin boyama, karaciğer modellerini analiz TLM1 + 2. Transduse karaciğerModeller 1 ve 2; recellularized ancak kalıt değildi Ctrl .: kontrol karaciğer modeli. Ölçek çubuğu: 200 mikron. (Ref izni ile yeniden basılmış. 8.) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir sonraki adımda, karaciğer modelleri transdüksiyon değerlendirildi. Bu amaçla, DNA, karaciğer modellerinin her birinden 28 zımba biyopsilerinden elde edilmiştir vektör titre qPCR ile nicelendirildi. Ortalama olarak, hücre (VG / hücre) her 55 ile 90 içsel vektör genomlarının iki kalıt karaciğer model ölçüldü. 2B hücre kültüründe Deneyler 30 VG / hücre güçlü transgen ifade ve RNAi aracılı susturulması için yeterli olduğunu göstermiştir. EmGFP üretimi RT-PCR ve Batı lekeleme ile analiz edilmiştir. Aslında, raportör ekspresyonu sırasıyla mRNA ve protein düzeyleri üzerinde biyopsi% 80-90 saptandı.8 transdüksiyon verimliliği kapsamlı bir resmini elde etmek için, cryo-kesitler immunohistologically analiz edildi. Şekil 4'te görülebileceği gibi, DAPI lekelemesi ile göz önüne başarılı olarak, recellularized edildi karaciğer modeli alanları da EmGFP ekspresyonunun immünohistokimyasal analizi güçlü flüoresan sinyal verdi. Beklendiği gibi değil, AAV vektörleri ile muamele edilmiş kontrol karaciğer modeli, bir EmGFP ifade göstermemiştir.
EmGFP ifade Şekil 4. immünohistokimyasal analizi, karaciğer modelleri DAPI lekelemesi (mavi) ile görselleştirilmiştir yeniden doldurulur hücreler.; EmGFP sentezleme boyanma (kırmızı) ile görünür hale getirildi. TLM1 + 2: transduced karaciğer modelleri 1 ve 2; recellularized ancak kalıt değildi Ctrl .: kontrol karaciğer modeli. Ölçek çubuğu: 200 mikron. (Izni ile yeniden basılmışRef. 8.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Son bir testte, hCycB AAV aracılı demonte QRT-PCR ile analiz edilmiştir. HCycB demonte, 70 ve% 90 arasında bulunmuştur iki transduced karaciğer modellerinin tüm lobu (Şekil 5) üzerinden ortalama edildi.
HCycB Şekil AAV-transdüksiyonlu 3D karaciğer modellerinde hCycB 5. RNAi aracılı demonte. Susturma QRT-PCR ile tespit edilmiştir. Ortalama değerleri ve standart sapmalar (SD) transdüksiyona kontrol ortalama değeri ile (sırasıyla TLM1 ve 2), her bir transduse 3B karaciğer modeli tüm örnekler için hesaplanan, normalize edildi (CTRL).. (R izni ile yeniden basılmışef. 8.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Burada anlatılan yeniden 3D karaciğerleri insanlaştırılmış sistemde viral vektörlerin incelemek için bir model. Bir insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı ile, bir sıçan karaciğer ECM popülasyonu büyük biyolojik çalışmasına izin verir vaskülarize sistemi oluşturur. Bu sonuçlar, bir proof-of-concept sulandırılmış karaciğer modeli verimli bir viral vektör ile transduced olabilir sağlar.
Burada gösterilen deney için, karaciğer her lobun AAV vektör ile kalıt edildi. Bununla birlikte, bazı ön deneylerde tek loblar hücreleri ile yeniden doldurulur değildi. Vasküler sistem kapatılmasıy hücre artıkları ya da diğer bileşenleri bilmek önemlidir. Tüm lobu perfüze edilip edilemeyeceğini test etmek için, örneğin fenol kırmızısı gibi toksik olmayan boya karaciğer modeli ile temizlenebilir.
Bir başka önemli madde steril karaciğer iskele tutuyor. etanol ya da antibiyotikler ile tedavi disadv ikenantageous vasküler sistem için, γ-radyasyonla hücre dışı matrisin ışınlama damarları korunmuş ve örnek sterilize edilmiştir.
Recellularization prosedürü ve repopulation defa kullanılan hücre sayısı yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için ayarlanması gerekebilir, böylece Ayrıca, eksplante karaciğerler büyüklüğü, farklı olacaktır.
Bu çalışmada kullanılan fare karaciğerleri nispeten büyüktür ve hücre ve test reaktifleri (örneğin, AAV vektörleri) ihtiyaç duyar. Buna ek olarak, yeniden çoğalması prosedürü iki haftadan fazla sürmüştür. Bu makul bir çaba ile yapılabilir çoğaltır sayısını sınırlar. Şu anda daha az hücre ve daha az test reaktiflerinin kullanımına izin veren, sıçan karaciğerinden hacminin yalnızca yaklaşık beşte biri olan fare karaciğerleri, modelini kurmaktadır. Hücre sayısının oransal ölçek aşağı makul görünse de, kesin miktarlar furt tespit edilmesi gerekenOnun deneyleri.
Bu modelin bir diğer sakıncası hepatoselüler HepG2 hücre hattı kullanılmasıdır. Deneyler fizyolojik daha alakalı bir model sağlayacak uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt hepatositlerin kullanımını geliştirmek için çalışmalar devam etmektedir. Ayrıca, karaciğer hepatositleri, örneğin, Kupffer hücreleri ve sinosoids ek olarak birden çok hücre tipinde oluşur. Biz bir ECM birden fazla hücre tipleri ile recellularized zaman farklı hücre tipleri kendi doğal ortamları yeniden doldurmak olacağını varsayıyorum.
3D karaciğer modeli birçok avantajlarını birleştirir. In vivo modeller, geleneksel önemli bir dezavantajı, Bitki Fizyolojisi, insan fizyolojisinin esasen farklı olmasıdır. bir insan hastanın tedavisi için toksik yan etkileri, bu nedenle tespit edilmemiş kalabilir. Bu eksiklik daha yakından hu biyolojisini yansıtan insan hücreleri ile 3D karaciğer modeli sulandırılması ile aşılabiliradam hasta.
Karaciğer modelinin ikinci avantajı hayvan refahına katkısı olduğunu. Hayvan bileşenleri yeniden oluşturma deneyleri için gerekli olsa da fazlası hayvanlar, yani, herhangi bir ek hayvan gereklidir, diğer hayvan deneyleri için kurban edildi ve kullanılabilir olduğu, bu yaklaşım hala, 3R prensibi (değiştirme, redüksiyon, arıtma) amaçlarını aşağıdaki yaklaşımı tamamen sıkça in vivo deneyler ile ilişkili hayvanların acı önler. Sferoidler 3D sisteminde hücresel süreçleri incelemek için alternatif bir araçtır. Büyük maddeler ve biyolojik yapının iç bölüme derinlemesine nüfuz kalmaması Ancak, sferoidler vaskülarize değildir. Bu sorunlar vaskülarize 3D karaciğer modeli ile aşılmıştır.
bunlar, gen terapi uygulamaları için en ümit verici adaylar arasında, çünkü burada tarif edilen deneylerde, AAV vektörleri, araştırılmıştırUygulamalar. Gibi çok sayıda gen terapötik yaklaşımlar hepatit virüsü veya alfa-1 antitripsin eksikliği enfeksiyonlarının tedavisi için, örneğin, karaciğer hedefleme amaçlamaktadır, 3D karaciğer bu AAV vektörü geliştirme sürecinde kullanılabilir. Ayrıca, tabii ki, diğer hepatotropik viral vektörler, örneğin, adenoviral vektörlerin çalışma için uygundur. Buna ek olarak, hepatit B ya da C virüsü gibi bulaşıcı hepatit virüsleri incelemek için kullanılabilir. Örneğin, yeni bir antiviral stratejiler tasarlamak için de kullanılabilir. Ayrıca, 3D organı modelleri kanserini tedavi etmek ve toksikolojik çalışmaları yürütmek için yeni sitostatik ilaçlar geliştirebilmek için umut verici araçları temsil etmektedir. uzun vadede, yapay karaciğerler nakli gibi rejeneratif tıpta kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, 3D karaciğer modeli enfeksiyon biyoloji uygulamaları ve biyomedikal araştırmanın diğer alanlarda geniş bir yelpazede sunuyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4 mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
- Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes. Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).
- Butler, D., Callaway, E. Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal. Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).
- Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029 (2015).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).
- Wagner, A., et al. Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors. J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).
- Kay, M. A. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).
- Yla-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard. Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).
- Takagi, H., et al. Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).
