Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

فحص مضان القائم من الفوسفوليبيدية Scramblase آخر

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54635
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

Abstract

Scramblases نقل من الدهون الفوسفاتية عبر طبقة ثنائية الغشاء الاتجاهين بطريقة مستقلة اعبي التنس المحترفين. وscramblase الأولى أن يكون تحديد وكيميائيا التحقق وأوبسين، في صميم بروتيني من رودوبسين مبصرة. رودوبسين هو مستقبلات البروتين يقترن-G المحلية في قضيب مبصرة الأغشية القرص من شبكية العين حيث أنها مسؤولة عن إدراك الضوء. النشاط scramblase رودوبسين للا تعتمد على يجند لها 11- رابطة الدول المستقلة -retinal، أي أوبسين صميم بروتيني كما تنشط باعتباره scramblase. على الرغم من التأسيسية وينظم فوسفورية الهرولة تلعب دورا هاما في علم وظائف الأعضاء الخلية، تم التعرف على عدد قليل فقط scramblases فوسفورية حتى الآن إلى جانب أوبسين. نحن هنا وصف مقايسة على أساس مضان النشاط scramblase أوبسين ل. وأعيد أوبسين في الجسيمات الشحمية unilamellar كبيرة تتألف من فسفاتيديل، phosphatidylglycerol وكمية ضئيلة من الفلورسنت وصفت دبي الوطني PC (1-صalmitoyl-2- {6- [7-نيترو-2-1،3-benzoxadiazole-4-YL) الأمينية] hexanoyl} - SN -glycero-3-phosphocholine). يتم تحديد النشاط Scramblase من خلال قياس مدى جزيئات دبي الوطني-PC الموجود في النشرة الداخلية للحويصلة قادرة على الوصول إلى النشرة الخارجية حيث يتم التخلص مضان من كيميائيا من قبل وكيل الحد الذي لا يمكن عبور الغشاء. الطرق وصفنا لها تطبيق عموما، ويمكن استخدامها لتحديد وتوصيف الأنشطة scramblase للبروتينات غشاء الأخرى.

Introduction

رودوبسين مستقبلة للضوء، وهو نموذج أولي G البروتين يقترن مستقبلات (مراجعة على سبيل المثال، في اشارة 1)، هو أول scramblase فوسفورية الكشف عن هويته والتحقق منها كيميائيا 2،3. Scramblases هي النقل فوسفورية التي تزيد من بطء في جوهرها من transbilayer حركة فوسفورية على الناحية الفسيولوجية المستويات الملائمة في ثنائي الاتجاه، بطريقة ATP مستقلة 4-6. أمثلة من تصرفاتهم يمكن العثور عليها في الشبكة الإندوبلازمية وغشاء هيولي البكتيرية التي تحتاج إلى الهرولة التأسيسي للتوازن الغشاء والنمو، فضلا عن مجموعة متنوعة من مسارات بالغليكوزيل 5. فوسفورية ينظم الهرولة هناك حاجة لفضح فسفاتيديل (PS) على سطح الخلايا أفكارك حيث أنه بمثابة "أكل لي" -signal لالضامة 7 و يوفر سطح محفز التخثر على الصفائح الدموية تنشيط لتحفيز إنتاج بروتين عاملق اللازمة لتخثر الدم. في مبصرة الأغشية القرص، وقد اقترح النشاط الهرولة رودوبسين لمواجهة الخلل فوسفورية بين اثنين من منشورات غشاء من طبقة ثنائية التي يتم إنشاؤها من قبل لاعبي التنس المحترفين التي تعتمد، الدهن أحادي الاتجاه flippase ABCA4 4،8،9 10-12.

وعلى الرغم من أهمية الفسيولوجية للscramblases، وظلت هويتهم بعيد المنال حتى أفيد رودوبسين باعتباره scramblase في أقراص مستقبلة للضوء 2، تم تحديد أعضاء الأسرة البروتين TMEM16 كما كا 2+ scramblases معتمد على الحاجة للتعرض PS في غشاء البلازما (مراجعة في إشارة 13)، واقترح البروتين البكتيري FtsW باعتباره الدهن الثاني scramblase المطلوبة لتخليق ببتيدوغليكان 14. واستندت هذه الاكتشافات على إعادة تشكيل تنقية البروتينات في الجسيمات الشحمية ومظاهرة من النشاط scramblase في proteoliposomes الناتجة باستخدام describ منهجيةإد هنا. scramblases إمكانات أخرى 15-21 - البروتينات MurJ وAMJ المتورطين في التركيب الحيوي ببتيدوغليكان، WzxE والبروتينات ذات الصلة المتورطين في الهرولة السلائف-O مستضد، البروتين منتدى مادهيسي اللازمة لنقل من phosphatidylglycerol aminoacylated عبر غشاء هيولي البكتيرية، وأفراد الأسرة Xkr8 أنه قد أقترح لفضح PS على سطح الخلايا أفكارك - لا يزال يتعين اختبار كيميائيا. هذا يسلط الضوء على أهمية فحص قوية لتحديد وتوصيف النشاط scramblase.

هنا، نحن تصف إعادة تشكيل أوبسين النقي، وصميم بروتيني من رودوبسين مبصرة، إلى الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs)، وتحليل لاحقة من النشاط scramblase في proteoliposomes الناتجة باستخدام مقايسة على أساس مضان. وهناك العديد من البروتوكولات وصفها جيدا المتاحة في الأدب للتعبير مغاير وتنقية أوبسين، وبالتالي فإننا لن وصف في هذا البروتوكول. نستخدم البروتوكولات المذكورة في غورين وآخرون. (3) الذي ينتج العلم الموسومة، أوبسين بالحرارة بنحو 100 نانوغرام / ميكرولتر في 0.1٪ (ث / ت) dodecylmaltoside (DDM).

ويتحقق إعادة بواسطة علاج LUVs مع المنظفات كافية بحيث تنتفخ ولكن لا تذوب. في ظل هذه الظروف، وهو بروتين الغشاء - المتوفرة في شكل المذيلات البروتين المنظفات - والاندماج في الجسيمات الشحمية وتصبح أعاد في غشاء الحويصلية على إزالة المنظفات، مما أدى إلى proteoliposomes. لإعادة أوبسين (تم الحصول عليها من البروتين النقي في 0.1٪ (ث / ت) DDM)، يتم إعداد LUVs من خليط من POPC (1-بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine) وPOPG (1- بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3- [الفوسفات-rac- (1-الجلسرين)]) ومشبعة DDM قبل إضافة أوبسين وبنك دبي الوطني-PC. ثم تتم إزالة المنظفات عن طريق التعامل مع عينة مع الخرز البوليسترين.

معشوقة = "jove_content"> ويظهر المبدأ الأساس لفحص القائم على مضان في الشكل 1B. وأعيد LUVs بشكل متناظر مع كمية ضئيلة من بنك دبي الوطني-PC أو غيرها المسمى دبي الوطني، مراسل فوسفورية فلوري (الشكل 1A). على إضافة dithionite، يتم تخفيض على غشاء impermeant dianion، يتم تقديم جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الخارجية للLUVs غير الفلورسنت كما نيترو-مجموعة بنك دبي الوطني إلى الأمينية مجموعة غير الفلورسنت. كما لا الجزيئات دبي الوطني-PC ولا dithionite قادرة على اجتياز الغشاء على المدى الزمني للتجربة (<10 دقيقة)، وهذا يؤدي إلى تخفيض 50٪ من إشارة الفلورسنت. ومع ذلك، إذا تم إعادة تشكيل الجسيمات الشحمية مع scramblase، جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الداخلية يمكن أن يتبارى بسرعة إلى الخارج حيث تقوم بتقليل. وهذا يؤدي إلى فقدان تام للمضان في حالة مثالية (الشكل 1C).

وفاق / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. الشكل 1: تمثيل تخطيطي لفحص النشاط scramblase يستخدم فحص والمسمى دبي الوطني الفلورسنت مراسل الدهنية؛ ويرد دبي الوطني-PC (A). وأعيد الحويصلات unilamellar كبيرة مع كمية ضئيلة من بنك دبي الوطني-PC. إعادة تنتج الحويصلات متماثل، مع بنك دبي الوطني-PC موزعة بالتساوي في منشورات الخارجي والداخلي. Dithionite (S 2 O 4 2-) يقلل كيميائيا نيترو مجموعة بنك دبي الوطني إلى الأمينية مجموعة غير الفلورسنت. علاج الجسيمات الشحمية خالية من البروتين مع dithionite (ب، أعلى) يؤدي إلى تخفيض 50٪ من مضان فقط منذ جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الخارجي يتم تخفيض: تم شحن dithionite سلبا ولا يمكن عبور الغشاء لتتفاعل مع جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الداخلية. العلاج Dithionite من proteoliposomes التي تحتوي على أوبسين (B، أسفل)، أي proteoliposomes-scramblase نشط، والنتائج في فقدان 100٪ من وluorescence كما أوبسين يسهل حركة بنك دبي الوطني-PC بين الداخلية والنشرة الخارجية. (C) ويظهر آثار مضان المثالية الحصول على علاج الجسيمات الشحمية خالية من البروتين وproteoliposomes التي تحتوي على أوبسين مع dithionite. معدل فقدان مضان هو نفسه في الحالتين يشير إلى أن تخفيض الكيميائية دبي الوطني dithionite هو معدل الحد، والتي تسعى جاهدة يحدث بمعدل يساوي أو أكبر من معدل التفاعل الكيميائي. وتظهر آثار الحصول عليها من تجربة الفعلية في الشكل (3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الطرق وصفنا يمكن استخدامها لإعادة بناء ومقايسة تنقية البروتينات الأخرى، فضلا عن خليط من البروتينات الغشاء تم الحصول عليها، على سبيل المثال، عن طريق استخراج microsomes ل مع المنظفات 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الليبوزومات وProteoliposomes

  1. الحويصلية تشكيل
    1. باستخدام حقنة زجاجية، إضافة 1،435 ميكرولتر POPC (25 ملغ / مل، في الكلوروفورم) و 160 POPG ميكرولتر (25 ملغ / مل، في الكلوروفورم) إلى قارورة أسفل جولة للحصول على 52.5 مكرومول الدهون في نسبة المولي من POPC: POPG = 9: 1.
    2. تجفيف الدهون لمدة 30 دقيقة باستخدام المبخر الدوار في سرعة دوران 145 دورة في الدقيقة (لا حاجة لحمام الماء لهذا الحجم من المذيبات)، ثم نقل القارورة إلى مجفف فراغ لا يقل عن 3 ساعة، أو بين عشية وضحاها، في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. هيدرات الفيلم الدهون المجففة مع 10 مل من 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4، 100 مم كلوريد الصوديوم (المشار إليه فيما عازلة أ) من قبل يحوم بلطف القارورة حتى متجانسة، والنتائج تعليق العكرة.
      ملاحظة: تركيز الدهون في هذه المرحلة ومن المتوقع أن يكون 5.25 ملي كما لا خسائر ينبغي أن يكون حدث حتى الآن.
    4. يصوتن تعليق في حمام مائي لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تردد سو 40 كيلو هرتز. فإن الحل يبدو أكثر وضوحا إلى حد ما.
    5. باستخدام الطارد، تمرير تعليق 10 مرات من خلال الغشاء مع حجم المسام 400 نانومتر، تليها المرحلة الثانية من قذف مع 4 تمريرات من خلال الغشاء مع حجم المسام 200 نانومتر.
      ملاحظة: متوسط ​​قطر LUVs الناتج هو ~ 175 نانومتر. إذا لزم الأمر، وحجم وتجانس LUVs يمكن فحصها من قبل الحيوي تشتت الضوء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    6. قياس تركيز فوسفورية من تعليق LUV كما هو موضح في القسم 1.2).
      ملاحظة: نظرا للخسائر خلال البثق، وتركز عادة حوالي 3.6 ملي.
    7. تخزين LUVs في 4 درجة مئوية لمدة حوالي 2 أسابيع إن لم يكن استخدامها على الفور.
  2. الكمي فوسفورية
    ملاحظة: لتحديد تركيز فوسفورية من تعليق LUV المستخدمة لإعادة تشكيل، وكذلك من proteoliposomes التي يتم إنشاؤها في نهاية المطاف، قسامة من العينة subjeالإدارة التنفيذية للأكسدة حمض البيركلوريك. هذا الإجراء ينهار الدهون الفوسفاتية للافراج عن الفوسفات غير العضوية التي يتم بعد ذلك كميا عن طريق فحص اللونية في المقارنة مع المعايير 23.
    1. يعد حل 40 ملي الأسهم من فوسفات الصوديوم (نا 2 هبو 4) في الماء المقطر منزوع الأيونات.
    2. تمييع الحل الأسهم مع الماء المقطر منزوع الأيونات للحصول على 4 ملم و 0.4 ملم الحلول التي ستكون بمثابة معايير المعايرة العمل.
    3. باستخدام حلول العمل، وإعداد المعايير في 13 أنابيب × 100 مم 2 كوب تتراوح 0-80 نانومول فوسفات الصوديوم في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
    4. يستغرق 10 ميكرولتر كل من العينات LUV وproteoliposome أن يكون كميا وتمييع مع 40 ميكرولتر من ده 2 O في 13 أنابيب × 100 مم 2 الزجاج.
      ملاحظة: كما في تركيز الدهون من LUVs وproteoliposomes هو في حدود 2.5-5 ميكرومتر، 10 ميكرولتر من العينة يجب أن يحتوي على 25-50 نانومول الدهون الفوسفور.
    5. إضافة حمض 300 ميكرولتر البيركلوريك إلى كل من المعايير والعينات والحرارة لمدة 1 ساعة على 145 درجة مئوية في كتلة التدفئة. وضع الرخام على الأنابيب لمنع التبخر.
    6. السماح للأنابيب بارد لدرجة حرارة الغرفة وإضافة 1 مل من ده 2 O.
    7. إضافة 400 ميكرولتر من كل الطازجة 12 غ / كربونات الأمونيوم L و 50 جرام / لتر أسكوربات الصوديوم ودوامة لخلط.
    8. الحرارة لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية مع الرخام على أعلى الأنابيب. إزالة الأنابيب من كتلة التدفئة والسماح لهم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
    9. قياس الامتصاصية من العينات ضد فارغة (عينة القياسية التي تحتوي على 0 نانومول فوسفات الصوديوم) مع مطياف عند طول موجي 797 نانومتر.
    10. تحديد محتوى الفوسفات من عينات ضد منحنى المعايرة القياسية.
  3. إعادة تشكيل أوبسين
    ملاحظة: من الضروري تحديد شروط تورم المثلى لإعادة وهذه تعتمد على طبيعة المنظفات، وكذلككما تكوين الدهون وتركيز LUVs. كما LUVs تغيير خصائص تشتت الضوء على تورم عملية يمكن رصدها من خلال قياس الامتصاصية (الشكل 2) على النحو الذي استعرضه ريغو وليفي 24 و Geertsma وآخرون. 25.
    1. ماصة 800 ميكرولتر من LUVs (من القسم 1.1؛ والانتعاش الدهون بعد قذف هو 70٪، وتركيز المتوقع من LUVs 3.6 ملي فوسفورية) في أنبوب microfuge 2 مل.
    2. إضافة 5.3 ميكرولتر من العازلة وو 34.7 ميكرولتر من 10٪ (ث / ت) DDM حل في المخزن A.
    3. احتضان لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة مع نهاية الإفراط في نهاية الاختلاط.
    4. وفي الوقت نفسه إعداد الخرز البوليسترين:
      1. استخدام 400 ملغ من الخرز لكل عينة ووزن لهم في كوب زجاجي.
      2. غسلها مرتين مع الميثانول، ثلاث مرات بالماء ومرة ​​واحدة مع العازلة A. للحصول على كل استعمال خطوة الغسيل 5 مل من السائل ويحرك ببطء لمدة 10 دقيقة.
        ملاحظة: من المستحسن لإعداد البوليسترينحبات لعدة عينات في وقت واحد، على سبيل المثال، في وزن 6 غرام من الخرز ويغسل مع 75 مل من السائل. حبات الزائدة يمكن تخزينها في الثلاجة لعدة أيام.
    5. خلال 30 دقيقة الماضي من زعزعة الاستقرار حويصلة تجفيف فوسفورية المسمى بنك دبي الوطني في أنبوب المسمار سقف زجاجية ( "إعادة أنبوب زجاجي '): لكل عينة، 9.5 ميكرولتر من بنك دبي الوطني-PC (1 ملغ / مل في الكلوروفورم، مما أسفر عن 0.4 مول٪ من إجمالي الدهون الفوسفاتية) يتم تجفيفها تحت تيار من النيتروجين في أنبوب زجاجي وحلت في وقت لاحق في 45 ميكرولتر من 0.1٪ (ث / ت) DDM في المخزن A.
    6. بعد 3 ساعات من زعزعة الاستقرار الحويصلة تضاف فوسفورية المنحل-دبي الوطني المسمى، البروتين DDM-بالفاعلات وعازلة بحيث الحجم النهائي من 1 مل يحتوي على 0.36٪ (ث / ت)، أي 7 ملم، DDM.
      1. وهكذا، لتوليد الجسيمات الشحمية خالية من البروتين (المستخدمة كعينة مراقبة) إضافة 45 ميكرولتر من بنك دبي الوطني-PC (المنحلة في 0.1٪ DDM)، 60 ميكرولتر من 0.1٪ DDM و 55 ميكرولتر من العازلة A؛ لproteoliposomes إضافة للامتحانسبيل، 40 ميكرولتر من البروتين (من محلول المخزون نموذجي من ~ 110 نانوغرام / ميكرولتر) في 0.1٪ DDM، 45 ميكرولتر من بنك دبي الوطني-PC (حل في 0.1٪ DDM)، و 20 ميكرولتر من 0.1٪ DDM و 55 ميكرولتر من العازلة لل .
        ملاحظة: ترتيب بالإضافة يجب على النحو المبين.
    7. خلط العينة لانهاء ساعة إضافية خلال نهاية في درجة حرارة الغرفة.
    8. إضافة 80 ملغ من الخرز البوليسترين المعدة واحتضان العينة مع نهاية الإفراط في نهاية خلط لمدة 1 ساعة على RT.
    9. التالي إضافة 160 ملغ إضافي من الخرز البوليسترين واحتضان مع نهاية الإفراط في نهاية خلط ل2 ساعة إضافية في RT.
    10. نقل العينة (ترك الخرز البوليسترين قضى خلف) إلى أنبوب زجاجي المسمار الحد الأقصى تحتوي على 160 ملغ من الخرز البوليسترين الطازجة وتخلط بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: أسهل طريقة لنقل العينة وتجنب امتصاص الخرز هو استخدام ماصة باستير أن يتم الضغط على الجزء السفلي من أنبوب زجاجي مع ضغط إيجابي يذكر. مرة واحدة غيض من ماصة هو راسخ فيالجزء السفلي من الأنبوب، ثم عينة يمكن سحب بسهولة دون تدخل من الخرز.
    11. في صباح اليوم التالي، ونقل العينة إلى أنبوب microfuge دون تحمل اكثر من الخرز ومكان على الجليد تمهيدا لفحص النشاط scramblase.

2. Scramblase آخر الفحص

ملاحظة: كثافة مضان من الجسيمات الشحمية أو proteoliposomes المخفف مع العازلة ويتم رصد مرور الوقت على إضافة dithionite في مطياف مضان. للحصول على كثافة بدءا مستقرة، يتم تسجيل مضان لا يقل عن 50 ثانية (أو حتى يتم التوصل إلى إشارة مستقرة) قبل أن يضيف dithionite على عينة أثار باستمرار ومن ثم يتم متابعتهم لمدة لا يقل عن 500 ثانية بعد إضافة dithionite.

  1. إضافة 1950 ميكرولتر من العازلة ألف إلى كفيت بلاستيكية تحتوي على ميني ضجة بار.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من PROTEO استعداد (الجسيمات الشحمية)، والسماح للعينة يوازن في الطيف مضانمتر مع التحريك المستمر لعدة ثوان.
  3. وفي الوقت نفسه يعد حل من 1 M dithionite في 0.5 M غير مصقول تريس (على سبيل المثال، لعينتين تزن من 20 ملغ من dithionite في أنبوب microfuge وتذوب في 114 ميكرولتر الجليد الباردة 0.5 M تريس مباشرة قبل الاستخدام والحفاظ على الجليد لالمقبل عينة).
    ملاحظة: يجب أن يكون مستعدا الحل dithionite الطازجة ولا ينبغي أن تستخدم أكثر من 20 دقيقة بعد الإعداد؛ إذا العديد من القياسات ليكون، aliquots من dithionite يمكن أن يكون وزنه في وقت مبكر وحل الحق قبل الاستخدام.
  4. بدء رصد مضان (الإثارة 470 نانومتر، وانبعاث 530 نانومتر، شق العرض 0.5 نانومتر).
  5. إضافة 40 ميكرولتر من الحل dithionite 1 م إلى كفيت 50 ثانية بعد بدء مضان تسجيل (استخدام الحاجز في غطاء غرفة كفيت إن أمكن) والاستمرار في تسجيل مضان ل400-600 ثانية أخرى.
  6. تحليل البيانات كما هو موضح في القسم 3.

3.تحليل البيانات

  1. حركية الجهاد
    1. تميز أثر مضان من كل عينة التي حصل عليها النشاط فحص scramblase من خلال تحديد مضان الأولي، F ط، قبل إضافة dithionite، ومضان نقطة النهاية، F، وصلت بعد> 400 ثانية. يتم تحديد F ط لكل عينة حيث بلغت قيمة متوسط ​​مضان لفترة 30 ثانية قبل إضافة dithionite.
    2. تحديد البيانات نقطة النهاية المقابلة لمدى انخفاض مضان، R = 100 • F / F ط. نحن نستخدم المصطلحات R L لالجسيمات الشحمية خالية من البروتين وR P لproteoliposomes التي تحتوي على أوبسين.
  2. تحديد الوزن الجزيئي للوظيفيا المعاد Scramblase
    1. تحويل البيانات للحد من مضان وفقا للمعادلة التالية:
      ص (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R ماكس - R L) (المعادلة 1)
      ملاحظة: أين R الحد الأقصى هو الحد الأقصى للتخفيض التي يتم الحصول عليها عند إعادة تشكيل ما يكفي من البروتين مثل هذا أن جميع الحويصلات في العينة تمتلك scramblase وظيفي واحد على الأقل، و p هو احتمال أن حويصلة خاصة في عينة تشكيلها هو 'scramblase نشط، أي أنها تمتلك scramblase وظيفي واحد على الأقل. قيمة R L هو عادة 45٪ 3 في حين R الحد الأقصى هو عادة 82.5٪ 3، بدلا من المتوقع 100٪ (يمكن تجريبيا لproteoliposomes أوبسين مع طاعون المجترات الصغيرة من> 1 ملغ / مليمول R ماكس). كما R ماكس <100٪ فمن المفترض أن شبه السكان من الحويصلات هو صهر لإعادة. لR الحد الأقصى = 82.5٪، ونسبة من الحويصلات التي لا يستطيع قبول البروتين هو 0.35.
    2. وصف العلاقة بين ص (≥1 scramblase) وطاعون المجترات الصغيرة (ملغ من البروتين / مليمول فوسفورية) من خلال إحصاءات بواسون على النحو التالي:
      ص (≥1 scramblase) = 1 - ه ملاحظة: أين م = عدد scramblases في الحويصلة وα = أحادية الأسي مناسبا ثابت في وحدات ملغ فوسفورية بروتين / ملمول.
    3. كما لا يسهم جزء من الحويصلات إلى الهرولة حتى في طاعون المجترات الصغيرة عالية (انظر المناقشة)، تعديل المعادلة إلى:
      ص (≥1 scramblase) = 1 - إكسب (-PPR * / α) (المعادلة 3)
      ملاحظة: أين طاعون المجترات الصغيرة * = طاعون المجترات الصغيرة / (1- و)، حيث f هو السكان الحرارية من الحويصلات، أو في هذه الحالة، طاعون المجترات الصغيرة * = طاعون المجترات الصغيرة / 0.65 (المعادلة 4).
      ملاحظة: يتم تحديد α ثابت مناسبا من المناسب على الرسم البياني للص (≥1 scramblase) مقابل طاعون المجترات الصغيرة * مع وظيفة أحادية الأسي. إذا أوبسين (الوزن الجزيئي 41.7 كيلو دالتون) reconstitutes وظيفيا إلى الحويصلات 175 نانومتر القطر (كل حويصلة ديها 280،000 الفوسفورية 26) كما مونومر، α = 0.187 ملغ مليمول -1. إذا dimerizes أوبسين قبل إعادة 3 لانتاج الحويصلات scramblase النشط، ثم α= 0.37 ملغ مليمول -1. إذا كانت طاعون المجترات الصغيرة بدلا من طاعون المجترات الصغيرة * لاستخدامها في التحليل، ثم القيم ألفا المقابلة ستكون 0.122 و 0.244 ملغ مليمول -1. تفترض هذه القيم المتوقعة للα أن جميع الجزيئات أوبسين هي المختصة وظيفيا. ولو جزء بسيط من جزيئات غير أكفاء لتغيير معالم الدهون، ثم القيم المناظرة من α سيكون أكبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وصفنا إعادة تشكيل أوبسين إلى LUVs لوصف النشاط scramblase وذلك باستخدام مقايسة على أساس مضان. نحن تحليل النتائج لوضع الحد الأدنى لمعدل فوسفورية بوساطة أوبسين الهرولة ولتحديد حالة بلازميدة قليلة القسيمات التي أوبسين reconstitutes وظيفيا إلى الحويصلات.

لتحديد شروط إعادة الأمثل، فإنه من الضروري تحديد تجريبيا كمية من المنظفات التي يجب أن تستخدم لتضخيم LUVs بحيث تكون تقبلا لإدخال البروتين. ويتضح مثل هذه التجربة في الشكل 2A. aliquots من POPC: يتم التعامل مع LUVs POPG مع كميات مختلفة من DDM لمدة 3 ساعة ويتم قياس الامتصاصية من العينة في 540 نانومتر، وهو مقياس لدرجة التعكر، وبالتالي من حجم الحويصلة. الكثافة البصرية تقاس في 540 نانومتر (OD 540) الرسم البياني يبين أن الحويصلات تنتفخ كما DDM concentrوزيادة أوجه 4-6 ملم، والوصول إلى نقطة التشبع في حوالي 7 مم قبل الشروع في إذابة (الموافق فقدان العكارة والتطوير التنظيمي 540 إشارة) كما يتم زيادة DDM أبعد من ذلك. يضاف دبي الوطني-PC بعد العلاج المنظفات والعينات يتم تحضين أبعد لمدة ساعة قبل أن يتم تعامل مع الخرز البوليسترين لإزالة المنظفات. يتم تحديد توزيع transbilayer بنك دبي الوطني-PC عن طريق قياس فقدان مضان بعد إضافة dithionite إلى الحويصلات (كما هو موضح أعلاه). وبالتالي، إدراج بنك دبي الوطني-PC في النشرة الخارجية الحويصلات في حالة عدم وجود المنظفات، وأشار الوصول التام لdithionite. لالحويصلات تعامل مع> 2 مم DDM، غير قادرة على توزيع بشكل متناظر في كل من منشورات بحيث بمجرد إزالة DDM 50٪ من بنك دبي الوطني-PC محمي من dithionite دبي الوطني-PC.

ويبين الشكل 2B تجربة-زعزعة الاستقرار إعادة مماثلة (إعادة رسم من المرجع 2 </ سوب>)، وهذه المرة تتبع إعادة تشكيل أوبسين. في هذه التجربة أنها يمكن أن نرى أن هناك حاجة 7 ملي DDM لإعادة أوبسين بحيث دبي الوطني-PC يصبح كميا (> 80٪) في متناول dithionite نتيجة بوساطة أوبسين الهرولة.

الشكل 2
الشكل 2: إعادة إعماره دبي الوطني-PC وأوبسين إلى الحويصلات زعزعة المنظفات (A) يتم التعامل مع أجزاء مأخوذة من الحويصلات مع مجموعة من تركيزات المنظفات (0-9 ملم) عن طريق خلط نهاية الإفراط في نهاية مدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة . في نهاية فترة الحضانة يتم قياس الامتصاصية من العينات في 540 نانومتر (خط أسود). ثم يضاف دبي الوطني-PC (المنحلة في 0.1٪ ث / ت DDM) وحضنت العينة ل1 ساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة قبل إزالة المنظفات عن طريق العلاج الخرز البوليسترين. ويتم تحليل الجسيمات الشحمية الناجم عن ذلك فلور فحص تخفيض escent (خط أحمر) لتحديد مدى تشكيلها دبي الوطني-PC متناظر. (ب) كما في (A)، ولكن في هذه التجربة الحويصلات تشكلت من الدهون الفوسفاتية البيض (بيضة PC / بيضة حمض الفسفاتيديك، 9: 1 مول / مول) وزعزعة استقرار مع DDM، وتمت إضافة أوبسين مع بنك دبي الوطني-PC، مما أدى إلى تخفيض مضان من حوالي 80٪ مرة واحدة وأعادت كفاءة البروتين وقادرة على تسهيل الهرولة بنك دبي الوطني-PC (معدلة من المرجع 2). على الرغم من أن دبي الوطني-PC أعيد بشكل متناظر في 2 مم DDM، وقد تم اختيار الظروف المثلى لإعادة تشكيل أوبسين حول ذروة OD 540 الامتصاصية، أي النقطة التي كانت حويصلات منتفخة للغاية بسبب المنظفات مقحم لكن لا بالفاعلات بعد (المشار إليها في سهم). لPOPC / POPG (9: 1 مول / مول) الحويصلات، تركيز DDM من 8 ملي وجدت لتكون الأمثل لكل من بنك دبي الوطني-PC وإعادة أوبسين./54635/54635fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مدى تخفيض مضان يزيد مع كمية من أوبسين تستخدم لإعادة. ويبين الشكل 3A آثار مضان الحصول على إضافة dithionite إلى دبي الوطني-PC-تحتوي على الجسيمات الشحمية خالية من البروتين (تتبع الأسود) وproteoliposomes تشكيلها مع أوبسين في بروتين مختلف لنسب فوسفورية (طاعون المجترات الصغيرة، في وحدات من البروتين ملغ لكل فوسفورية مليمول، آثار حمراء اللون)؛ تم تطبيع آثار بحيث أنهم جميعا لديهم نفس مضان الأولي (F ط) قيمة لتسهيل التصور. نوبات Monoexponential من آثار تشير ثوابت زمنية مماثلة جدا، تتراوح 20-25 ثانية؛ كما أن معدل الحد دبي الوطني-PC-بوساطة dithionite في الجسيمات الشحمية خالية من البروتين هو نفسه كما هو الحال في proteoliposomes، فمن الممكن فقط لوضع أقل تقدير على معدل بوساطة أوبسين الهرولة (انظر تكسر لمزيد من التفاصيل). ويبين الشكل 3B البيانات التي تم تحليلها تم الحصول عليها من المقايسات تخفيض مضان لانتاج قطع ص (≥1) scramblase (احتمال وجود حويصلة وجود scramblase واحد على الأقل) مقابل طاعون المجترات الصغيرة قياسها تجريبيا (المتعلقة طاعون المجترات الصغيرة * كما نوقش أعلاه). مقارنة بين صالح monoexponential من النتائج التجريبية في نوبات افتراضية الموافق أوبسين التي أعاد كما مونومر، ديمر أو tetramer تبين أن أوبسين reconstitutes وظيفيا باعتبارها ديمر.

الشكل (3)
الرقم 3: النشاط Scramblase من أوبسين (A) الإسفار آثار الموافق dithionite علاج الحويصلات تشكيلها مع بنك دبي الوطني-PC وأوبسين مبالغ تتراوح بين 0 حتي 4،95 ميكروغرام، التي أشار إليها إسفين. أقل مبلغ من أوبسين أعيد يتوافق مع طاعون المجترات الصغيرة من 0.21 ملغ / مليمول، وثاني أعلى مبلغ 0.43 ملغ / مليمول وأعلى مبلغ 1.3 ملغ / مليمول، أو 10 opsins في حويصلة في المتوسط. وأضاف Dithionite في الوقت المشار إليه (السهم) وتم رصد دبي الوطني مضان عن 400 ثانية أخرى. وكان الحد الأقصى للحد من مضان ينظر في هذه التجربة 85٪ في حين أن المتوسط ​​على مدى العديد من التجارب هو 82.5٪. (ب) اعتماد البروتين من الهرولة. وقد تم تحليل بيانات من تجارب مماثلة إلى لوحة وباستخدام إحصاءات بواسون لإنشاء رسم بياني لاحتمال وجود حويصلات scramblase واحد على الأقل (ع ≥1 scramblase) مقابل البروتين إلى نسبة فوسفورية (PPR) من الحويصلات (كان كميا البروتين مرحلة ما بعد تم تحديد إعادة بواسطة تحليل البقعة الغربية 3 و فوسفورية خلال قياس الفوسفات غير العضوية صدر عند التحلل الحمضي). ويمثل الخط الأحمر نوبة أحادية الأسي للبيانات. خطوط رمادية متقطع تمثل يناسب أحادية الأسي لإعادة تشكيل أوبسين إلى 170 نانومتر القطر الخامسesicles كما أحادية، dimers شكلت قبل أو tetramers شكلت مسبقا. كما يمثل محور س وطاعون المجترات الصغيرة قياسها تجريبيا (بدلا من طاعون المجترات الصغيرة * (انظر النص الرئيسي))، والثوابت تناسب تتوافق مع طاعون المجترات الصغيرة بدلا من طاعون المجترات الصغيرة * القيم، كما هو مبين في النص الرئيسي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فحص النشاط scramblase مكنتنا أصلا لتحديد ما أوبسين ديه فوسفورية النشاط scramblase 2. يسمح فحص لنا أيضا لوصف النشاط scramblase أوبسين عن طريق اختبار خصوصية (كنا مجموعة متنوعة من الدهون مراسل المسمى دبي الوطني مثل بنك دبي الوطني فسفاتيديل إيثانولامين، وصفت مع بنك دبي الوطني على سلسلة أسيل كما هو مبين لبنك دبي الوطني-PC في الشكل 1A، أو على headgroup، بنك دبي الوطني، سفينغوميالين أو NBD- فسفاتيديل 2)، وتأثير حويصلة تكوين الدهون (على سبيل المثال، والكولسترول في كميات مختلفة كأحد مكونات الحويصلة)، وعما إذا كانت الدول متعلق بتكوين مختلفة من أوبسين ورودوبسين كل نشاط المعرض scramblase. وكشفت هذه التحليلات أن النشاط scramblase رودوبسين هو سريع جدا (> 10،000 الفوسفورية لكل ثانية)، غير محددة لفوسفورية ومستقلة عن الدولة بتكوين رودوبسين أو ما إذا كان يحتوي حامل اللون في شبكية العين 2،3 أم لا. هنا،قدمنا ​​طريقة مفصلة لتوليد proteoliposomes تحتوي على أوبسين وأظهر كيف لفحص هذه الاستعدادات للنشاط scramblase فوسفورية.

هو الأمثل لبروتوكول إعادة وصفها لتكوين الدهون معين، وعلى إعادة إنشاء وأوبسين بعد تنقيته بواسطة اللوني تقارب باستخدام DDM كما المنظفات على الانحلال. تكوين الدهون وكذلك المنظفات يمكن ان تتغير وفقا لاحتياجات المجرب، على الرغم من أن الظروف إعادة مثالية للظروف المتغيرة يجب أن يتم تحديدها عن طريق إجراء "تورم-التجربة" هو موضح في الشكل (2). DDM هو تجريبيا مناسبة تماما للحفاظ على أوبسين في حالة مستقرة وفاعلة. ومع ذلك، المنظفات الأخرى مثل الأوكتيل-β-جلوكوسيدي، CHAPS أو تريتون X-100 يمكن استخدام البروتوكولات التالية مماثلة. تريتون X-100 هو المنظفات المستخدمة على نطاق واسع لإعادة تشكيل النقل كاسيت ملزمة ATP (النقل ABC) كما efficie لهاNCY في التوسط غشاء إعادة أعلى من المنظفات الأخرى، ويستغرق وقتا أقل لتتوازن مع الجسيمات الشحمية بريفورميد 24.

ومن الممكن تحديد حالة بلازميدة قليلة القسيمات من أوبسين تشكيلها وظيفيا إذا تم الحصول على مدى الحد من الفلورسنت لعينات تشكيلها مع كميات مختلفة من أوبسين، أي أكثر من مجموعة من البروتين لنسب فوسفورية (PPRs). من أجل القيام بذلك، PPR من الحويصلات تشكيلها يجب أن تقاس بوضوح عن الانتعاش من البروتين وفوسفورية قد تختلف. انتعاش فوسفورية يمكن تحديده من خلال الفحص الفوسفات هو موضح في القسم 1.2، في حين أن الانتعاش البروتين يمكن تقدير التحليل الكمي البقعة الغربية التي تستخدم في تنقية البروتينات المستخدمة في reconstitutions لتوليد منحنى المعايرة التي تسمح بالمقارنة مع استعادة عينات أعيد تشكيلها عبر مجموعة PPR اختبار (كما هو موضح بالتفصيل في إشارة 3).

هو مبني على فحص النشاط scramblase على افتراض أن dithionite لا تتغلغل في الحويصلات. هذه النقطة يمكن التحقق من محاصرة مراسل ذوبان المسمى دبي الوطني داخل الحويصلات وتحديد ما إذا كان يمكن تخفيض dithionite. لهذا الغرض، ويستخدم بنك دبي الوطني الجلوكوز (12.6 ميكرومتر وأضاف بعد زعزعة الاستقرار الحويصلة) بدلا من بنك دبي الوطني-PC. وحوصر هذا الجزيء للذوبان في الماء داخل proteoliposomes مرة واحدة مغلقة الحويصلات، وبالتالي يجب أن تكون محمية من dithionite. لجعل دبي الوطني الجلوكوز متاحة تماما للتخفيض، تريتون X-100 يمكن إضافة (1٪ ث / ت) والذي ينتج بعد ذلك في الحد من 100٪ 3،27.

يمكن وصفها في proteoliposomes للتحقق من أن إعادة تشكيل كل من الدهون والبروتين مراسل متماثل. ويتحقق السابق من خلال التجارب تبريد الارتطامية باستخدام أيونات يوديد بينما يستند الأخير على استراتيجية حماية البروتيني باستخدام AspN البروتيني الذيتخفيضات في موقع معين بالقرب من محطة سي من أوبسين 3.

الانتقال من مضان الأولي (F ط) المحددة في فحص النشاط scramblase إلى مضان نقطة النهاية (F) معقد، ولكن لأغراضنا أنه يمكن أن يقترب إلى حد معقول من وظيفة الاضمحلال الأسي واحدة. ثابت الزمنية المرتبطة اضمحلال الأسي (20 ثانية) هو تقريبا نفس لالجسيمات الشحمية نشط وفعال، proteoliposomes التي تحتوي على أوبسين مشيرا إلى أن الهرولة كما يحدث بسرعة، أو أسرع من المعدل الذي يتم تقليل fluorophore دبي الوطني dithionite. وبالتالي فحص النشاط scramblase لديه قرار الوقت الفقراء (محدودة dithionite الكيمياء الحد) التي تسمح حاليا فقط تصنيف المسوخ إلى نشطة، بطيئة جدا أو غير نشطة. يمكن أن ينظر إلى هذا التصنيف لscramblase التنظيم الكالسيوم TMEM16 27: في ارتفاع الكالسيوم 2+ المستويات، كشف تسوس مضان وقت ثابت مماثل لثار ينظر في الجسيمات الشحمية خالية من البروتين، مشيرا إلى أن معدل الحد خطوة هو الحد الكيميائية من بنك دبي الوطني fluorophore التي كتبها dithionite من الدهون الهرولة. على العكس من ذلك، في انخفاض مستويات الكالسيوم 2+ لم يتم التوصل إلى حالة مستقرة للحد من الفلورسنت بعد 900 ثانية، مما يجعل من الممكن التمييز بين عنصرين الحركية، واحد المخصصة للحد من dithionite من النشرة الخارجية وأبطأ واحد إلى التعرض بنك دبي الوطني-الدهون الداخلية-النشرة إلى الخارج.

التناقض بين توقع خسارة 100٪ من مضان على dithionite علاج الحويصلات أعدت مع ارتفاع طاعون المجترات الصغيرة (الشكل 1C) مقابل واقع التجربة حيث أنه من الصعب أن يتجاوز ~ تخفيض 85٪ (الشكل 3A) تشير إلى أن جزءا من الحويصلات هو صهر إلى إعادة. هذا جزء يمكن أن تتوافق مع حويصلات أن ختم في وقت مبكر أثناء إجراء إعادة كما كثف المنظفات إلى الخرز البوليسترين وهناكوبالتالي لم تعد قادرة على استقبال البروتين. لتحليل الموضحة في قسم 3، ونحن نفترض أن هذه الفئة من السكان الحرارية يتوافق مع جزء صغير و من مجموع الحويصلات. وإذا افترضنا أن نصف جزيئات دبي الوطني-PC (مجمع دبي الوطني-PC في النشرة الخارجي) في الحويصلات صهر يتوفر للdithionite الحد، ثم نقدر و = 2 • (1 - R ماكس / 100)، أو 0.35 عندما R الحد الأقصى = 82.5٪.

تركيب ص (≥1 scramblase) مقابل طاعون المجترات الصغيرة * البيانات مع المعادلة أحادية الأسي يوفر α المستمر لائقا، والتي كان من الممكن لتحديد ما إذا أوبسين reconstitutes وظيفيا كما مونومر أو ديمر، أو خليط من الدول بما في ذلك multimers العليا . تفسير هذه النتائج تصبح معقدة إذا كان جزء من جزيئات أوبسين لا يمكن أن تعمل في الهرولة. في حين أن هذا يعطى من غير المرجح الظروف التي يتم تنقيته أوبسين التي تضمن أن يحتفظ كل من البروتين G ل، ويمكن أيضا أن تفسر الأنشطة مستقبلات قيمة α المقابلة لإدراج الوظيفي للdimers باسم الإدراج الوظيفي للأحادية من إعداد أوبسين حيث نصف البروتينات غير نشطة كما scramblases. نقطة إضافية للنظر هو أن التحليل أن نقدم يفترض أن الحويصلات تستخدم لإعادة متجانسة في الحجم. في الواقع، والحويصلات لديها مجموعة من أقطار تتميز توزيع جاوس مع انحراف معياري المقابلة إلى ما يقرب من ثلث متوسط ​​قطر. لحسن الحظ، ونتائج تحليل ص (≥1 scramblase) مقابل طاعون المجترات الصغيرة * البيانات لا تتأثر كثيرا النظر في عدم التجانس الحويصلة وبالتالي فإن تحليل بسيط هو أن قدمنا ​​ما يكفي لوصف البيانات.

وجود قيود محتملة من الأساليب التي وصفنا هو أن الإجراء كثيفة العمل لا تسمح قياسات عالية الإنتاجية من عدد كبير جدا من العينات لالثانية أن عدم التجانس حويصلة قد تزعج قراءات. يمكن التغلب على المشكلة الأولى باستخدام تنسيق عيار مكروي لوحة للمقايسة scramblase. يمكن حل ثانيا في المستقبل من خلال فحوصات حويصلة واحدة باستخدام TIRF المجهري.

فحص dithionite لقياس النشاط scramblase يمكن اعتبار موثوقة جدا وقوية بمجرد وضع إجراءات زعزعة الاستقرار وإعادة. نهج بديل لقياس النقل عبر الغشاء من الدهون الفوسفاتية، الذي يسمح أيضا التحقق من النتائج التي تم الحصول عليها من فحص dithionite، عاد استخراج قصيرة السلسلة دبي الوطني-الدهون من النشرة الخارجية للالحويصلات الدهنية باستخدام البقري الخالي من حمض مصل الزلال 22. العودة استخراج فضلا عن فحص dithionite كما تم توظيف لتوصيف وتحديد flippases من ATPases P4 من نوع والنقل ABC 28-33.

كأدوات المعروضة هنا يمكن بسهولة أن تتكيف وفقا لاحالإقليم الشمالي يحتاج إلى إجراءات وصفها متعددة الاستعمالات، وسوف تساعد في تحديد وتوصيف scramblases فوسفورية في المستقبل. تعلم هوية العديد من هؤلاء، بما في ذلك من scramblase اللازمة للتوسع في الأغشية الاحيائية خلال نمو الخلايا هو من أهمية قصوى الفسيولوجية.

للحصول على معلومات إضافية وصفا مفصلا لتحليل البيانات، ويشار إلى القراء المنشورات السابقة من مختبرنا 2-4،27 فضلا عن غيرهم 22،25،28،30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 ml extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 ml Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
  2. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
  3. Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
  4. Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
  5. Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
  6. Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
  7. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
  8. Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
  9. Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
  10. Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
  11. Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
  12. Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
  13. Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
  14. Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
  15. Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
  16. Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
  17. Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
  18. Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
  19. Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
  20. Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
  21. Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
  22. Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
  23. Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
  24. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  25. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
  26. Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
  27. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
  28. Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
  29. Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
  30. Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
  31. Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
  32. Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
  33. Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 115، الكيمياء الحيوية، العدد، الخرز البوليسترين، والمنظفات، flippase، النوع من الاختزال، الجسيمات الشحمية، فوسفورية والإحصاءات بواسون، proteoliposomes، إعادة، رودوبسين، scramblase، بروتين الغشاء
فحص مضان القائم من الفوسفوليبيدية Scramblase آخر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ploier, B., Menon, A. K. A… More

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter