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Biochemistry

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

doi: 10.3791/54635 Published: September 20, 2016

Abstract

Scramblases는 양방향 ATP 독립적 인 방식으로 막 이중층에 걸쳐 인지질을 이동시키다. 첫 번째 scramblase 식별 및 생화학, 감광체 로돕신의 아포 단백질을 옵신했다 확인합니다. 로돕신은 빛의 인식을 담당하는 망막의로드 시각 디스크 막에 지역화 G 단백질 결합 수용체이다. 로돕신의 scramblase 활동이 리간드 11- 시스 레티 날, 즉에 의존하지 않는다는 아포 단백질의 옵신도 scramblase으로 활성화됩니다. 스크램블링 구조적 및 규제 인지질 세포 생리에있어 중요한 역할을하지만, 몇 인지질 scramblases 지금까지 옵신 또한 확인되었다. 여기에서 우리는 옵신의 scramblase 활동의 형광 기반의 분석을 설명합니다. 옵신은 포스파티딜콜린, 포스파티딜 형광 NBD 표지 PC (1-P의 추적 량으로 구성된 대규모 단일 층 리포좀에 재구성almitoyl -2- {6- [7- 니트로 2-1,3-benzoxadiazole -4- 일) - 아미노] - 헥사 노일} - SN -glycero -3- 포스 포 콜린). Scramblase 활성 소포의 내부 전단에 위치 NBD-PC 분자들이 형광 화학적 막을 교차 할 수있는 환원제에 의해 제거되어 외주 전단에 액세스 할 수있는 정도를 측정함으로써 결정된다. 우리는 설명 방법은 일반적인 적용을 다른 막 단백질의 scramblase 활동을 확인하고 특성화하기 위해 사용될 수있다.

Introduction

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감광체 로돕신 (문헌 1 예 검토)는 원형 G 단백질 - 결합 수용체가 발견되는 인지질 제 scramblase이고 생화학 2,3- 검증. Scramblases는 transbilayer 인지질 운동의 본질적으로 느린 속도를 증가 인지질 수송있는 양방향의 생리 학적으로 적절한 수준으로, ATP 독립적 인 방식 4-6. 그 동작의 예는 소포체와 항시 스크램블링은 물론 당화 경로 (5)의 다양한 멤브레인 항상성 및 성장에 필요한 박테리아 세포질 막에서 발견 될 수있다. 이 역할 여기서 규제 인지질 사멸 세포의 표면에 포스파티딜 세린 (PS)을 노출시키기 위해 필요한 스크램블링 식세포 7 - 신호 "나 먹을"단백질 인자의 생산을 촉진하는 활성화 된 혈소판에 응고 된 표면을 제공한다혈액 응고에 필요한 s의. 감광체 디스크 세포막, 로돕신의 스크램블링 활성을 ATP 의존적 단방향 지질에 의해 생성 된 이중층 두 막 전단지 간 인지질 불균형을 상쇄 제안 ABCA4 4,8,9 10-12 flippase되었다.

로돕신은 세포막에서의 PS 노출에 필요한 2+ 의존적 scramblases가 (기준 검토 (2), TMEM16 단백질 가족의 구성원이 CA로 확인되었다 광 수용체 디스크에 scramblase로보고 될 때까지 scramblases의 생리적 중요성에도 불구하고, 자신의 정체성이 애매 남아 13) 및 지질 II는 펩티도 글리 칸 합성 (14)에 필요한 scramblase으로 박테리아 단백질 FtsW 제안 하였다. 이 발견은 방법론 describ를 사용하여 결과 테오의 리포좀의 정제 된 단백질의 재구성 및 scramblase 활동의 데모를 기반으로 한여기 에드. 다른 잠재적 scramblases 15-21 - 펩티도 글리 생합성에 연루 MurJ와 AMJ 단백질, WzxE 및 관련 단백질이 O 항원 전구체를 스크램블링에 연루, MprF 단백질은 세균 세포질 막에 걸쳐 아미 노아 실화 포스파티딜를 이동시키다하는 데 필요한, 그리고 Xkr8 가족 구성원이 제안되었다 그 사멸 세포의 표면에 노출되도록 PS는 - 생화학 시험 될 남아있다. 이 식별 scramblase 활동을 특징 강력한 분석의 중요성을 강조한다.

여기서는 형광 계 분석을 이용하여 얻어진 테오에 큰 단일 층 소포 (LUVs)로 정제 옵신의 재구성, 감광체 로돕신의 아포 단백질, 및 scramblase 활동 이후의 분석을 설명한다. 이종 표현과 옵신 정화용 문학에서 사용할 수있는 몇 가지 잘 설명 프로토콜은 따라서 우리는하지 않습니다있다이 프로토콜에 대해 설명; 우리는 약 100 NG에 FLAG 태그가, 내열성 옵신 수득 고렌 외. (3)에 설명 된 프로토콜을 사용 / 0.1 %에 μL (w / v)의 dodecylmaltoside (DDM).

재구성은 팽창하지만, 용해되지 않도록 충분한 세제 LUVs 처리함으로써 달성된다. 이러한 조건 하에서, 막 단백질 - 단백질 세제 미셀의 형태로 공급이 - 리포좀에 통합되며 테오 결과 세제 분리 한 리포솜 멤브레인으로 재구성된다. (0.1 % (w / v)의 DDM으로 정제 된 단백질로서 수득) 옵신을 재구성하기 LUVs은 POPC (1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린) 및 POPG의 혼합물 (1- 제조 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- [포스 라 세미 (1 글리세롤)]) 및 옵신 및 NBD-PC를 첨가하기 전에 포화 DDM. 세제는 폴리스티렌 비드와 함께 샘플을 처리하여 제거한다.

아가씨 = "jove_content는"> 형광 계 분석의 기초가되는 원리는도 1b에 도시된다. LUVs 대칭 NBD-PC 또는 다른 NBD 형광 표지 된 인지질 기자 (도 1a)의 미량으로 재구성된다. 온산 추가에, NBD의 니트로 기와 같은 막 impermeant가 음이온은 LUVs의 외측 소엽에서 NBD-PC 분자 렌더링 비 형광 비 형광 아미노기로 환원된다. 도 NBD-PC 분자 나 온산 실험 (<10 분)의 시간 - 스케일 막을 통과 할 수있는 바와 같이, 이는 형광 신호의 50 % 감소를 초래한다. 리포좀은 scramblase로 재구성되는 경우, 내부 전단에 NBD-PC 분자들이 감소 외부로 신속 스크램블링 할 수있다. 이것은 이상적인 경우 (도 1C)에서 형광의 총 손실을 초래한다.

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. 그림 1 : scramblase 활동 분석의 도식 표현은 분석은 형광 NBD 표지 기자 지질을 사용; NBD-PC가 표시된다 (A). 대형 단일 층 소포는 NBD-PC의 미량으로 재구성된다. 재구성은 외부 및 내부 전단지에 균등하게 분산 NBD-PC와 함께, 대칭 소포를 생성합니다. 온산 (S 2 O 4 2-) 화학적으로 비 형광 아미노 그룹에 NBD의 니트로 그룹을 줄일 수 있습니다. 온산 (B, 위쪽) 무 단백질 리포좀의 치료는 감소 외측 전단만을 NBD-PC 분자 보낸 형광의 50 % 감소를 일으키는 : 디티 마이너스로 하전되고, NBD-PC 분자와 반응 할 수있는 멤브레인을 통과 할 수없는 내부 전단지입니다. 옵신 함유 테오 (B, 아래)의 온산 치료 즉, scramblase 활동 테오, F의 100 % 손실 결과같은 옵신 luorescence는 내부와 외부 사이에 전단 NBD-PC의 이동을 용이하게한다. (C)는 온산과 무 단백질 리포좀 옵신 - 함유 테오 처리하여 얻어진 형광 이상화 트레이스를 나타낸다. 형광 손실률은 온산 의해 NBD의 화학적 환원 스크램블링은 화학 반응의 속도 이상인 속도로 발생하고, 그 속도 - 제한임을 나타내는 두 경우 모두 동일하다. 실제 실험에서 얻은 흔적을 그림 3에 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

우리가 설명 된 방법은 다른 단백질 정제뿐만 아니라 세제 마이크로 솜 (22)을 추출하여, 예를 들어, 얻어진 막 단백질의 혼합물을 재구성하고 분석하는데 사용될 수있다.

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Protocol

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리포좀과 테오 1. 준비

  1. 리포좀 형성
    1. 유리 주사기를 사용하여, POPC 몰비 52.5 μmol 지질을 수득하는 둥근 바닥 플라스크에 (클로로포름, 25 ㎎ / ㎖) 160 μL의 POPG (클로로포름, 25 ㎎ / ㎖) 1435 μL의 POPC를 추가 POPG = 9 : 1.
    2. (물 욕 용제이 볼륨이 필요 없음) 145 rpm의 회전 속도로 회전 증발기를 사용하여 30 분 동안 지질을 건조한 후, 실온에서 밤새 적어도 3 시간 또는 위해 진공 데시 케이 터로 플라스크를 전송할 (RT).
    3. 의 50 mM HEPES pH 7.4의 100 mM의 NaCl을 10 mL의 건조 된 지질 막을 수화 부드럽게 균질 현탁액 혼탁 결과까지 플라스크를 소용돌이 그래피 (이하, 완충액 A라고 칭함);
      주 :이 단계에서 지질 농도가 더 손실이 지금까지 발생하지 정상적으로 5.25 mm로 할 것으로 예상된다.
    4. 주파수 O 실온에서 10 분 동안 수욕에서 초음파 처리 현탁액F 40 kHz에서. 이 솔루션은 다소 명확하게 볼 것이다.
    5. 압출기를 사용하여 200 nm의 기공 크기를 갖는 멤브레인을 4 패스로 돌출하는 제 2 사이클에 이어 400 nm의 기공 크기를 가진 막을 통해 현탁액을 10 회 통과한다.
      참고 얻어진 LUVs의 평균 직경은 ~ 175 ㎚이다. 필요한 경우, LUVs의 크기 및 동질성은 제조업체의 지시에 따라 동적 광산란에 의해 확인 될 수있다.
    6. 섹션 1.2의 설명 참조) LUV 현탁액의 인지질 농도를 정량화.
      참고 : 압출 동안 손실의, 농도는 일반적으로 약 3.6 밀리미터 때문입니다.
    7. 즉시 사용하지 않을 경우 약 2 주 동안 4 ° C에서 LUVs를 저장합니다.
  2. 인지질 정량
    주 : 인지질 재구성에 사용 LUV 현탁액의 농도뿐만 아니라, 최종적으로 생성되는 테오의 등을 결정하기 위해, 샘플의 분취 액이다 subje과염소산에 의해 산화 cted. 이 절차는 기준 (23)과 비교하여 비색 분석에 의해 정량화 무기 포스페이트 방출 인지질을 분해.
    1. 탈 이온화 증류수 인산 나트륨 40 mM의 스톡 용액 (NA 2 HPO 4)을 준비한다.
    2. 4 mM의 교정 기준이 될 수있는 솔루션을 0.4mm의 작동을 얻기 탈 증류수 원액을 희석.
    3. 작업 용액을 사용하여, 0 내지 50 μL의 최종 부피 80 nmol의 인산 나트륨 범위 13 × 100 ㎜ × 2 유리관의 표준 제조.
    4. LUV 및 proteoliposome 샘플을 각각 정량 10 μl를 타고 13 × 100 ㎜ × 2 유리 튜브에 DDH 2 O 40 μl를 희석.
      주 : LUVs와 테오의 지질 농도 범위이므로 2.5-5 μM, 시료 10 μL을 25-50 nmol의 지질 인을 함유한다.
    5. 가열 블록에서 145 ° C에서 1 시간 동안 기준 샘플과 열 각각에 300 μL 과염소산 추가. 증발을 방지하기 위해 튜브에 구슬을 넣어.
    6. 튜브는 실온으로 냉각하자 DDH 2 O 1 ㎖를 추가
    7. 갓 준비 12g / L의 몰리브덴 산 암모늄 및 50g / L의 아스 코르 빈산 나트륨과 소용돌이 각각 혼합하는 400 μl를 추가합니다.
    8. 튜브 위에 구슬 100 ° C에서 10 분 동안 가열한다. 가열 블록의 튜브를 제거하고 실온으로 냉각하자.
    9. 797 nm의 파장에서 분광 광도계로 블랭크 (0 nmol의 인산 나트륨을 함유하는 표준 시료)에 대하여 샘플의 흡광도를 측정한다.
    10. 교정 표준 곡선에 대한 샘플의 인산 함량을 결정합니다.
  3. 옵신의 재구성
    주 : 이들의 세제의 특성에 의존 할뿐만 아니라, 재구성을위한 최적의 팽윤 상태를 결정할 필요가있다LUVs의 지질 조성 및 농도. LUVs이 과정을 붓기에 자신의 광 산란 특성을 변경하면 리고와 레비 (24)와 Geertsma 등. (25)에 의해 검토로 흡광도 (그림 2)을 측정하여 모니터링 할 수 있습니다.
    1. 피펫 LUVs 800 μL (섹션 1.1에서, 압출 후의 지질 회수가 70 %이기 때문에, LUVs 예상 농도 3.6 mM의 인지질 인) 2 ㎖의 미세 원심 분리 튜브에.
    2. A. DDM 버퍼에 용해 (/ V는 W)의 완충액 A 5.3 ㎕의 10 % 34.7 μl를 추가
    3. 엔드 오버 엔드 혼합하면서 실온에서 3 시간 동안 인큐베이션.
    4. 한편, 폴리스티렌 비즈를 준비 :
      1. 샘플 당 구슬의 400 밀리그램을 사용하여 유리 비커에 그들을 밖으로 무게.
      2. 물과 메탄올로 두 번 세 번 씻어 한 번 버퍼 A. 각 세척 단계의 사용을 위해 액 5 mL를 10 분 동안 천천히 저어.
        참고 :이 폴리스티렌을 준비하는 것이 좋습니다예를 들어, 한 번에 여러 샘플을위한 비즈, 구슬 6g의 무게와 액체의 75 ㎖로 세척한다. 과량의 비드 며칠 동안 냉장고에 저장 될 수있다.
    5. 당 샘플 0.4 몰 %를 수득 NBD-PC 9.5 μL (1 밀리그램 / 클로로포름 용액 : 소포 불안정화의 마지막 30 분 동안 스크류 캡 유리관에서 NBD 표지 인지질 ( '재구성 유리관')를 건조 총 인지질) 유리관에서 질소 기류하에 건조하고이어서 0.1 %의 45 μL (완충액 A의 w / v)의 용해에 DDM
    6. 소포 불안정화 3 시간 1 ml의 최종 용적이 0.36 %를 함유하는 예를 용해-NBD 표지 된 인지질은 DDM - 가용화 된 단백질을 추가 버퍼 후 (W / V), 즉, 7 mm의 DDM.
      1. 이와 같이, (0.1 % DDM에 용해) NBD-PC 45 μL, 0.1 % DDM 60 μL 및 완충액 A 55 μL를 추가 (a 대조 시료로서 사용) 무 단백질 리포좀을 생성하는 단계; 테오에 대한 시험을 추가,PLE, 0.1 % DDM에서 (~ 110 NG / μL의 전형적인 스톡 용액으로부터) 단백질을 40 μL가 NBD-PC의 45 ㎕를 0.1 %의 DDM 20 μL 및 완충액 A 중 55 μl를 (0.1 % DDM에 용해) .
        참고 : 또한의 순서로 나열되어야합니다.
    7. 실온에서 끝을 통해 추가 시간 종료에 대한 샘플을 섞는다.
    8. 제조 된 폴리스티렌 비드 80 mg의 추가 엔드 오버 엔드 RT에서 1 시간 동안 혼합하여 시료를 배양한다.
    9. 다음 폴리스티렌 비드의 추가 160 mg의 추가 엔드 오버 엔드 RT에서 추가로 2 시간 동안 혼합하면서 배양한다.
    10. 신선한 폴리스티렌 비드 160 ㎎을 함유하는 유리 스크류 캡 튜브에 시료 (뒤에서 폐 폴리스티렌 비드를 떠나)을 전송하고 4 ℃에서 밤새 혼​​합한다.
      주의 : 샘플을 옮기고 비드를 흡입을 방지하는 가장 쉬운 방법은 약간의 포지티브 압력 유리관의 바닥에 밀어 파스퇴르 피펫을 사용하는 것이다. 피펫의 팁은 단단히되면상기 튜브의 하단은, 다음 샘플 비드의 간섭없이 쉽게 배출 될 수있다.
    11. 다음날 아침은 scramblase 활동 분석을위한 준비에 얼음에 구슬과 장소를 통해 전달하지 않고 미세 원심 분리 튜브에 샘플을 전송합니다.

2. Scramblase 활동 분석

주 : 완충액 A로 희석 리포좀 또는 테오의 형광 강도는 형광 분광계 온산의 첨가시 시간에 따른 모니터링된다. 안정한 출발 강도를 얻기 위해서는, 형광은 끊임없이 교반 샘플 온산 추가하기 전에 적어도 50 초 (또는 안정된 신호가 얻어 질 때까지)에 대해 기록하고 온산를 추가 한 후 적어도 500 초 동안 이어진다.

  1. 미니 볶음 막대를 포함하는 플라스틱 큐벳에 버퍼 A의 1,950 μl를 추가합니다.
  2. (리포좀) 제조 proteo의 50 μl를 추가하고 샘플이 형광 분광에 평형하자몇 초 동안 일정하게 교반 미터.
  3. 한편 0.5 M 버퍼링 트리스 (두 샘플은 미세 원심 분리 관에 온산 20 mg의 달아 114에 용해 예에 대해 1 M 디티 오 나이트 용액을 제조 μL 빙냉 직접 사용하기 전에, 다음 얼음에 보관 0.5 M 트리스 견본).
    참고 : 온산 솔루션을 새로 준비해야하고 준비 후 20 분을 사용할 수 없습니다; 다수의 측정이 이루어져야하는 경우 온산의 분취 량을 미리 칭량 바로 사용하기 전에 용해시킬 수있다.
  4. 형광 모니터링을 시작합니다 (여기 470 nm의, 방출 53​​0 nm의, 폭 0.5 nm의 슬릿).
  5. 기록 형광 (가능한 경우 큐벳 챔버의 뚜껑에 격막을 사용)를 시작한 후 큐벳 50 초에 1 M 디티 오 나이트 솔루션의 40 μl를 추가하고 추가로 400 ~ 600 초 동안 형광을 기록하는 것을 계속한다.
  6. 제 3 항에 기재된 데이터를 분석한다.

삼.데이터 분석

  1. 스크램블링의 속도론
    1. 초기 형광을 정의하여 scramblase 활성 분석에 의해 얻어진 각 샘플의 형광을 추적 특성화 F I, 디티 추가 및 종점 형광 F가 도달하기 전에> 400 초 후. F에서 I 전에 온산 첨가로 30 초 동안 형광의 평균값을 각 샘플에 대해 결정된다.
    2. 형광 감소의 정도, R = 100에 해당하는 엔드 포인트 데이터를 결정 • F / F 난. 우리는 옵신 함유 테오에 대한 무 단백질 리포좀과 R의 P의 용어 R의 L를 사용합니다.
  2. 기능적 재구성 Scramblase의 분자량 결정
    1. 하기 식에 따라 형광 감소 데이터를 변환 :
      P (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R 최대 - R의 L) (식 1)
      노트: R 최대 충분한 단백질 시료 내의 모든 소포는 적어도 하나의 기능 scramblase을 보유하도록 재구성 될 때 얻어지는 최대 감소이고, p는 재구성 된 샘플의 특정 소포가 'scramblase 활성'될 확률이고, 즉, 적어도 하나의 기능을 가지고 scramblase. R 최대 대신 예상 100 % (실험> 1 밀리그램 / 밀리몰의 PPR와 옵신 테오 대해 결정될 수 R 최대)의 일반적으로 82.5 % 3 반면 R의 L 값은 통상 45 % (3)이다. R 최대 같이 <100 %는 소체의 서브 모집단 재구성 난치성 인 것으로한다. R의 최대 = 82.5 %를, 단백질을 수용 할 수없는 소포의 비율은 0.35이다.
    2. 다음과 같이 포아송 통계에 의해 P (≥1 scramblase) 및 PPR (mg의 단백질 / 밀리몰의 인지질) 사이의 관계를 설명 :
      전자 - P (≥1 scramblase는 1) = 참고 : 어디 mg의 단백질 / 밀리몰의 인지질 단위로 소포 및 α = 모노 지수 맞는 일정에 따라 scramblases의 m = 수입니다.
    3. 소포의 분획 (논의 참조)에도 높은 PPR에 스크램블링에 기여하지 않기 때문에, 방정식을 수정
      P (≥1 scramblase) = 1 - 특급 (-PPR * / α) (식 3)
      주 : 여기서, f는,이 경우, PPR * = PPR / 0.65 (식 4)에서 소포 내화성 인구 또는 PPR * = PPR / (1-F).
      참고 : 맞는 상수 α는 모노 지수 함수와 PPR * 대 P (≥1 scramblase)의 그래프를 피팅에 의해 결정된다. 옵신 (분자량 41.7 kDa의)는 기능적으로 175 나노 미터 직경의 소포로 재구성하면 단량체, α = 0.187 mg의 밀리몰 -1 (각 소포는 28 인지질 (26)이있다). 이 옵신 dimerizes 경우 종래 α는, scramblase 활성 소체를 수득 3을 재구성 할= 0.37 mg을 밀리몰 -1. PPR보다는 PPR *는 분석을 위해 사용되는 것 인 경우, 대응하는 α 값은 0.122 및 0.244 mg을 밀리몰 -1이 될 것이다. α에 대한 이러한 예측 값은 모든 옵신 분자가 기능적 능력이 있다고 가정합니다. 분자의 일부만 지질 스크램블 능력이면 α의 대응 값보다 큰 것이다.

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Representative Results

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우리는 형광 기반의 분석을 사용하여 scramblase 활동의 특성을 LUVs에 옵신의 재구성에 대해 설명합니다. 우리는 스크램블링 옵신 - 중재 포스 포리 피드 속도에 하한치를 배치하고 옵신 기능적 소포로 재구성되는 올리고머 상태를 결정하는 결과를 분석한다.

최적의 재구성 조건을 식별하기 위해, 경험적으로 그들이 단백질의 삽입을 받아이되도록 LUVs을 팽윤 사용해야 세제의 양을 결정하는 것이 필요하다. 이러한 실험은도 2a에 도시되어있다. POPC의 분취 : POPG의 LUVs은 3 시간 동안 DDM 상이한 양으로 처리되는 시료의 흡광도는 540 nm의 때문에 소포 크기의 탁도 측정 및 측정된다. 540 nm의 (OD 540) 그래프에서 측정 된 광학 밀도는 소포가 DDM의 CONCENTR로 팽창 보여줍니다ATION 4-6 mm 내지 증가, DDM 더 증가함에 따라 (탁도 손실 OD (540) 신호에 대응하는) 용해를 시작하기 전에 약 7 밀리미터의 포화 점에 도달한다. NBD-PC는 세제 처리 후에 첨가하고, 샘플을 추가로 세제를 제거하기 위해 폴리스티렌 비드로 처리되기 전에 시간 동안 배양 하였다. 위에서 설명한대로 NBD-PC의 transbilayer 분포는 소포에 온산을 추가 한 후 형광 손실을 측정함으로써 결정된다. 따라서, NBD-PC는 온산하는 완전한 접근성에 의해 지시 세제의 부재에서 소체의 외 전단에 삽입한다. > 2 mM의 DDM으로 처리 소체 들어 NBD-PC는 DDM가 삭제되면 그 NBD-PC의 50 % 티 온산으로부터 보호되도록 모두 전단에 대칭으로 분배 할 수있다.

도 2b는 문헌 2에서 그려 유사한 불안정 - 재구성 실험 (도시 </ SUP>), 옵신의 재구성을 추적하는이 시간. 이 실험에서는 7 mM의 DDM 액세스 NBD-PC 정량적가되도록 (> 80 %) 등이 옵신 - 매개 스크램블링 한 결과 온산하는 옵신 재구성에 필요한 것을 알 수있다.

그림 2
그림 2. 세제 불안정 소체에 NBD-PC와 옵신의에서 재구성 (A) 소포의 분취 량을 실온에서 3 시간 동안 엔드 오버 엔드 혼합하여 세제 농도 (0-9 mM)을 범위로 처리하여 . 540 nm에서 샘플의 흡광도를 측정 잠복기 (검은 선)의 끝에. (V / DDM 0.1 중량 %에 용해) NBD-PC를 첨가하고, 세정제 폴리스티렌 비즈 처리에 의해 제거되기 전에 샘플을 실온에서 추가의 1 시간 동안 인큐베이션된다. 그 결과 리포좀은 불소에 의해 분석 escent 감소 분석 (레드 라인)는 NBD-PC가 대칭 적으로 재구성되는 정도를 결정합니다. (A)에서와 같이, (B)뿐만 계란의 인지질로부터 형성이 실험 소체의 경우 a 결과 DDM으로 불안정하고, 옵신가 NBD-PC와 함께 첨가 하였다 (계란 PC / 계란 포스 폰산, (9) 1 몰 / 몰) 약 80 %의 감소가 형광 단백질이 효율적으로 재구성하고 NBD-PC 스크램블 촉진 할되면 (문헌 2의 변형). NBD-PC가 대칭이 mM의 DDM에서 재구성되었지만, 옵신을 재구성을위한 이상적인 조건은 OD 540 흡광도, 즉,에 의해 지시 된 소포 인해 인터 세제에 매우 부어 있었다하지만 아직 용해되지 않은 점 (피크 주위에 선택되었다 화살). POPC / POPG (9 : 1 몰 / 몰)의 경우 소포, 8 mm의 DDM 농도 NBD-PC와 옵신의 재구성 모두를위한 최적의 것으로 밝혀졌다./54635/54635fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

형광의 감소의 정도는 재구성에 사용 옵신의 양은 증가한다. 도 3a는 (밀리몰 인지질 당 단백질 1mg 적색 트레이스 단위 PPR) 인지질의 비율로 서로 다른 단백질에 옵신으로 재구성 무 단백질 리포좀 (검은 색 트레이스) 및 테오를-NBD-PC가 함유 온산을 첨가하여 얻어진 형광 트레이스를 나타낸다 모두 쉽게 시각화 동일한 초기 형광 (F에서 I)의 값을 갖도록 정규화 된 트레이스되었다. 트레이스의 단지 수 끼워 20-25 초에 이르기까지 매우 비슷한 시간 상수를 나타낸다; 무 단백질 리포좀에 온산 매개 NBD-PC 감소율은 테오와 마찬가지이기 때문에, (TEX 참조 옵신 - 매개 스크램블링의 속도가 낮은 추정치를 배치하는 경우에만 가능하다자세한 내용은 t)는. 그림 3b는 * 형광 감소 분석에서 얻어진 분석 데이터 페이지 (≥1) scramblase (적어도 하나의 scramblase을 갖는 소포의 확률)을 실험적으로 측정 PPR 대 (PPR 관련의 플롯을 생성하는 방법을 보여줍니다 등) 위의 논의했다. 옵신에 대응하는 가상 발작의 실험 결과의 단지 수 맞는 비교 옵신는 이량 기능적으로 재구성하는 단량체, 이량 체 또는 사량보기로 재구성된다.

그림 3
그림 3 :. 옵신의 Scramblase 활동 μg의 0-4.95 사이에 이르기까지 NBD-PC와 옵신 양의 재구성 소포의 치료를 온산에 대응 (A) 형광 흔적은 웨지로 표시. 재구성 옵신의 최저 량은 0.21 밀리그램 / 밀리몰의 PPR에 대응초 0.43 밀리그램 / 밀리몰에 최고 금액 1.3 밀리그램 / 몰, 또는 평균 소포 당 10 opsins에 가장 높은 금액입니다. 온산는 지정된 시간 (화살표)로 첨가하고, NBD 형광은 상기 400 초 동안 모니터 하였다. 많은 실험의 평균은 82.5 % 인 반면이 실험에서 본 형광 감소의 최대 범위는 85 %였다. 스크램블링 (B) 단백질 의존성. 패널 A와 유사한 실험 데이터는 (단백질 포스트 정량화 된 소포 인지질 비 (PPR)의 단백질에 비해 적어도 하나 scramblase (p ≥1 scramblase)를 갖는 소포 확률의 그래프를 생성하기 위해 푸 아송 통계를 사용하여 분석 하였다 웨스턴 블롯 분석 3 인지질 재구성하여 산 가수 분해에 발표 무기 인산)을 측정하여 결정 하였다. 적색 선은 데이터의 단일 지수 피팅을 나타내고; 점선 회색 라인은 170 나노 미터 직경 V로 옵신의 재구성을위한 모노 지수 맞는을 나타냅니다단량체 예비 형성된 이합체 또는 예비 형성된 사량 등 esicles. x 축이 실험적으로 측정 PPR 나타내는 바와 같이, 적합 상수는 오히려 PPR * 값보다, 본문에 설명 된대로. PPR에 해당합니다 (대신 PPR *보다 ()을 본문 참조) 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.

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Discussion

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scramblase 활동 분석은 옵신는 인지질의 scramblase 활동이이 결정하기 위해 원래 우리를 활성화. 분석은 또한 우리 특이성을 테스트하여 옵신의 scramblase 활성을 특성화하도록 허용 (우리는도 1a에 NBD-PC에 대해 표시 나에로 아실 체인 NBD 표지 NBD - 포스파티딜 에탄올 아민 등의 NBD 표지 된 리포터 지질의 다양한 사용 헤드 그룹, NBD-핑고 마이 엘린 또는 NBD-의 포스파티딜 2) 지질 소포 조성물 (효과 등, 소체의 구성 성분으로서 상이한 양의 콜레스테롤) 및 옵신 모든 전시 scramblase 활성 로돕신의 상이한 구조적 상태 여부. 이러한 분석은 인지질 비 구체적이고 로돕신의 구조적 상태와 무관하거나 2,3의 발색단이 망막 포함 여부 (> 초당 10,000 인지질), 로돕신의 scramblase 활동이 매우 빠른 것으로 나타났습니다. 이리,우리는 옵신를 포함 테오를 생성하는 자세한 방법을 제시하고 인지질 scramblase 활동에 대한 이러한 준비를 분석하는 방법을 보여 주었다.

전술 한 재구성 프로토콜은 주어진 지질 조성물 및이를 용해 세제로 DDM을 사용하여 친 화성 크로마토 그래피 후 옵신 재구성을 위해 최적화된다. 변경된 조건에 이상적인 재구성 조건은도 2에 설명 된 "팽윤 - 실험"을 수행하여 결정될 필요가 있지만, 지질 조성물뿐만 아니라 세제는 실험자의 필요에 따라 변경 될 수있다. DDM 경험적 매우 적합 안정적이고 활성 상태로 옵신을 유지. 그러나, 옥틸 β 글루코 시드, CHAPS 또는 트리톤 X-100 계면 활성제와 같은 다른 유사한 프로토콜들에 따라 사용될 수있다. 트리톤 X-100은 efficie로 ATP 결합 카세트 트랜스 포터 (ABC 트랜스 포터)를 재구성하기위한 널리 사용되는 세제입니다막 재구성을 매개 ncy 다른 세제의 이상이며, 또한 미리 형성된 리포좀 24 평형 적은 시간이 걸립니다.

이 형광의 감소의 정도가 비 인지질 (실적 보고서)에 대한 단백질의 범위에 걸쳐, 즉 옵신 상이한 양으로 재구성 된 샘플들에 대해 획득되면 기능적 재구성 옵신 올리고머의 상태를 판단 할 수있다. 이를 위해 재구성 된 소포 PPR 명시 적으로 변경 가능 단백질 및 인지질의 회수로 측정되어야한다. 단백질 회수는 reconstitutions 사용되는 정제 된 단백질에 걸쳐 재구성 된 시료의 회수에 비교를 허용하는 보정 곡선을 생성하는데 사용되는 양적 웨스턴 블롯 분석에 의해 추정 될 수있는 반면 인지질 회수는 1.2 절에 설명 된 인산 분석에 의해 결정될 수있다 PPR 범위 (문헌 3에 상세히 설명 된 바와 같이) 테스트 하였다.

scramblase 활동 분석은 소포에 침투하지 않습니다 온산 가정에 내장되어 있습니다. 이 점은 소포 내에 용해 NBD 표지 된 리포터 트래핑하고 온산 의해 감소​​ 될 수 있는지 여부를 결정함으로써 확인할 수있다. 이를 위해, NBD 글루코스 (소포 불안정화 후에 첨가 12.6 μM)는 NBD-PC 대신 사용된다. 소포가 밀봉되어 있으므로 디티 오 나이트로부터 보호되어야한다 일단이 수용성 분자는 테오 안에 갇혀있다. 소형화의 NBD 글루코스가 완전히 액세스 할 수 있도록, 트리톤 X-100이 첨가 될 수있다 (1 % W / V)을 100 % 감소 3,27 초래한다.

테오는 리포터 지질 및 단백질 모두 대칭 인의 재구성을 확인하는 것을 특징으로 할 수있다. 후자 AspN 프로테아제를 사용하는 프로테아제 보호 전략을 기반으로하면서 전자는 요오드 이온을 사용하여 켄칭 충돌하는 실험에 의해 달성된다옵신 (3)의 C 말단 근처의 특정 부위에서 절단.

종점 형광 (F)에 scramblase 활성 분석에서 결정된 초기 형광 (F에서 I)의 전환은 복잡하지만, 우리의 목적을 위해 합리적 단일 지수 감쇠 함수로 근사화 될 수있다. 지수 함수 감쇠 (20 초)과 관련된 시간 상수는 약 스크램블링 빨리 또는 NBD 형광 단이 온산 감소되는 속도보다 빠르게 발생 나타내는 비활성 리포좀 활성 옵신 - 함유 테오 동일하다. 따라서 scramblase 활동 분석은 현재에 돌연변이의 분류를 허용 (온산 감소 화학에 의해 제한) 가난한 시간 해상도가 매우 느리거나 비활성, 활성. 이 분류는 칼슘 조절 scramblase TMEM16 27 볼 수있다 : 높은 칼슘 수준에서 형광 붕괴는 그쪽에 일정한 비슷한 시간 공개t는 속도 제한 단계는 지질 스크램블링보다 온산 의해 NBD-형광 물질의 화학적 환원임을 나타내는 무 단백질 리포좀 본. 반대로, 저 칼슘 수준 형광 감소의 정상 두 운동 성분 외측 전단의 온산 환원에 할당 한 상기 노광 저속을 구별하는 것이 가능하게, 900 초 후에 도달되지 외부에 내부-전단지 NBD-지질.

소포의 분획은 내화성이 있다는 것이 어렵다 실험 현실에 비해 높은 PPR (도 1C)를 제조 소포 온산 치료에 형광의 예측 된 100 % 손실 간의 불일치 ~ 85 % 감소 (도 3A)을 초과 제시 할 재구성한다. 이 분획은 세제 폴리스티렌 비드에 흡착으로 재구성 절차 중에 일찍 시일을 소포에 대응되어 있었다단백질을 수신하는 것이 더 이상 할 수 없습니다. 섹션 3에 기재된 분석을 위해, 우리는이 내화물 전체 인구 소포 F 분획에 해당하는 것으로. 우리는 내화물 소포의 NBD-PC 분자의 절반 (외부 전단지에 NBD-PC의 풀)을 가정하면 우리가 추정, 온산 감소 할 수 있습니다 F = 2 • (1 - R 최대 / 100), 또는 0.35 때 R 최대 = 82.5 %.

모노 지수 방정식 * 데이터 PPR은이 옵신은 단량체 또는 이량 체, 또는 고차 다량 포함한 상태의 혼합물로서 기능적으로 재구성 여부를 판정 할 수있는 피팅 상수 α를 제공 대 P (≥1 scramblase)의 피팅 . 옵신 분자 분획 스크램블링에서 작동 할 수없는 경우 결과의 해석은 복잡해진다. 이 가능성은 그것의 G 단백질을 모두 보유하고 있음을 보증 옵신 정제되는 조건이 부여되지만수용체 활동은 이량 체의 기능에 대응하는 삽입 α의 값은 절반 단백질 scramblases 같은 비활성 옵신의 제조에서 단량체의 기능 삽입하는 것으로 해석 할 수있다. 고려해야 할 추가 점은 우리가 제시 분석이 재구성에 사용되는 소포의 크기가 균일하다고 가정이다. 실제로, 소포는 표준 편차가 평균 입경의 1/3에 대응하는 가우스 분포에 의해 특징 직경의 범위를 갖는다. 다행히도, PPR * 데이터 대 P (≥1 scramblase)의 분석 결과에 크게 소포 이질성을 고려하여 우리는 데이터를 설명하는 데 충분하다되게되므로 간단한 분석에 의해 영향을받지 않는다.

우리 기재된 방법의 전위 한계 일 집약적 절차를 허용하지 않는 인 샘플의 매우 많은 수의 높은 처리량 측정차 그 소포 이질성은 판독을 방해 할 수 있습니다. 첫번째 문제는 scramblase 분석 용 마이크로 타이 터 플레이트 포맷을 사용함으로써 극복 될 수있다; 두번째 TIRF 현미경을 사용하여 단일 소포 분석하여 향후 해결 될 수있다.

불안정화 및 재구성 절차가 확립되면 scramblase 활성을 측정하기위한 온산 분석은 매우 안정적이고 강력한 것으로 간주 될 수있다. 다른 방법은 또한 디티 분석법에서 얻은 결과를 확인할 수 인지질 막 횡단 운반을 정량화하기 위해, 지방산 무 혈청 알부민 (22)를 사용하여 소포의 외부 전단으로부터 단쇄 NBD-지질 역 추출한다. 역 추출뿐만 아니라 온산 분석은 특성화 및 P4 형 및 -ATPase를 ABC 트랜스 포터의 28-33 flippases를 식별하기 위해 사용되어왔다.

여기에 제시된 도구는 쉽게 differe에 따라 적용 할 수있는NT는 설명 절차는 다재다능하고 파악하고 미래에 인지질 scramblases의 특성에 도움이 될 필요가있다. 세포 성장 동안 생체 점막의 확장에 필요한 scramblase의 포함이 다수의 ID를 배우는 것은 최대한 생리적으로 중요하다.

추가 정보와 데이터 분석에 대한 자세한 설명은, 독자는 우리의 실험실 2-4,27뿐만 아니라 다른 22,25,28,30에서 이전의 출판물이라고합니다.

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Disclosures

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 ml extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 ml Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

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References

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인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석
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Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).More

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

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