Abstract
Scramblases translokerer fosfolipider over membranen dobbeltlag bidirektionalt i en ATP-uafhængig måde. Den første scramblase der skal identificeres og biokemisk verificeret blev opsin, apoproteinet af fotoreceptor rhodopsin. Rhodopsin er en G-protein-koblede receptorer lokaliseret i stangen fotoreceptor plademembranerne i nethinden, hvor den er ansvarlig for opfattelsen af lys. Rhodopsin s scramblase aktivitet ikke afhænger af dens ligand 11- cis -retinal, dvs. apoproteinet opsin er også aktiv som scramblase. Selvom konstitutiv og reguleret phospholipid scrambling spiller en vigtig rolle i celle fysiologi, har kun få phospholipid scramblases blevet identificeret hidtil udover opsin. Her beskriver vi en fluorescens-baseret assay af opsin s scramblase aktivitet. Opsin rekonstitueres i store unilamellare liposomer bestående af phosphatidylcholin, phosphatidylglycerol og et spor mængde fluorescerende NBD-mærket PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl} - sn-glycero-3-phosphocholin). Scramblase aktivitet bestemmes ved måling i hvilket omfang NBD-PC-molekyler placeret i indre blad af vesiklen kan få adgang den ydre folder, hvor deres fluorescens kemisk elimineres med et reduktionsmiddel, som ikke kan krydse membranen. De metoder vi beskriver har generel anvendelighed og kan anvendes til at identificere og karakterisere scramblase aktiviteter i andre membranproteiner.
Introduction
Fotoreceptor rhodopsin, en prototypisk G-protein-koblede receptorer (gennemgået for eksempel i reference 1), er den første phospholipid scramblase der skal identificeres og biokemisk verificeret 2,3. Scramblases er phospholipid transportører, der øger uløseligt langsomme transbilayer phospholipid bevægelse til fysiologisk relevante niveauer i en tovejs, ATP-uafhængig måde 4-6. Eksempler på deres handlinger kan findes i det endoplasmatiske reticulum og bakteriel cytoplasmatiske membran, hvor konstitutiv scrambling er behov for membran homeostase og vækst, samt til en række forskellige glycosyleringsveje 5. Reguleret phospholipid scrambling er nødvendig for at eksponere phosphatidylserin (PS) på overfladen af apoptotiske celler, hvor det virker som en "spise-me" -signal for makrofager 7 og tilvejebringer et prokoagulant overflade på aktiverede blodplader til at katalysere produktion af protein faktors behov for blodpropper. I fotoreceptor disc membraner, har rhodopsin s scrambling aktivitet blevet foreslået at modvirke phospholipidet ubalance mellem de to membran foldere af dobbeltlaget, der genereres af den ATP-afhængige, ensrettet lipid flippase ABCA4 4,8,9 10-12.
På trods af den fysiologiske betydning scramblases, deres identitet forblev undvigende indtil rhodopsin blev rapporteret som en scramblase i fotoreceptor skiver 2 blev medlemmer af TMEM16 protein familien identificeret som Ca 2 + -afhængige scramblases nødvendige for PS eksponering ved plasmamembranen (revideret i henvisning 13), og det bakterielle protein FtsW blev foreslået som et lipid II scramblase påkrævet til peptidoglycansyntese 14. Disse opdagelser var baseret på rekonstituering af oprensede proteiner i liposomer og demonstration af scramblase aktivitet i de resulterende proteoliposomer anvendelse af metoden described her. Andre potentielle scramblases 15-21 - de MurJ og AMJ proteiner impliceret i peptidoglycan biosyntesen, WzxE og beslægtede proteiner impliceret i scrambling O-antigen forstadier, MprF protein er nødvendig for at translokere aminoacylerede phosphatidylglycerol tværs den bakterielle cytoplasmatiske membran, og Xkr8 familiemedlemmer, der er blevet foreslået at eksponere PS på overfladen af apoptotiske celler - forbliver der skal testes biokemisk. Dette understreger betydningen af en robust assay at identificere og karakterisere scramblase aktivitet.
Her beskriver vi rekonstituering af oprensede opsin, apoproteinet af fotoreceptor rhodopsin, i store unilamellare vesikler (LUV'er), og efterfølgende analyse af scramblase aktivitet i de resulterende proteoliposomer bruger fluorescens-baseret assay. Der er flere velbeskrevne protokoller tilgængelige i litteraturen til heterolog ekspression og oprensning af opsin, derfor vil vi ikkebeskrive det i denne protokol; vi bruger protokollerne der er beskrevet i Goren et al. 3 som giver FLAG-mærket, termostabil opsin ved ca. 100 ng / pl i 0,1% (vægt / volumen) dodecylmaltoside (DDM).
Rekonstituering opnås ved at behandle LUV'er med tilstrækkelig vaskemiddel, således at de kvælder, men ikke opløses. Under disse betingelser, et membranprotein - leveres i form af protein-detergent-miceller - vil integrere i liposomerne og blive rekonstitueret i liposommembranen ved fjernelse detergent, hvilket resulterer i proteoliposomer. Til rekonstituering opsin (opnået som et oprenset protein i 0,1% (vægt / volumen) DDM), er LUV fremstilles ud fra en blanding af POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) og POPG (1- palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- [phospho-rac- (1-glycerol)]) og mættet med DDM før tilsætning opsin og NBD-PC. Vaskemidlet fjernes derefter ved behandling af prøven med polystyrenkugler.
tøs = "jove_content"> Princippet for den fluorescens-assay er vist i figur 1B. LUV'er er symmetrisk rekonstitueres med en spormængde af NBD-PC eller anden NBD-mærket fluorescerende phospholipid reporter (figur 1A). Ved tilsætning dithionit, er en membran-impermeabel dianion, er NBD-PC-molekyler i den ydre folder af LUV'er gøres ikke-fluorescerende som nitro-gruppen af NBD reduceret til en ikke-fluorescerende amino-gruppe. Da hverken NBD-PC-molekyler eller dithionit er i stand til at krydse membranen på tidsskalaen af forsøget (<10 min), resulterer dette i 50% reduktion af det fluorescerende signal. Men hvis liposomerne rekonstitueres med en scramblase, kan NBD-PC-molekyler i indre blad forvrænge hurtigt til ydersiden, hvor de er reduceret. Dette resulterer i fuldstændigt tab af fluorescens i det ideelle tilfælde (figur 1C).
es / ftp_upload / 54.635 / 54635fig1.jpg "/>
. Figur 1: Skematisk afbildning af scramblase aktivitetsassay Assayet anvender et fluorescerende NBD-mærket reporter lipid; NBD-PC er vist (A). Store unilamellære vesikler rekonstitueres med en spormængde af NBD-PC. Rekonstituering producerer symmetriske blærer, med NBD-PC ligeligt i de ydre og indre foldere. Dithionit (S 2 O 4 2-) reducerer kemisk nitro-gruppen af NBD til en ikke-fluorescerende amino-gruppe. Behandling af protein-frie liposomer med dithionit (B, øverst) bevirker en 50% reduktion af fluorescens, da kun de NBD-PC-molekyler i den ydre indlægsseddel reduceres: dithionit er negativt ladet og kan ikke krydse membranen og reagerer med NBD-PC-molekyler i den indre folder. Dithionit behandling af opsin-holdige proteoliposomer (B, bund), dvs. scramblase-aktive proteoliposomer, resulterer i 100% tab af fluorescence som opsin letter flytning af NBD-pc mellem den indre og den ydre folder. (C) viser idealiserede fluorescens spor opnået på at behandle proteinfrie liposomer og opsin-holdige proteoliposomer med dithionit. Hastigheden af fluorescens tab er den samme i begge tilfælde indikerer, at den kemiske reduktion af NBD ved dithionit er hastighedsbegrænsende, og at scrambling sker ved en hastighed lig med eller større end hastigheden af den kemiske reaktion. Spor opnået fra en faktiske forsøg er vist i figur 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
De metoder, vi beskriver, kan anvendes til at rekonstituere og analysere andre oprensede proteiner, såvel som blandinger af membranproteiner fremstillet for eksempel ved ekstraktion mikrosomer med detergent 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af liposomer og proteoliposomer
- liposomdannelse
- Ved hjælp af en glassprøjte, tilsættes 1.435 pi POPC (25 mg / ml, i chloroform) og 160 pi POPG (25 mg / ml, i chloroform) til en rundbundet kolbe til opnåelse 52,5 pmol lipider i et molforhold på POPC: POPG = 9: 1.
- Tør lipiderne i 30 minutter under anvendelse af en rotationsfordamper ved en rotationshastighed på 145 rpm (der ikke er brug vandbad i dette volumen opløsningsmiddel), og derefter overføre kolben til et vakuumtørreskab i mindst 3 timer, eller natten over ved stuetemperatur (RT).
- Hydrere tørrede lipidfilm med 10 ml 50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl (herefter benævnt puffer A) ved kolben forsigtigt hvirvlende indtil en homogen, uklar suspension resultater;
BEMÆRK: lipid koncentration på dette tidspunkt forventes at være 5,25 mM som skulle have fundet sted uden tab hidtil. - Sonikeres suspensionen i et vandbad i 10 minutter ved stuetemperatur med en hyppighed of 40 kHz. Løsningen vil se noget klarere.
- Anvendelse af en ekstruder, passere suspensionen 10 gange gennem en membran med en 400 nm porestørrelse, efterfulgt af en anden cyklus af ekstrudering med 4 passerer gennem en membran med en porestørrelse på 200 nm.
BEMÆRK: middeldiameter af de resulterende LUV er ~ 175 nm. Om nødvendigt kan størrelsen og homogeniteten af LUV kontrolleres ved dynamisk lysspredning ifølge producentens anvisninger. - Kvantificere phospholipidet koncentration af LUV suspension som beskrevet i afsnit 1.2).
BEMÆRK: På grund af tab i ekstrudering, er koncentrationen normalt omkring 3,6 mM. - Opbevar LUV'erne ved 4 ° C i ca. 2 uger, hvis den ikke anvendes straks.
- phospholipid Kvantificering
BEMÆRK: For at bestemme phospholipid koncentration af LUV suspensionen anvendes til rekonstitution, såvel som for proteoliposomer, der vinder genereres en alikvot af prøven er subjeCTED for oxidation med perchlorsyre. Denne procedure nedbryder phospholipider til at frigive uorganisk phosphat, som derefter kvantificeret ved en kolorimetrisk assay i sammenligning med standarder 23.- Der fremstilles en 40 mM stamopløsning af natriumphosphat (Na 2 HPO 4) i deioniseret destilleret vand.
- Fortynd stamopløsning med deioniseret destilleret vand for at opnå 4 mM og 0,4 mM arbejder løsninger, der vil tjene som kalibreringsstandarder.
- Brug af arbejdsopløsninger, forberede standarder i 13 x 100 mm 2 glasrør spænder fra 0 til 80 nmol natriumphosphat i et endeligt volumen på 50 pi.
- Tag 10 pi hver af LUV og proteoliposomet prøver, der skal kvantificeres og fortyndes med 40 pi Hedeselskabet 2 O i 13 x 100 mm 2 glasrør.
BEMÆRK: Da lipidkoncentration på LUV'erne og proteoliposomer er i området 2,5-5 uM, de 10 pi prøve bør indeholde 25-50 nmol lipid fosfor. - Der tilsættes 300 pi perchlorsyre til hvert af de standarder og prøver og varme i 1 time ved 145 ° C i en varmeblok. Sætte kugler på rørene for at forhindre fordampning.
- Lad rørene afkøle til stuetemperatur og tilsættes 1 ml Hedeselskabet 2 O.
- Tilføj 400 pi hver af frisk fremstillet 12 g / L ammoniummolybdat og 50 g / l natriumascorbat og vortex blandes.
- Varme i 10 minutter ved 100 ° C med kugler på toppen af rørene. Fjern rørene fra varmeblokken og lad dem afkøle til stuetemperatur.
- Absorbansen af prøverne mod blanketten (standardprøve indeholdende 0 nmol natriumphosphat) med et spektrometer ved en bølgelængde på 797 nm.
- Bestem fosfat indholdet af prøverne i forhold kalibrering standard kurve.
- Rekonstituering af opsin
BEMÆRK: Det er nødvendigt at bestemme optimale hævelse betingelser for rekonstituering, da disse afhænger af beskaffenheden af detergentet, samtsom lipidsammensætningen og koncentrationen af de LUV'er. Som LUVs ændre deres lysspredningsegenskaber på hævelse processen kan overvåges ved at måle absorbans (figur 2) som revideret af Rigaud og Levy 24 og Geertsma et al. 25.- Pipetter 800 pi LUV'er (blandt afsnit 1.1; som lipidgenvindingsproces efter ekstrudering er 70%, den forventede koncentration af LUV'er er 3,6 mM phospholipid) i en 2 ml mikrofugerør.
- Tilføj 5.3 pi puffer A og 34,7 pi 10% (vægt / volumen) DDM opløst i buffer A.
- Inkuber i 3 timer ved stuetemperatur med ende-over-ende blanding.
- I mellemtiden forberede polystyrenperler:
- Brug 400 mg perler pr prøve og vejes i et glasbæger.
- Vaske dem to gange med methanol, tre gange med vand og en gang med buffer A. For hver vasketrin bruges 5 ml væske og omrøres langsomt i 10 minutter.
BEMÆRK: Det anbefales at forberede polystyrenperler til flere prøver på én gang, f.eks, vejer 6 g af perler og vask med 75 ml væske. Overskydende Perlerne kan opbevares i køleskab i adskillige dage.
- Under den sidste 30 min af vesikel destabilisering tørre NBD-mærket phospholipid i et skruelåg glasrør ( 'rekonstituering glasrør'): Per prøve, 9,5 pi NBD-PC (1 mg / ml i chloroform, hvilket giver 0,4 mol% af de samlede phospholipider) tørres under en strøm af nitrogen i et glasrør og derefter opløst i 45 pi 0,1% (vægt / volumen) DDM i buffer A.
- Efter 3 timer af vesikel destabilisering tilføje den opløste-NBD-mærket phospholipid, DDM-solubiliserede protein og buffer A, således at det endelige volumen på 1 ml indeholder 0,36% (vægt / volumen), dvs., 7 mM, DDM.
- For således at generere proteinfrie liposomer (anvendt som en kontrolprøve) tilsæt 45 pi NBD-PC (opløst i 0,1% DDM), 60 pi 0,1% DDM og 55 pi buffer A; for proteoliposomer tilføje, for eksamenPLE, 40 pi protein (fra en typisk stamopløsning af ~ 110 ng / pl) i 0,1% DDM, 45 pi NBD-PC (opløst i 0,1% DDM), 20 pi 0,1% DDM og 55 pi puffer A .
BEMÆRK: Rækkefølgen for tilsætning bør som anført.
- For således at generere proteinfrie liposomer (anvendt som en kontrolprøve) tilsæt 45 pi NBD-PC (opløst i 0,1% DDM), 60 pi 0,1% DDM og 55 pi buffer A; for proteoliposomer tilføje, for eksamenPLE, 40 pi protein (fra en typisk stamopløsning af ~ 110 ng / pl) i 0,1% DDM, 45 pi NBD-PC (opløst i 0,1% DDM), 20 pi 0,1% DDM og 55 pi puffer A .
- Prøven blandes i yderligere time ende over ende ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 80 mg af de fremstillede polystyrenkugler og inkuberes prøven med ende-over-ende blanding i 1 time ved stuetemperatur.
- Næste tilføje en ekstra 160 mg polystyrenkugler og inkuberes med ende-over-ende blanding i yderligere 2 timer ved stuetemperatur.
- Overfør prøven (forlader de brugte polystyrenperler bag) til et glas med skruelåg rør indeholdende 160 mg af friske polystyrenperler og blandes natten over ved 4 ° C.
BEMÆRK: Den nemmeste måde at overføre prøven og undgå suger perler er at bruge en Pasteur-pipette, der er skubbet til bunden af glasrøret med lidt positivt tryk. Når spidsen af pipetten er til stadighed stårbunden af røret, så prøven kan trækkes let uden indblanding fra perlerne. - Den næste morgen, overføre prøven til et mikrocentrifugerør uden at overføre perler og sted på is som forberedelse til scramblase aktivitet analysen.
2. Scramblase Activity Assay
BEMÆRK: Fluorescensintensiteten af liposomer eller proteoliposomer fortyndet med puffer A overvåges over tid ved tilsætning af dithionit i et fluorescensspektrometer. At opnå en stabil start intensitet, er fluorescensen registreres i mindst 50 sekunder (eller indtil en stabil signal opnås) før tilsætning dithionit til en konstant omrørt prøven og derefter fulgt i mindst 500 sek efter tilsætning dithionit.
- Tilføj 1.950 pi puffer A til en plastik kuvette indeholdende en mini stir-bar.
- Der tilsættes 50 pi af den fremstillede Proteo (liposomer) og lad prøven ækvilibrere i fluorescensen spectrometer med konstant omrøring i flere sekunder.
- I mellemtiden fremstilles en opløsning af 1 M dithionit i 0,5 M upufret Tris (fx for to prøver afvejes 20 mg dithionit i et mikrofugerør og opløses i 114 pi iskold 0,5 M Tris direkte før brug, og holde på is i den næste prøve).
BEMÆRK: dithionit opløsning skal frisklavet og bør ikke anvendes mere end 20 min efter fremstillingen; hvis der skal foretages mange målinger, kan portioner af dithionit afvejes på forhånd og opløses lige inden brug. - Start fluorescensovervågning (excitation 470 nm, emission 530 nm, spaltebredde 0,5 nm).
- Tilsæt 40 pi af 1 M dithionit-opløsning til kuvetten 50 sek efter start fluorescensen optagelse (brug skillevæggen i låget af kammeret kuvetten om muligt) og fortsætte med at registrere fluorescensen i yderligere 400-600 sek.
- Analyser af data som beskrevet i afsnit 3.
3.Dataanalyse
- Kinetik af Scrambling
- Karakterisere fluorescens spor af hver prøve opnået ved scramblase aktivitet assay ved at definere den indledende fluorescens, F i, inden tilsætning dithionit, og endepunkt fluorescens, F, nås efter> 400 sek. F I bestemmes for hver prøve som middelværdien af fluorescens for 30 sek periode før tilsætning af dithionit.
- Bestem end-point data svarende til omfanget af reduktionen fluorescens, R = 100 • F / F i. Vi bruger betegnelserne R L for protein-fri liposomer og R P for opsin-holdige proteoliposomer.
- Bestemmelse af molekylvægten af Funktionelt Rekonstitueret Scramblase
- Konvertere data reduktion fluorescens efter følgende ligning:
p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R max - R L) (ligning 1)
NOTE: Hvor R max er den maksimale reduktion, der opnås, når tilstrækkelig protein rekonstitueres således, at alle vesikler i prøven har mindst én funktionel scramblase, og p er sandsynligheden for, at en bestemt vesikel i en rekonstitueret prøve 'scramblase-aktive ", dvs., det har mindst én funktionel scramblase. Værdien for R L er typisk 45% 3 henviser R max er typisk 82,5% 3, i stedet for den forventede (Rmax kan bestemmes eksperimentelt for opsin proteoliposomer med en PPR på> 1 mg / mmol) 100%. Som R max <100% antages det, at en sub-population af vesikler er refraktære over for rekonstituering. For R max = 82,5%, den del af vesikler, der er ude af stand til at acceptere protein er 0,35. - Beskriv sammenhængen mellem p (≥1 scramblase) og PPR (mg protein / mmol phospholipid) ved Poisson statistik som følger:
p (≥1 scramblase) = 1 - e - Som en brøkdel af vesiklerne ikke bidrager til scrambling selv ved høj PPR (se diskussionen), ændre ligningen til:
p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (ligning 3)
BEMÆRK: Når PPR * = PPR / (1- f), hvor f er refraktære population af vesikler eller, i dette tilfælde, PPR * = PPR / 0,65 (ligning 4).
BEMÆRK: fit konstant α bestemmes ved at tilpasse en kurve over p (≥1 scramblase) versus PPR * med en mono-eksponentiel funktion. Hvis opsin (molekylvægt 41,7 kDa) funktionelt genopretter i vesikler 175-nm-diameter (hver vesikel har 280.000 fosfolipider 26) som en monomer, a = 0,187 mg mmol -1. Hvis opsin dimeriserer før rekonstitution 3, hvilket gav scramblase-aktive vesikler, så α= 0,37 mg mmol -1. Hvis PPR snarere end PPR * skulle anvendes til analysen, da de tilsvarende a-værdier vil være 0,122 og 0,244 mg mmol -1. Disse forudsagte værdier for α antage, at alle opsin molekyler er funktionelt kompetente. Hvis kun en brøkdel af molekylerne er kompetent til at kode lipider, så de tilsvarende α vil være større.
- Konvertere data reduktion fluorescens efter følgende ligning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver rekonstituering af opsin i LUV at karakterisere sin scramblase med anvendelse af fluorescens-baserede assay. Vi analyserer resultaterne til at placere en nedre grænse for hastigheden af opsin-medieret phospholipid scrambling og at bestemme den oligomere tilstand, hvor opsin funktionelt genopretter i vesiklerne.
For at identificere optimale rekonstitution betingelser, er det nødvendigt empirisk at bestemme mængden af vaskemiddel, som skal bruges til at kvælde LUV'erne så de er modtagelige for protein indsættelse. Et sådant eksperiment er vist i figur 2A. Prøver af POPC: POPG LUVs behandles med forskellige mængder af DDM for 3 timer og absorbansen af prøven måles ved 540 nm, et mål for turbiditet og derfor vesikel størrelse. Den optiske densitet målt ved 540 nm (OD 540) graf viser, at vesiklerne svulme som DDM concentrtion forøges 4-6 mM, nå et mætningspunkt på omkring 7 mM før man begynder at solubilisere (svarende til tab af turbiditet og OD 540 signal) som DDM forøges yderligere. NBD-PC tilsættes efter behandlingen detergent og prøverne inkuberes yderligere i en time før behandling med polystyrenkugler at fjerne detergent. Den transbilayer fordeling af NBD-PC bestemmes ved måling af fluorescens tab efter tilsætning dithionit til vesiklerne (som beskrevet ovenfor). Således NBD-PC indsætter ind i den ydre folder af vesikler i fravær af detergent, angivet ved sin fri adgang til dithionit. For vesikler behandlet med> 2 mM DDM, NBD-PC er i stand til at distribuere symmetrisk i begge foldere således at når DDM er fjernet 50% af NBD-pc er beskyttet fra dithionit.
Figur 2B viser en lignende destabilisering-opløsning eksperiment (gentegnes fra reference 2 </ Sup>), denne gang at spore rekonstituering af opsin. I dette eksperiment kan det ses, at 7 mM DDM er behov for opsin rekonstituering således at NBD-PC bliver kvantitativt (> 80%), der fås til dithionit som følge af opsin-medieret scrambling.
Figur 2:. Rekonstituering af NBD-PC og opsin i detergent-destabiliseret vesikler (A) Aliquoter af vesiklerne behandles med en række koncentrationer detergent (0-9 mM) ved blanding ende-over-ende i 3 timer ved stuetemperatur . Ved slutningen af inkubationsperioden absorbansen af prøverne ved 540 nm måles (sort linie). NBD-PC (opløst i 0,1% vægt / volumen DDM) tilsættes derefter og prøven inkuberes i yderligere 1 time ved stuetemperatur før detergent fjernes ved polystyrenkugler behandling. De resulterende liposomer analyseret af fluor reduktion escent assay (rød linje) for at afgøre, i hvilket omfang NBD-PC er symmetrisk rekonstitueres. (B) som i (a), men i dette forsøg vesikler dannet ud fra æggephospholipider (ægge-PC / egg phosphatidsyre, 9: 1 mol / mol) blev destabiliseret med DDM, og opsin blev tilsat sammen med NBD-PC, hvilket resulterer i en fluorescens reduktion på ca. 80%, når proteinet er effektivt rekonstitueres og kan gøre det lettere scrambling af NBD-PC (modificeret fra reference 2). Selvom NBD-PC symmetrisk blev rekonstitueret ved 2 mM DDM blev de ideelle betingelser for rekonstituering opsin valgt omkring toppen af OD540 absorbans, dvs. det punkt, hvor vesiklerne var stærkt opsvulmede grund indskudt vaskemiddel, men endnu ikke solubiliseret (angivet med pil). For POPC / POPG (9: 1 mol / mol) vesikler, en DDM koncentration på 8 mM viste sig at være optimalt for både NBD-PC og opsin rekonstitution./54635/54635fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Omfanget af reduktion fluorescens stiger med mængden af opsin anvendes til rekonstitution. Figur 3A viser fluorescens spor opnået på tilføje dithionit til NBD-PC-holdige protein-fri liposomer (sort spor) og proteoliposomer rekonstitueret med opsin ved forskellige protein til phospholipid nøgletal (PPR, i enheder af mg protein pr mmol phospholipid, røde spor); spor er blevet normaliseret, således at de alle har den samme indledende fluorescens (F i) værdi for nemmere visualisering. Monoeksponentiel anfald af spor tyder meget lignende tidskonstanter, der spænder 20-25 sek; som hastigheden af dithionit-medieret reduktion NBD-PC i proteinfrie liposomer er den samme som i de proteoliposomer, er det kun muligt at placere en lavere estimat på forekomsten af opsin-medieret scrambling (se Text for flere detaljer). Figur 3B viser de analyserede data fra analyserne reduktion fluorescens at give plot af p (≥1) scramblase (sandsynligheden for en vesikel, der har mindst én scramblase) versus den eksperimentelt målte PPR (relateret til PPR * som diskuteret ovenfor). Sammenligning af monoeksponentiel fit af de eksperimentelle resultater i hypotetiske passer svarende til opsin rekonstitueres som en monomer, dimer eller tetramer viser, at opsin genopretter funktionelt som en dimer.
Figur 3:. Scramblase aktivitet af opsin (A) Fluorescens spor svarende til dithionit behandling af vesikler rekonstitueret med NBD-PC og opsin mængder i området mellem 0-4,95 ug, indikeret ved kilen. Den laveste mængde opsin rekonstitueret svarer til en PPR på 0,21 mg / mmol dennæsthøjeste beløb til 0,43 mg / mmol og det højeste beløb til 1,3 mg / mmol, eller 10 opsiner pr vesikel i gennemsnit. Dithionit blev tilsat ved det anførte tidspunkt (pil) og NBD-fluorescens blev overvåget i yderligere 400 sekunder. Den maksimale udstrækning af fluorescens reduktion set i dette forsøg var 85%, mens gennemsnittet i mange eksperimenter er 82,5%. (B) Protein afhængighed scrambling. Data fra forsøg ligner panel A blev analyseret ved anvendelse Poisson statistikker til at generere en graf af sandsynligheden for vesikler med mindst en scramblase (p ≥1 scramblase) versus proteinet til phospholipid-forhold (PPR) af vesiklerne (protein blev kvantificeret post- rekonstituering ved Western Blot-analyse 3 og phospholipid blev bestemt ved måling uorganisk phosphat frigives ved sur hydrolyse). Den røde linje repræsenterer en mono-eksponentiel tilpasning for data; de stiplede grå linier repræsenterer mono-eksponentiel passer til rekonstitution af opsin i v nm diameter 170esicles monomerer, pre-formet dimerer eller pre-formet tetramerer. Da x-aksen repræsenterer den eksperimentelt målte PPR (snarere end PPR * (se hovedteksten)), de passer konstanter svarer til PPR i stedet PPR * værdier, som diskuteret i hovedteksten. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den scramblase aktivitet assay muligt for os oprindeligt at fastslå, at opsin har phospholipid scramblase aktivitet 2. Assayet også tilladt os at karakterisere opsin s scramblase aktivitet ved at teste specificiteten (vi anvendt en række forskellige NBD-mærkede reporter lipider, såsom NBD-phosphatidylethanolamin, mærket med NBD på en acylkæde som vist for NBD-PC i figur 1A, eller på hovedgruppe, NBD-sphingomyelin eller NBD- phosphatidylserin 2), virkningen af vesikel lipidsammensætning (fx cholesterol på forskellige mængder som vesikel bestanddel), og om de forskellige konformationelle tilstande af opsin og rhodopsin alle udviser scramblase aktivitet. Disse analyser viste, at rhodopsin s scramblase aktivitet er meget hurtigt (> 10.000 phospholipider pr sek), ikke-specifik for phospholipidet og uafhængig af rhodopsin konformationelle tilstand, eller om den indeholder sin kromofor retinal 2,3 eller ikke. Her,vi præsenteret en detaljeret metode til at generere proteoliposomer indeholder opsin og viste, hvordan man kan analysere disse forberedelser til phospholipid scramblase aktivitet.
Den beskrevne rekonstituering protokol er optimeret til den givne lipidsammensætning og til rekonstituering opsin efter det blev oprenset ved affinitetskromatografi under anvendelse DDM som solubiliserende detergent. Lipidsammensætningen samt vaskemidlet kan ændres efter behov forsøgslederen, selvom de ideelle rekonstituering betingelser for ændrede betingelser skal bestemmes ved at udføre "hævelse-eksperiment" beskrevet i figur 2. DDM er empirisk velegnet til opretholdelse opsin i stabile og aktive tilstand. Imidlertid kan andre detergenter, såsom octyl-β-glucosid, CHAPS eller Triton X-100 anvendes efter de samme protokoller. Triton X-100 er et meget anvendt detergent til rekonstituering ATP-bindende kassette transportører (ABC transportører) som sin efficieNCY i formidling membran rekonstituering er højere end andre rengøringsmidler, og det tager også mindre tid til at komme i ligevægt med præformede liposomer 24.
Det er muligt at bestemme den oligomere tilstand funktionelt rekonstitueret opsin hvis der opnås omfanget af fluorescerende reduktion for prøver rekonstitueret med forskellige mængder af opsin, dvs, over et område af protein til phospholipid-forhold (PPR'er). For at gøre dette, skal PPR af de rekonstituerede vesikler udtrykkeligt måles som nyttiggørelse af protein og phospholipid kan variere. Phospholipid opsving kan være bestemt af fosfat analyse beskrevet i afsnit 1.2, mens protein opsving kan estimeres ved kvantitativ Western Blot-analyse, hvor de oprensede proteiner anvendes til rekonstitutioner bruges til at generere en kalibreringskurve, der tillader sammenligning med inddrivelse af rekonstituerede prøver på tværs PPR testede (som forklaret i detaljer i reference 3).
Den scramblase aktivitet analysen bygger på den antagelse, at dithionit ikke trænge ind i vesikler. Dette punkt kan verificeres ved at fange en opløselig NBD-mærket reporter i vesiklerne og bestemme, om det kan reduceres ved dithionit. Til dette formål er NBD-glucose (12,6 uM tilsat efter vesikel destabilisering) anvendes i stedet for NBD-PC. Denne vandopløselige molekyle er indfanget i proteoliposomer når vesiklerne er forseglet og bør derfor beskyttes mod dithionit. At gøre NBD-glucose fuldt tilgængelige for reduktion, kan Triton X-100 tilsættes (1% vægt / volumen), som derefter resulterer i 100% reduktion 3,27.
De proteoliposomer kan karakteriseres at kontrollere, at rekonstitution af både reporter lipid og protein er symmetrisk. Førstnævnte opnås ved kollisionsdæmper quenching eksperimenter under anvendelse iodidioner mens sidstnævnte er baseret på en protease beskyttelsesstrategi hjælp AspN protease,skærer ved et specifikt sted nær C-terminalen af opsin 3.
Overgangen fra den indledende fluorescens (F i) bestemt i scramblase aktivitet assay til endepunkt fluorescens (F) er kompleks, men til vores formål kan det med rimelighed tilnærmes ved en enkelt eksponentielt henfald funktion. Tidskonstanten er forbundet med den eksponentielle henfald (20 sek) er omtrent den samme for inaktive liposomer og aktive, opsin-holdige proteoliposomer indikerer, at scrambling sker så hurtigt, eller hurtigere end den hastighed, hvormed NBD fluoroforen reduceres med dithionit. den scramblase aktivitet analysen har således en dårlig tidsopløsning (begrænset af dithionit reduktion kemi), som i øjeblikket kun tillader klassificering af mutanter i aktiv, meget langsom eller inaktive. Denne klassificering kunne ses for calcium-regulerede scramblase TMEM16 27: ved høje Ca 2 + niveauer, fluorescens henfald afslørede en tidskonstant ligner that set i proteinfrie liposomer, hvilket indikerer, at det hastighedsbegrænsende trin er kemisk reduktion af NBD-fluoroforen ved dithionit end lipid scrambling. Tværtimod ved lave Ca 2 + niveauer steady state af fluorescerende nedsættelse ikke blev nået efter 900 sek, hvilket gør det muligt at skelne mellem to kinetiske komponenter, hvoraf den ene er tildelt til dithionit reduktion af den ydre folder og langsommere ene til eksponeringen af indre-folder NBD-lipider til det fri.
Forskellen mellem den forudsagte tab 100% af fluorescens på dithionit behandling af vesikler fremstillet med høj PPR (figur 1C) versus den eksperimentelle virkelighed, hvor det er vanskeligt at overskride ~ 85% reduktion (figur 3A) antyder, at en fraktion af vesiklerne er refraktære rekonstitution. Denne fraktion kan svare til vesikler, tætning tidligt under hele opløsningsprocessen som detergent er adsorberet til polystyrenperlerne og erderfor ikke længere i stand til at modtage protein. Til analysen er beskrevet i afsnit 3, antog vi, at denne refraktære population svarer til en brøkdel f af de samlede vesikler. Hvis vi antager, at halvdelen af NBD-PC-molekyler (puljen af NBD-PC i den ydre folder) i de ildfaste vesikler er til rådighed for dithionit reduktion, så vurderer vi f = 2 • (1 - R max / 100), eller 0,35 når R max = 82,5%.
Montering af p (≥1 scramblase) versus PPR * data med en mono-eksponentiel ligning giver pasformen konstant α, hvorfra det er muligt at fastslå, om opsin rekonstituerer funktionelt som en monomer eller dimer, eller en blanding af tilstande inklusive højere ordens multimerer . Fortolkningen af disse resultater bliver kompliceret, hvis en brøkdel af opsin molekyler ikke kan fungere i scrambling. Mens dette er usandsynligt i betragtning af de betingelser, hvorunder opsin renses, som garanterer, at det bevarer alle sine G-proteinreceptor aktiviteter, en værdi på α svarer til den funktionelle indsættelse af dimerer kan også fortolkes som den funktionelle indsættelse af monomerer fra en præparation af opsin hvor halvdelen proteinerne er inaktive som scramblases. En ekstra punkt at overveje, er, at den analyse, vi præsenterer forudsætter, at de vesikler, der anvendes til rekonstituering er homogene i størrelse. I virkeligheden vesiklerne har en række diametre kendetegnet ved en gaussisk fordeling med en standardafvigelse svarende til cirka en tredjedel af den gennemsnitlige diameter. Heldigvis er resultatet af analysen af p (≥1 scramblase) versus PPR * data ikke væsentligt påvirket af hensyn til vesikel heterogenitet og så simpel analyse, som vi præsenterede er tilstrækkeligt til at beskrive data.
En potentiel begrænsning af de metoder, som vi beskrevet, er, at arbejdskrævende procedure ikke tillader high-throughput målinger af et meget stort antal af prøver ennd at vesikel heterogenitet kan forstyrre udlæsningen. Det første problem kan overvindes ved anvendelse af en mikrotiter-plade format for scramblase assay; det andet kunne løses i fremtiden ved enkelt vesikel assays under anvendelse TIRF mikroskopi.
Den dithionit assay til måling scramblase aktivitet kan anses for meget pålidelig og robust, når destabilisering og rekonstitution procedurer er etableret. En alternativ fremgangsmåde til at kvantificere transmembrane transport af phospholipider, der også giver kontrol resultaterne i forbindelse med dithionit assay er tilbageekstraktion af kortkædede NBD-lipider fra den ydre folder af vesiklerne ved hjælp fedtsyre-fri bovint serumalbumin 22. Back-udvinding samt dithionit analysen er også blevet anvendt til at karakterisere og identificere flippases af P4-type ATPaser og ABC transportører 28-33.
Da de værktøjer præsenteres her let kan tilpasses Forskelnt brug de beskrevne procedurer er alsidige og vil hjælpe med at identificere og karakterisere phospholipid scramblases i fremtiden. At lære identiteten af mange af disse, herunder tilsyn med den scramblase nødvendig for udvidelsen af biogene membraner under cellevækst er af allerstørste fysiologisk betydning.
For yderligere oplysninger og detaljeret beskrivelse af dataanalyse, er læserne henvises til tidligere udgivelser fra vores laboratorium 2-4,27 samt andre 22,25,28,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
| 1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
| Dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
| Fluorimeter cuvettes | sigma | C0918-100EA | cuvettes |
| Spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. | fluorimeter | |
| Sodium hydrosulfite technical grade, 85% | Sigma | 157953-5G | dithionite |
| GraphPad Prism 5 software | Prism | ||
| Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
| LIPEX 10 ml extruder | Northern Lipids, Inc. | Extruder | |
| Whatman, Drain disc, PE, 25 mm | Sigma | 28156-243 | Disc support |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110607 | 400 nm membrane |
| Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110606 | 200 nm membrane |
| sodium phosphate | Sigma | S3264-500G | |
| VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm | VWR Scientific | 47729-572 | glass tubes |
| Perchloric acid | Sigma | 30755-500ML | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma | A-7302 | ammonium molybdate |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A7631-25G | sodium ascorbate |
| Bio-Beads SM2 adsorbents | Bio Rad | 1523920 | polystyrene beads |
| 2.0 ml Microtubes clear | VWR Scientific | 10011-742 | Reconstitution tubes |
| Reconstitution glass tube | VWR Scientific | 53283-800 | Reconstitution glass tubes |
| Zetasizer | Malvern | DLS |
References
- Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
- Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
- Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
- Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
- Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
- Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
- Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
- Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
- Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
- Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
- Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
- Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
- Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
- Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
- Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
- Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
- Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
- Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
- Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
- Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
- Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
- Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
- Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
- Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
- Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
- Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
- Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
- Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
- Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).
