Abstract
Scramblases verplaatsen fosfolipiden over het membraan bilaag bidirectioneel in een ATP-onafhankelijke wijze. De eerste scramblase worden geïdentificeerd en biochemisch geverifieerd werd Opsin, de apo-eiwit van de fotoreceptor rhodopsine. Rhodopsine is een G-eiwit-gekoppelde receptor gelokaliseerd staaf fotoreceptor disc membranen van het netvlies waar het verantwoordelijk is voor de waarneming van licht. Rhodopsin's scramblase activiteit hangt niet af van zijn ligand 11- cis -retinal, dat wil zeggen, de apoproteïne opsin is ook actief als scramblase. Hoewel constitutief en gereguleerd fosfolipide versluiering een belangrijke rol spelen celfysiologie, slechts enkele fosfolipide scramblases dusver naast opsin geïdentificeerd. Hier beschrijven we een fluorescentie-gebaseerde test van scramblase activiteit opsin's. Opsin wordt opgelost in grote unilamellaire liposomen samengesteld uit fosfatidylcholine, fosfatidylglycerol en een spoor hoeveelheid fluorescent-NBD gelabelde PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazool-4-yl) amino] hexanoyl} - sn-glycero-3-fosfocholine). Scramblase activiteit wordt bepaald door de mate waarin NBD-PC moleculen in het binnenste leaflet van de vesicle in staat om de buitenste laag waar hun fluorescentie chemisch wordt geëlimineerd door een reductiemiddel dat het membraan niet kan passeren. De werkwijzen beschrijven we hebben algemene toepasbaarheid en kunnen worden gebruikt om scramblase activiteiten van andere membraaneiwitten identificeren en te karakteriseren.
Introduction
De fotoreceptor rhodopsine, een prototypisch G-eiwit gekoppelde receptor (besproken in bijvoorbeeld referentie 1), is het eerste fosfolipide scramblase worden vastgesteld en geverifieerd biochemisch 2,3. Scramblases zijn fosfolipiden transporters die de intrinsiek langzame transbilayer fosfolipiden beweging te verhogen tot fysiologisch passende niveaus in een bidirectionele, ATP-onafhankelijke wijze 4-6. Voorbeelden van hun acties te vinden in het endoplasmatisch reticulum en bacteriële cytoplasmatische membraan waarbij constitutief versluiering nodig voor membraan homeostase en groei, alsmede voor een verscheidenheid van glycosyleringsroutes 5. Gereguleerd fosfolipide versluiering nodig om fosfatidylserine (PS) op het oppervlak van apoptotische cellen bloot waar het als een "eet-me" -signaal voor macrofagen en 7 verschaft een procoagulant oppervlak op geactiveerde bloedplaatjes tot de productie van eiwit factor katalyserens die nodig zijn voor de bloedstolling. In fotoreceptor disc membranen heeft scrambling activiteit rhodopsine is voorgesteld om het fosfolipide onbalans tussen de twee membraanlagen folders van de bilaag die wordt gegenereerd door de ATP-afhankelijke unidirectionele lipide tegen flippase ABCA4 4,8,9 10-12.
Ondanks het fysiologische belang van scramblases, hun identiteit ongrijpbaar gebleven tot rhodopsine werd gerapporteerd als scramblase in fotoreceptor schijven 2, leden van de eiwitfamilie TMEM16 geïdentificeerd als Ca2 + -afhankelijke scramblases nodig voor PS blootstelling bij de plasmamembraan (besproken in referentie 13), en de bacteriële eiwit FtsW voorgesteld als een lipide II scramblase vereist peptidoglycaansynthese 14. Deze ontdekkingen zijn gebaseerd op de reconstitutie van gezuiverde eiwitten in liposomen en demonstratie van scramblase activiteit in de verkregen proteoliposomen hand van de methode describHier ed. Andere potentiële scramblases 15-21 - de MurJ en AMJ eiwitten die betrokken zijn bij de biosynthese van peptidoglycaan, WzxE en verwante eiwitten betrokken bij scrambling O-antigen voorlopers, MPRF eiwit nodig om aminogeacyleerde phosphatidylglycerol verplaatsen over het bacteriële cytoplasma membraan en Xkr8 familieleden die zijn voorgesteld bloot PS op het oppervlak van apoptotische cellen - nog moeten biochemisch testen. Dit benadrukt het belang van een robuuste test te identificeren en te karakteriseren scramblase activiteit.
Hier beschrijven we de bereiding van gezuiverde opsin het apo-eiwit van de fotoreceptor rhodopsine, in grote unilamellaire vesikels (LUV's) en daaropvolgende analyse van scramblase activiteit in de verkregen proteoliposomen met een op fluorescentie gebaseerde assay. Er zijn verscheidene goed beschreven protocols beschikbaar in de literatuur voor de heterologe expressie en zuivering van opsin, daarom zullen wij nietbeschrijven in dit protocol; We gebruiken het in Goren et al. 3 beschreven protocollen die FLAG-gemerkte, thermostabiel opsin levert ongeveer 100 ng / ul in 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).
Reconstitutie wordt bereikt door behandeling LUVs voldoende wasmiddel zodat zij zwellen maar niet oplossen. Onder deze omstandigheden, een membraaneiwit - in de vorm van eiwit-detergens micellen meebrengen - te integreren in de liposomen en wordt opgelost in de liposoommembraan na verwijdering detergens, waardoor proteoliposomen. Opsin te reconstitueren (verkregen als een gezuiverd eiwit in 0,1% (w / v) DDM), worden LUV's bereid uit een mengsel van POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine) en POPG (1- palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- [fosfo-rac- (1-glycerol)]) en verzadigd met DDM voor het toevoegen opsin en NBD-PC. Daarna wordt het detergens verwijderd door behandelen van het monster met polystyreen korrels.
lass = "jove_content"> Uitgangspunt van de fluorescentie-gebaseerde test wordt getoond in figuur 1B. LUV symmetrisch gereconstitueerd met een sporenhoeveelheid NBD-PC of andere NBD-gelabelde fluorescente fosfolipide reporter (Figuur 1A). Het toevoegen dithioniet, is een membraan-impermeant dianion, NBD-PC moleculen in de buitenste laag van de LUV's worden weergegeven niet fluorescerende als de nitro-groep NBD tot een niet-fluorescerende aminogroep. Aangezien noch NBD-PC moleculen of dithioniet kunnen migreren door de op de tijdschaal van het experiment (<10 min) resulteert in 50% reductie van het fluorescentiesignaal. Indien de liposomen worden gereconstitueerd met een scramblase, NBD-PC moleculen in het binnenste leaflet kan snel scramble naar buiten waar zij worden gereduceerd. Dit resulteert in het totale verlies van fluorescentie in het ideale geval (figuur 1C).
es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. Figuur 1: Schematische weergave van de scramblase activiteit assay De assay maakt gebruik van een fluorescent-gelabelde reporter NBD lipide; NBD-PC is afgebeeld (A). Grote unilamellaire blaasjes gereconstitueerd met een sporenhoeveelheid NBD-PC. Reconstitutie produceert symmetrische blaasjes met NBD-PC gelijk verdeeld in de buitenste en binnenste folders. Dithioniet (S 2 O 4 2-) chemisch reduceert de nitro-groep NBD een niet-fluorescerende aminogroep. Behandeling van eiwitvrije liposomen met dithioniet (B, boven) veroorzaakt een reductie 50% van de fluorescentie omdat alleen het NBD-PC moleculen in de buitenste laag gereduceerd: dithioniet is negatief geladen en kan het membraan reageren met NBD-PC moleculen niet overschrijden in het binnenste leaflet. Dithioniet behandeling van opsin bevattende proteoliposomen (B, onder), dat wil zeggen, scramblase-actieve proteoliposomen, resulteert in 100% verlies van fluorescence als opsin vergemakkelijkt beweging van NBD-PC tussen de binnenste en de buitenste laag. (C) toont geïdealiseerde fluorescentie sporen verkregen op de behandeling van eiwitvrije liposomen en-opsin bevattende proteoliposomen met dithioniet. De snelheid van fluorescentie verlies is hetzelfde in beide gevallen aangeeft dat de chemische reductie van NBD door dithioniet is snelheidsbeperkende, en dat klauteren gebeurt met een snelheid die gelijk is aan of groter is dan de snelheid van de chemische reactie. Sporen verkregen uit een eigenlijke experiment zijn weergegeven in figuur 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De werkwijzen beschrijven we kunnen worden gebruikt voor het reconstitueren en andere testen gezuiverde eiwitten, alsmede mengsels van membraaneiwitten verkregen, bijvoorbeeld door extractie met detergens microsomen 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van liposomen en proteoliposomen
- liposoom Formation
- Met een glazen injectiespuit, voeg 1435 ul POPC (25 mg / ml in chloroform) en 160 gl POPG (25 mg / ml in chloroform) om een rondbodemkolf tot 52,5 umol lipiden in een molaire verhouding van POPC verkrijgen: POPG = 9: 1.
- Droog de lipiden gedurende 30 min onder toepassing van een rotatieverdamper bij een rotatiesnelheid van 145 rpm (geen waterbad nodig voor deze hoeveelheid oplosmiddel), breng de kolf met een vacuüm exsiccator gedurende tenminste 3 uur, of overnacht, bij kamertemperatuur (RT).
- Hydrateren gedroogde lipide film met 10 ml 50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl (hierna te noemen buffer A) door zachtjes omzwenken totdat een homogene, troebele suspensie resultaten;
Opmerking: De concentratie aan lipiden in deze fase wordt verwacht dat 5,25 mM als geen verliezen zo ver moet hebben plaatsgevonden. - Ultrasone trillingen de suspensie in een waterbad gedurende 10 min bij kamertemperatuur met een frequentie of 40 kHz. De oplossing zal iets duidelijker kijken.
- Onder toepassing van een extruder, passeert de suspensie 10 maal door een membraan met een 400 nm poriegrootte, gevolgd door een tweede cyclus van extrusie met 4 passages door een membraan met een 200 nm poriegrootte.
OPMERKING: De gemiddelde diameter van de resulterende LUV is ~ 175 nm. Indien nodig kan de grootte en homogeniteit van de LUV's worden gecontroleerd door dynamische lichtverstrooiing volgens de instructies van de fabrikant. - Kwantificeren van de fosfolipide concentratie van de LUV suspensie zoals beschreven in paragraaf 1.2).
LET OP: Als gevolg van de verliezen tijdens de extrusie, is de concentratie meestal rond de 3,6 mm. - Bewaar de LUV's bij 4 ° C gedurende ongeveer 2 weken Indien niet direct gebruikt.
- fosfolipiden kwantificering
OPMERKING: De fosfolipideconcentratie van de LUV suspensie voor reconstitutie, evenals die van de proteoliposomen die uiteindelijk heeft gegenereerd, een deel van het monster is subjected oxidatie met perchloorzuur. Deze procedure breekt fosfolipiden anorganisch fosfaat dat vervolgens door een colorimetrische bepaling wordt gekwantificeerd ten opzichte van standaard 23 vrijgeven.- Bereid een 40 mM voorraad oplossing van natriumfosfaat (Na 2 HPO 4) in gedeïoniseerd gedestilleerd water.
- Verdun de voorraad oplossing met gedeïoniseerd gedestilleerd water tot 4 mm en 0,4 mm werkende oplossingen die als kalibratienormen zal dienen te verkrijgen.
- De working oplossingen bereid normen in 13 x 100 mm glazen buizen 2 variërend van 0 tot 80 nmol natriumfosfaat in een eindvolume van 50 pi.
- Neem 10 pi elk van de LUV en proteoliposoom monsters te kwantificeren en verdun met 40 ul van DDH 2 O in 13 x 100 mm 2 glazen buisjes.
Opmerking: Als het lipide concentratie van de LUV proteo in het traject 2,5-5 uM, de 10 ul monster moet 25-50 nmol lipide fosfor. - Voeg 300 gl perchloorzuur aan alle standaarden en monsters en verwarm gedurende 1 uur bij 145 ° C in een verwarmingsblok. Zet knikkers op de buizen om verdamping te voorkomen.
- Laat de buizen afkoelen tot kamertemperatuur en voeg 1 ml van DDH 2 O.
- Voeg 400 ul elk vers bereide 12 g / l ammoniummolybdaat en 50 g / l natrium- ascorbaat en vortex te mengen.
- Warmte gedurende 10 minuten bij 100 ° C met knikkers bovenop de buizen. Verwijder de buizen uit het verwarmingsblok en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur.
- Meet de absorptie van de monsters ten opzichte van de blanco (standaardmonster met 0 nmol natriumfosfaat) met een spectrometer bij een golflengte van 797 nm.
- Bepaal het fosfaatgehalte van monsters tegen de kalibratie standaard curve.
- Reconstructie van Opsin
Opmerking: Het is noodzakelijk om optimale omstandigheden voor reconstitutie zwelling te bepalen aangezien deze afhangen van de aard van het detergens, ende lipidesamenstelling en concentratie van de LUV's. Als LUV hun lichtverstrooiing eigenschappen veranderen zwellen van het proces kan worden gevolgd door meten van de absorptie (Figuur 2) zoals beoordeeld door Rigaud en Levy 24 en Geertsma et al. 25.- Pipetteer 800 ul van LUV (uit paragraaf 1.1, als lipide herstel na extrusie is 70%, de verwachte concentratie van LUV is 3,6 mm fosfolipide) in een 2 ml microfugebuis.
- Voeg 5,3 pl buffer A en 34,7 pl 10% (w / v) DDM opgelost in buffer A.
- Incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur end-over-end mengen.
- Ondertussen bereiden de polystyreen korrels:
- Gebruik 400 mg korrels per monster en wegen ze in een glazen beker.
- Was ze tweemaal met methanol, driemaal met water en eenmaal met buffer A. Voor elke wasstap gebruik 5 ml vloeistof en roer langzaam gedurende 10 minuten.
LET OP: Het is aanbevolen om het polystyreen te bereidenkralen voor meerdere monsters tegelijkertijd, bijvoorbeeld wegen 6 g kralen en wassen met 75 ml vloeistof. Excess kralen kunnen worden bewaard in een koelkast gedurende enkele dagen.
- Tijdens de laatste 30 minuten van blaasje destabilisatie droog de NBD-gelabelde fosfolipide in een schroefdop glazen buis ( 'reconstructie glazen buis'): Per monster, 9,5 ui van NBD-PC (1 mg / ml in chloroform, hetgeen 0,4 mol% van de totale fosfolipiden) gedroogd onder een stroom van stikstof in een glazen buis en vervolgens in 45 pl 0,1% (w / v) in buffer A. DDM opgelost
- Na 3 h vesicle destabilisatie voeg de opgeloste NBD-gemerkte fosfolipide, de DDM-oplosbaar eiwit en een buffer zodat de uiteindelijke volume van 1 ml bevat 0,36% (w / v), dat wil zeggen, 7 mM, DDM.
- Dus om eiwitvrij liposomen (gebruikt als controlemonster) voeg 45 ul van NBD-PC (opgelost in 0,1% DDM), 60 gl 0,1% DDM en 55 ui buffer A te genereren; voor proteoliposomen toe te voegen, voor examenple, 40 pi proteïne (een typische voorraadoplossing van ~ 110 ng / ul) in 0,1% DDM, 45 pl NBD-PC (opgelost in 0,1% DDM), 20 gl 0,1% DDM en 55 ui buffer A .
LET OP: De volgorde van toevoeging moet zo worden vermeld.
- Dus om eiwitvrij liposomen (gebruikt als controlemonster) voeg 45 ul van NBD-PC (opgelost in 0,1% DDM), 60 gl 0,1% DDM en 55 ui buffer A te genereren; voor proteoliposomen toe te voegen, voor examenple, 40 pi proteïne (een typische voorraadoplossing van ~ 110 ng / ul) in 0,1% DDM, 45 pl NBD-PC (opgelost in 0,1% DDM), 20 gl 0,1% DDM en 55 ui buffer A .
- Meng het monster tegen uur over de kop bij kamertemperatuur.
- Voeg 80 mg van de bereide polystyreen kralen en incuberen van het monster met eind-over-eind mengen gedurende 1 uur bij KT.
- Voeg vervolgens nog eens 160 mg polystyreen kralen en incubeer met eind-over-eind mengen gedurende nog eens 2 uur bij KT.
- Breng het monster (waarbij de verbruikte polystyreenparels achter) een glazen schroefdop buis met 160 mg vers polystyreenkorrels en roer overnacht bij 4 ° C.
OPMERKING: De gemakkelijkste manier om het monster over te dragen en te voorkomen zuigen korrels een Pasteur pipet die wordt geduwd naar de bodem van de glazen buis met een kleine positieve druk gebruikt. Zodra de punt van de pipet is stevig bij hetbodem van de buis, dat het monster kan gemakkelijk worden teruggetrokken zonder tussenkomst van de bolletjes. - De volgende ochtend, de overdracht van het monster aan een microfugebuis zonder over te dragen kralen en leg ze op ijs in voorbereiding op de scramblase activiteit assay.
2. scramblase Activity Assay
OPMERKING: De fluorescentie-intensiteit van liposomen of proteoliposomen verdund met buffer A in de tijd gevolgd bij toevoeging van dithioniet in een fluorescentie spectrometer. Om een stabiele startintensiteit verkrijgen, wordt de fluorescentie genoteerd voor ten minste 50 seconden (of totdat een stabiel signaal bereikt) voor het toevoegen dithioniet een continu geroerde monster en wordt dan gevolgd gedurende ten minste 500 seconden na toevoegen van dithioniet.
- Voeg 1950 pl buffer A om een plastic cuvet met een mini-bar roer.
- Voeg 50 ul van de voorbereide Proteo (liposomen) en laat het monster equilibreren de fluorescentie spectrofotometermeter onder constant roeren gedurende enkele seconden.
- Ondertussen bereiden een oplossing van 1 M dithioniet in 0,5 M ongebufferd Tris (bijvoorbeeld voor twee monsters Weeg 20 mg dithioniet in een microfugebuis en los op in 114 ul ijskoude 0,5 M Tris direct voor gebruik en bewaar op ijs voor de volgende monster).
OPMERKING: De dithioniet oplossing moet worden bereid en mogen niet worden gebruikt meer dan 20 minuten na bereiding; Als vele metingen worden verricht, kunnen aliquots dithioniet worden gewogen en opgelost tevoren vlak voor gebruik. - Start de fluorescentie monitoren (excitatie 470 nm, emissie 530 nm, spleetbreedte 0,5 nm).
- Voeg 40 ul van 1 M dithioniet oplossing van de cuvet 50 sec na aanvang van de fluorescentie opname (gebruik het septum in het deksel van de cuvette kamer indien mogelijk) en blijven de fluorescentie opnemen nog 400-600 sec.
- Analyseer de gegevens zoals beschreven in paragraaf 3.
3.Gegevensanalyse
- Kinetiek van Scrambling
- Kenmerken de fluorescentie van elk spoor verkregen door scramblase activiteit testmonster door het definiëren van de initiële fluorescentie, Fj, voorafgaand aan het toevoegen dithioniet en het eindpunt fluorescentie, F, bereikt na> 400 sec. F i wordt voor elk monster bepaald als de gemiddelde waarde van fluorescentie van de 30 seconden periode vóór toevoeging van dithioniet.
- Bepaal het eindpunt gegevens betreffende de mate van fluorescentie vermindering, R = 100 • F / V i. Wij gebruiken de termen R L eiwitvrije liposomen en R P-opsine bevattende proteoliposomen.
- Het bepalen van de molecuulgewicht van het Functioneel Gereconstitueerd scramblase
- Zetten de gegevens fluorescentie reductie volgens de volgende vergelijking:
p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (Rmax - R L) (Vergelijking 1)
NOTITIE: Waar Rmax de maximale vermindering die wordt verkregen wanneer voldoende eiwit zodat alle blaasjes in het monster bezitten ten minste één functionele scramblase wordt gereconstitueerd en p de waarschijnlijkheid dat een bepaald blaasje in een gereconstitueerd monster "scramblase actief", dat wil zeggen, bezit ten minste één functionele scramblase. De waarde van RL typisch 45% 3 dat Rmax typisch 82,5% 3, in plaats van de verwachte 100% (Rmax kan experimenteel worden bepaald voor opsin proteoliposomen met PPR van> 1 mg / mmol). Zoals Rmax <100% wordt aangenomen dat een subpopulatie van vesicles ongevoelig is voor reconstitutie. Voor Rmax = 82,5%, de fractie van vesicles die niet kan accepteren eiwit is 0,35. - Beschrijf de relatie tussen p (≥1 scramblase) en PPR (mg eiwit / mmol fosfolipide) door Poisson statistieken als volgt:
p (≥1 scramblase) = 1 - e - Als een fractie van de vesicles niet bijdraagt aan scrambling zelfs bij hoge PPR (zie bespreking), wijzigt de vergelijking:
p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Vergelijking 3)
OPMERKING: Indien PPR PPR * = / (1- f), waarbij f de refractaire populatie van vesicles of, in dit geval, PPR * = PPR / 0,65 (Vergelijking 4).
OPMERKING: De pasvorm constante α wordt bepaald door het aanbrengen van een grafiek van p (≥1 scramblase) versus PPR * met een mono-exponentiële functie. Als opsin (molecuulgewicht 41,7 kDa) functioneel reconstrueert in 175-nm diameter vesikels (blaasjes heeft elke 280.000 fosfolipiden 26) als een monomeer, α = 0,187 mg mmol -1. Als opsin dimeriseert vóór reconstitutie 3 tot scramblase-actieve vesicles verkregen, dan α= 0,37 mg mmol -1. Als PPR plaats PPR * zouden worden gebruikt voor de analyse, dan zou de overeenkomstige α waarden 0,122 en 0,244 mg mmol -1 zijn. Deze voorspelde waarden van α veronderstellen dat alle opsin moleculen functioneel bevoegd. Als slechts een fractie van de moleculen bevoegd lipiden scramble dan de overeenkomstige waarden van α groter.
- Zetten de gegevens fluorescentie reductie volgens de volgende vergelijking:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We beschrijven de bereiding van opsin in LUV's zijn scramblase activiteit karakteriseren met behulp van een fluorescentie-gebaseerde test. We analyseren de resultaten aan een ondergrens te plaatsen op de snelheid van opsin gemedieerde fosfolipiden klauteren en de oligomere toestand waarin opsin functioneel reconstitutes in de blaasjes te bepalen.
Optimale reconstitutie voorwaarden aangeeft, moet empirisch bepalen de hoeveelheid wasmiddel die moet worden gebruikt om de LUV zwellen zodat ze ontvankelijk voor proteïne insertie. Een dergelijk experiment wordt geïllustreerd in figuur 2A. Hoeveelheden van POPC: POPG LUVs behandeld met verschillende hoeveelheden DDM gedurende 3 uur en de absorptie van het monster wordt gemeten bij 540 nm een maat voor de troebelheid en derhalve van vesiclegrootte. De optische dichtheid gemeten bij 540 nm (OD 540) grafiek blijkt dat de vesicles zwellen DDM concentratie wordt verhoogd 4-6 mM, bereikt een verzadigingspunt ongeveer 7 mM voordat solubiliseren (overeenkomend met verlies van troebelheid en OD 540 signaal) als DDM verder wordt vergroot. NBD-PC wordt toegevoegd na detergensbehandeling en de monsters worden verder geïncubeerd gedurende een uur alvorens de medicatie met polystyreen kralen reinigingsmiddel te verwijderen. Transbilayer de verdeling van NBD-PC wordt bepaald door meting van fluorescentie verlies na toevoeging dithioniet de vesicles (zoals hierboven beschreven). Aldus NBD-PC voegt in de buitenste laag van de vesicles in de afwezigheid van detergens, aangegeven door zijn volledige toegang tot dithioniet. Voor blaasjes behandeld met> 2 mM DDM, NBD-PC kan symmetrisch gedistribueerd naar beide bladen zodat zodra DDM wordt verwijderd 50% van de NBD-PC wordt beschermd tegen dithioniet.
Figuur 2B toont een soortgelijk destabilisatie reconstitutie-experiment (opnieuw getekend uit referentie 2 </ Sup>), dit keer het bijhouden van de reconstructie van opsin. In dit experiment is te zien dat 7 mM DDM is nodig voor opsin reconstitutie zodat NBD-PC wordt kwantitatief (> 80%) toegankelijk dithioniet als gevolg van opsin gemedieerde scrambling.
Figuur 2:. Reconstitutie van NBD-PC en opsin in detergent gedestabiliseerd vesicles (A) Monsters van de vesicles worden behandeld met diverse concentraties detergent (0-9 mM) door mengen end-over-end voor 3 uur bij kamertemperatuur geroerd . Aan het einde van de incubatieperiode de absorptie van de monsters bij 540 nm gemeten (zwarte lijn). NBD-PC (opgelost in 0,1% w / v DDM) toegevoegd en het monster wordt gedurende nog eens 1 uur bij kamertemperatuur voordat het detergens wordt verwijderd door polystyreenparels behandeling. De verkregen liposomen worden geanalyseerd door de fluor escent reductie assay (rode lijn) naar de mate waarin de NBD-pc is symmetrisch opgelost te bepalen. (B) Zoals in (A), maar in dit experiment vesicles gevormd uit eifosfolipiden (ei PC / ei fosfatidezuur, 9: 1 mol / mol) werden gedestabiliseerd met DDM en opsin werd toegevoegd samen met NBD-PC, resulterend in een fluorescentie vermindering van ongeveer 80% wanneer het eiwit wordt efficiënt opgelost en kunnen vergemakkelijken decoderen van NBD-PC (gemodificeerd uit referentie 2). Hoewel NBD-PC symmetrisch werd opgelost in 2 mM DDM werden de ideale omstandigheden voor reconstitutie opsin gekozen rond de piek van OD 540 absorptie, dat wil zeggen het punt waar de vesicles was sterk gezwollen door geïntercaleerde wasmiddel maar nog niet oplosbaar (aangegeven door de pijl). Voor POPC / POPG (9: 1 mol / mol) vesicles DDM een concentratie van 8 mM werd gevonden optimaal voor zowel NBD-PC en opsin reconstitutie te zijn./54635/54635fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De mate van fluorescentie reductie toeneemt met de hoeveelheid opsin voor reconstitutie. Figuur 3A toont de fluorescentie sporen verkregen over het toevoegen van dithioniet aan NBD-PC-bevattende eiwit-vrij liposomen (zwart trace) en proteoliposomen gereconstitueerd met opsin op verschillende eiwitten aan fosfolipiden ratio's (PPR, in eenheden van mg eiwit per mmol fosfolipiden, rode sporen); de sporen zijn genormaliseerd zodat ze allemaal dezelfde initiële fluorescentie (F i) waarde voor eenvoudiger visualisatie. Monoexponential aanvallen van de sporen te geven zeer vergelijkbaar tijd constanten, variërend 20-25 sec; de bedragen van dithioniet-gemedieerde NBD-PC vermindering eiwitvrije liposomen is hetzelfde als in de proteoliposomen, is het alleen mogelijk een lagere schatting plaats op de snelheid van opsin gemedieerde scrambling (zie text voor meer details). Figuur 3B toont de geanalyseerde gegevens van de fluorescentie assays voor reductie percelen p (≥1) scramblase (de waarschijnlijkheid van een vesicle met ten minste één scramblase) versus de experimenteel gemeten PPR (soortgelijk aan PPR opbrengst * zoals hierboven besproken). Vergelijking van de monoexponential pasvorm van de experimentele resultaten in hypothetische past overeenkomt met Opsin worden opgelost als een monomeer, dimeer of tetrameer blijkt dat opsin reconstitutes functioneel als een dimeer.
Figuur 3:. Scramblase activiteit van opsin (A) Fluorescentie sporen corresponderen met behandeling van blaasjes gereconstitueerd met NBD-PC en opsin hoeveelheden variërend tussen 0-4,95 ug dithioniet, aangegeven door de wig. Het laagste bedrag van opsin opgeloste komt overeen met een PPR van 0,21 mg / mmol, detweede hoogste bedrag tot 0,43 mg / mmol en het hoogste bedrag tot 1,3 mg / mmol, of 10 opsins per blaasjes op het gemiddelde. Dithioniet werd bij de aangegeven tijd (pijl) en NBD fluorescentie werd gevolgd gedurende nog 400 sec. De maximale omvang van de fluorescentie vermindering gezien in dit experiment was 85%, terwijl het gemiddelde over vele experimenten is 82,5%. (B) Protein afhankelijkheid van klauteren. Experimentele gegevens Soortgelijke panel A werden geanalyseerd met Poisson statistiek een grafiek van de waarschijnlijkheid van vesicles met ten minste één scramblase (p ≥1 scramblase) versus het eiwit fosfolipide ratio (PPR) van de vesicles genereren (eiwit werd gekwantificeerd post- reconstitutie door Western blotanalyse 3 en fosfolipide werd bepaald door anorganisch fosfaat vrijgemaakt na zure hydrolyse). De rode lijn staat voor een mono-exponentiële fit voor de data; de gestippelde grijze lijnen stellen mono-exponentieel past voor reconstructie van opsin in nm diameter v 170esicles monomeer, voorgevormde dimeren of voorgevormde tetrameren. Omdat de x-as de experimenteel gemeten PPR (in plaats van PPR * (zie hoofdtekst)), de pasvorm constanten corresponderen met PPR in plaats van PPR * waarden, zoals besproken in de hoofdtekst. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De scramblase activiteit test konden we oorspronkelijk om te bepalen dat opsin heeft fosfolipiden scramblase activiteit 2. De test konden we ook opsin's scramblase activiteit karakteriseren testen specificiteit (we gebruikten verschillende NBD-gelabelde reporter lipiden zoals NBD-fosfatidylethanolamine, gelabeld met NBD op acylketen zoals getoond NBD-PC in figuur 1A, of de kopgroep, NBD-sfingomyeline of NBD- fosfatidylserine 2) het effect van vesicle lipidesamenstelling (bijvoorbeeld cholesterol in verschillende hoeveelheden zoals vesikel bestanddeel), en of de verschillende conformationele toestanden van opsin rhodopsine en vertonen alle scramblase activiteit. Deze analyses bleek dat rhodopsine's scramblase activiteit zeer snel (> 10.000 fosfolipiden per seconde), niet-specifiek voor het fosfolipide en onafhankelijk van conformatietoestand rhodopsine of al dan niet bevat de chromofoor retinale 2,3. Hier,presenteerden we een gedetailleerde methode om proteoliposomen met opsin te genereren en liet zien hoe deze voorbereidingen voor fosfolipiden scramblase activiteit test.
De beschreven reconstitutie protocol is geoptimaliseerd voor de bepaalde lipiden en reconstitueren opsin nadat het werd gezuiverd door affiniteit chromatografie met DDM als solubiliserend detergens. De lipidesamenstelling en het wasmiddel kan worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker, alhoewel het ideale reconstitutie omstandigheden op gewijzigde omstandigheden moeten worden bepaald door het uitvoeren van de "zwellende-experiment" in figuur 2 beschreven. DDM empirisch zeer geschikt voor het handhaven opsin in stabiele en actieve toestand. Maar ook andere detergentia zoals octyl-β-glucoside, CHAPS of Triton X-100 worden gebruikt volgens vergelijkbare protocollen. Triton X-100 is een veel gebruikte wasmiddel voor het reconstrueren van ATP-bindende cassette transporters (ABC transporters) als zijn EFFICIËncy in het mediëren membraan reconstitutie is dan andere detergenten en neemt ook minder tijd in evenwicht te komen met vooraf gevormde liposomen 24.
Het is mogelijk om de oligomere status van de opgeloste functioneel opsin bepalen of de mate van fluorescentie reductie wordt verkregen voor monsters bereid met verschillende hoeveelheden opsin, dat wil zeggen over een bereik van eiwit fosfolipide ratio (prestatierapporten). Om dit te doen, moet de PPR van de gereconstitueerde vesicles expliciet worden gemeten terugwinning van eiwit en fosfolipide kan variëren. Fosfolipide herstel kan worden bepaald door het fosfaat bepaling in paragraaf 1.2 beschreven, terwijl proteïne herstel kan worden geschat door kwantitatieve Western Blot analyse waarin de gezuiverde eiwitten gebruikt voor het opnieuw samenstellen worden gebruikt om een kalibratiecurve die relatie tot het herstel gereconstitueerde monsters over, te genereren de PPR geteste (zoals in detail uitgelegd in verwijzing 3).
De test scramblase activiteit is gebaseerd op de veronderstelling dat dithioniet niet doordringen in de blaasjes. Dit punt kan worden gecontroleerd door een oplosbaar vangen NBD-gelabelde reporter in de vesicles en het bepalen of het kan worden verminderd dithioniet. Daartoe is NBD-glucose (12,6 uM toegevoegd blaasje destabilisatie) gebruikt in plaats van NBD-PC. Deze in water oplosbare molecuul wordt gevangen in de proteoliposomen nadat de blaasjes zijn afgedicht en moet daarom worden beschermd tegen dithioniet. De NBD-glucose volledig toegankelijk voor-reductie, kan Triton X-100 toegevoegd (1% w / v), hetgeen dan resulteert in 100% reductie 3,27.
De proteoliposomen kunnen worden gekarakteriseerd met die reconstitutie controleren van zowel de reporter lipiden en eiwitten symmetrisch. De eerste wordt bereikt door botsingen quenching experimenten met jodide-ionen tijdens de laatste is gebaseerd op de beveiligingsinrichting protease aanpak vanuit AspN protease datsnijdt op een specifieke plaats nabij de C-terminus van opsin 3.
De overgang van de initiële fluorescentie (F i) bepaald in de scramblase activiteitstest om het eindpunt fluorescentie (F) is complex, maar voor onze doeleinden redelijkerwijs kan worden benaderd door een exponentiële vervalfunctie. De tijdconstante geassocieerd met de exponentiële decay (20 sec) is ongeveer gelijk voor inactieve en actieve liposomen, opsin-bevattende proteoliposomen aangeeft dat scrambling voorkomt zo snel of sneller dan de snelheid waarmee de NBD fluorofoor verminderd met dithioniet. Dus de scramblase activiteit test heeft een slechte tijdsresolutie (beperkt door dithioniet reductie chemie), die op dit moment alleen mogelijk maakt indeling van de mutanten in actieve, zeer traag of inactief. Deze classificatie kan worden gezien de calcium-gereguleerde scramblase TMEM16 27: bij hoge Ca2 + niveaus, de fluorescentievervaltijd onthulde een tijdconstante gelijk aan thaniet gezien in eiwitvrije liposomen, wat aangeeft dat de snelheidsbepalende stap is de chemische reductie van de NBD-fluorofoor door dithioniet dan lipiden scrambling. Integendeel, bij lage Ca2 + niveaus de evenwichtstoestand van fluorescerende vermindering werd niet bereikt na 900 sec, waardoor onderscheid tussen twee kinetische elementen waarvan de ene aan de dithioniet vermindering van de buitenste laag en de tragere de belichting innerlijke-leaflet NBD-lipiden naar buiten.
De discrepantie tussen de voorspelde 100% verlies van fluorescentie op dithioniet behandeling van vesicles bereid met hoge PPR (figuur 1C) versus de experimentele werkelijkheid waar het moeilijk overschrijden ~ 85% reductie (figuur 3A) suggereert dat een deel van de vesicles ongevoelig reconstitutie. Deze fractie overeenkomen met die verbinding vroege vesicles bij reconstitutie procedure detergens geadsorbeerd aan polystyreen kralen en zijndus niet meer in staat om eiwitten te ontvangen. Voor de in punt 3 beschreven analyse, we ervan uitgegaan dat deze refractaire populatie komt overeen met een fractie f van het totale blaasjes. Als we aannemen dat de helft van de NBD-PC moleculen (de pool van NBD-PC in de buitenste laag) in het vuurvaste vesicles vindt dithioniet verminderen, dan schatten we f = 2 • (1 - Rmax / 100) of 0,35 wanneer Rmax = 82,5%.
Montage van p (≥1 scramblase) versus PPR * data met een mono-exponentiële vergelijking geeft de pasvorm constante α, waaruit kan worden vastgesteld of opsin reconstitutes functioneel als een monomeer of dimeer of een mengsel van toestanden waaronder hogere orde multimeren . De interpretatie van deze resultaten gecompliceerd als een fractie van opsin moleculen geen scrambling kan functioneren. Hoewel dit onwaarschijnlijk is gezien de omstandigheden waaronder opsin wordt gezuiverd die garanderen dat het behoudt al zijn G-eiwitreceptor activiteiten, een waarde van α overeenkomt met de insertie van functionele dimeren kan ook worden geïnterpreteerd als de functionele inbrengen van monomeren uit een preparaat van opsin waar de helft van de proteïnen inactief als scramblases. Een bijkomend punt van overweging is dat de analyse presenteren wij ervan uit dat de voor reconstructie blaasjes zijn homogeen in grootte. In werkelijkheid is de vesicles een reeks verschillende gekenmerkt door een Gaussische verdeling met een standaardafwijking die overeenkomt met ongeveer een derde van de gemiddelde diameter. Gelukkig is het resultaat van de analyse van p (≥1 scramblase) versus PPR * data niet significant beïnvloed door het bepalen van vesicles heterogeniteit en dus de eenvoudige analyse die we voorgesteld is voldoende om de gegevens te beschrijven.
Een mogelijke beperking van de methoden die we beschreven is dat het arbeidsintensief procedure niet mogelijk high-throughput metingen van een zeer groot aantal monsters eennd dat blaasje heterogeniteit kan de uitlezing verstoren. Het eerste probleem kan worden opgelost met behulp van een microtiterplaat formaat voor de scramblase assay; de tweede zou in de toekomst worden opgelost door enkele blaasje assays met behulp van TIRF microscopie.
De dithioniet assay voor het meten scramblase activiteit kan worden beschouwd als zeer betrouwbaar en robuust eenmaal destabilisatie en reconstitutie procedures worden vastgesteld. Een alternatieve benadering voor transmembraantransport van fosfolipiden, die ook toelaat controle resultaten van de assay dithioniet kwantificeren, is terugextractie kortketenige NBD-lipiden van de buitenste laag van de vesicles gebruik vetzuur-vrij runderserumalbumine 22. Terugextractie en de dithionite assay ook gebruikt te karakteriseren en identificeren flippases van de P4-type ATPasen en ABC transporters 28-33.
Aangezien de instrumenten hier gepresenteerde gemakkelijk kan worden aangepast aan different heeft de beschreven procedures zijn veelzijdig en zal helpen bij het identificeren en karakteriseren van fosfolipiden scramblases in de toekomst. Het leren van de identiteit van veel van deze, met inbegrip van de scramblase voor de uitbreiding van biogene membranen tijdens celgroei van groot fysiologisch belang.
Voor meer informatie en gedetailleerde beschrijving van de data-analyse, wordt verwezen naar eerdere publicaties van onze laboratorium 2-4,27 evenals anderen 22,25,28,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
| 1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
| Dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
| Fluorimeter cuvettes | sigma | C0918-100EA | cuvettes |
| Spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. | fluorimeter | |
| Sodium hydrosulfite technical grade, 85% | Sigma | 157953-5G | dithionite |
| GraphPad Prism 5 software | Prism | ||
| Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
| LIPEX 10 ml extruder | Northern Lipids, Inc. | Extruder | |
| Whatman, Drain disc, PE, 25 mm | Sigma | 28156-243 | Disc support |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110607 | 400 nm membrane |
| Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110606 | 200 nm membrane |
| sodium phosphate | Sigma | S3264-500G | |
| VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm | VWR Scientific | 47729-572 | glass tubes |
| Perchloric acid | Sigma | 30755-500ML | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma | A-7302 | ammonium molybdate |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A7631-25G | sodium ascorbate |
| Bio-Beads SM2 adsorbents | Bio Rad | 1523920 | polystyrene beads |
| 2.0 ml Microtubes clear | VWR Scientific | 10011-742 | Reconstitution tubes |
| Reconstitution glass tube | VWR Scientific | 53283-800 | Reconstitution glass tubes |
| Zetasizer | Malvern | DLS |
References
- Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
- Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
- Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
- Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
- Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
- Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
- Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
- Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
- Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
- Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
- Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
- Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
- Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
- Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
- Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
- Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
- Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
- Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
- Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
- Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
- Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
- Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
- Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
- Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
- Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
- Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
- Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
- Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
- Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).
