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Biochemistry

Un test basé sur la fluorescence de phospholipides scramblase Activité

doi: 10.3791/54635 Published: September 20, 2016

Abstract

Scramblases phospholipides translocation à travers la membrane bicouche bidirectionnellement de façon ATP-indépendant. La première scramblase à identifier et biochimiquement vérifiée a été Opsin le apoprotéine du rhodopsine photorécepteur. Rhodopsine est un récepteur couplé aux protéines G localisée dans les membranes de disque tige photoréceptrices de la rétine, où il est responsable de la perception de la lumière. L'activité de scramblase de rhodopsine ne dépend pas de son ligand 11- cis -retinal, à savoir, l'opsine apoprotéine est également actif en tant que scramblase. Bien phospholipides constitutive et régulée de brouillage jouent un rôle important dans la physiologie cellulaire, seulement quelques scramblases phospholipides ont été identifiés à ce jour plus de opsin. Nous décrivons ici un dosage basé sur la fluorescence de l'activité de scramblase opsine. Opsine est reconstitué dans de grands liposomes unilamellaires composés de phosphatidylcholine, phosphatidylglycérol et une quantité trace de fluorescence NBD-PC marqué (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl) amino] hexanoyl} - sn - glycéro-3-phosphocholine). scramblase activité est déterminée en mesurant la mesure dans laquelle les molécules NBD-PC situé dans le feuillet interne de la vésicule sont en mesure d'accéder au feuillet externe où leur fluorescence est éliminé par voie chimique d'un agent réducteur qui ne peut pas traverser la membrane. Les procédés décrits ici ont une applicabilité générale et peuvent être utilisées pour identifier et caractériser les activités de scramblase d'autres protéines membranaires.

Introduction

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La rhodopsine photorécepteur, un récepteur de protéine G couplée à prototypique ( passage en revue par exemple dans la référence 1), est le premier phospholipide scramblase à identifier et biochimiquement vérifiée 2,3. Scramblases phospholipides sont des transporteurs qui augmentent le taux intrinsèquement lent du mouvement transbilayer phospholipide physiologiquement niveaux appropriés dans une bi - directionnelle, de façon ATP-indépendant 6/4. Des exemples de leurs actions peuvent être trouvées dans le réticulum endoplasmique et de la membrane cytoplasmique bactérienne , où le brouillage constitutif est nécessaire pour l' homéostase de la membrane et la croissance, ainsi que pour une variété de voies de glycosylation 5. Phospholipide régulé embrouillage est nécessaire d'exposer la phosphatidylsérine (PS) à la surface des cellules apoptotiques où il agit comme un «eat-moi» -signal pour les macrophages 7 et fournit une surface procoagulante sur les plaquettes sanguines activées pour catalyser la production de facteur protéiques nécessaire pour la coagulation sanguine. Dans les membranes du disque photoréceptrices, l'activité de brouillage de la rhodopsine a été suggéré pour contrebalancer le déséquilibre phospholipide entre les deux feuillets de la membrane bi - couche qui est générée par l'ATP-dépendante, un lipide unidirectionnel flippase ABCA4 4,8,9 10-12.

En dépit de l'importance physiologique de scramblases, leur identité est restée difficile à atteindre jusqu'à ce que la rhodopsine a été rapportée en tant que scramblase dans les disques photorécepteurs 2, des membres de la famille des protéines TMEM16 ont été identifiés comme Ca2 + scramblases -dépendantes nécessaires pour une exposition de PS à la membrane plasmique (passé en revue dans la référence 13), et la protéine bactérienne FTSW a été proposée comme un lipide II scramblase nécessaire pour la synthèse du peptidoglycane 14. Ces découvertes ont été basés sur la reconstitution de protéines purifiées dans des liposomes et la démonstration de l'activité de scramblase dans les protéoliposomes résultant en utilisant la méthodologie described ici. Autres scramblases potentiels 15-21 - les protéines MurJ et AMJ impliqués dans la biosynthèse de peptidoglycane, WzxE et protéines apparentées impliquées dans le brouillage des précurseurs de O-antigène, la protéine MPRF nécessaire pour la translocation phosphatidylglycérol aminoacyle à travers la membrane cytoplasmique bactérienne, et les membres de la famille Xkr8 qui ont été proposées exposer PS à la surface des cellules apoptotiques - restent à tester biochimiquement. Cela souligne l'importance d'un test robuste pour identifier et caractériser l'activité scramblase.

Ici, nous décrivons la reconstitution de l'opsine purifiée, l'apoprotéine de la rhodopsine photorécepteur, en grandes vésicules unilamellaires (LUV), et l'analyse ultérieure de l'activité de scramblase dans les protéoliposomes résultant en utilisant un dosage basé sur la fluorescence. Il existe plusieurs protocoles bien décrits dans la littérature pour l'expression hétérologue et la purification de l'opsine, donc nous ne serons pasdécrire dans ce protocole; on utilise les protocoles décrits dans Goren et al. , ce qui donne 3 étiquetée FLAG, opsine thermostable à environ 100 ng / ul de 0,1% (p / v) , dodécylmaltoside (DDM).

La reconstitution est obtenue par traitement avec un détergent LUV suffisante pour qu'ils gonflent mais ne se dissolvent pas. Dans ces conditions, une protéine membranaire - fourni sous forme de micelles protéine-détergent - intégrera dans les liposomes et devient reconstituée dans la membrane des liposomes lors de l'élimination de détergent, ce qui entraîne des protéoliposomes. Pour reconstituer opsine (obtenu sous la forme d' une protéine purifiée dans 0,1% (p / v) DDM), LUV sont préparés à partir d' un mélange de POPC (1-palmitoyl-2-oléoyl - sn - glycéro-3-phosphocholine) et le POPG (1- palmitoyl-2-oléoyl sn - glycéro-3- [phospho-rac- (1-glycérol)]) et saturé avec DDM avant d' ajouter opsin et NBD-PC. Le détergent est ensuite éliminé par traitement de l'échantillon avec des billes de polystyrène.

lass = "jove_content"> Le principe de l'essai à base de fluorescence est représentée sur la figure 1B. LUV sont symétriquement reconstitués avec une trace de NBD-PC ou un autre journaliste de phospholipides fluorescent NBD marqué (figure 1A). Par addition de dithionite, un non-fluorescente à la membrane impermeant dianion, les molécules NBD-PC dans le feuillet externe des GVU sont rendus en tant que groupe nitro du NBD est réduite à un groupe amino non fluorescent. Étant donné que ni les molécules NBD-PC ni dithionite sont capables de traverser la membrane sur l'échelle de temps de l'expérience (<10 min), il en résulte 50 une réduction du signal fluorescent%. Cependant, si les liposomes sont reconstituées avec une scramblase, les molécules NBD-PC dans le feuillet interne peut mélanger rapidement vers l'extérieur où ils sont réduits. Cela se traduit par la perte totale de la fluorescence dans le cas idéal (figure 1C).

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. Figure 1: Représentation schématique de l'essai d'activité scramblase L'essai utilise un marqueur fluorescent rapporteur lipide NBD-marqué; NBD-PC est disponible (A). De grosses vésicules unilamellaires sont reconstituées avec une quantité trace de NBD-PC. Reconstitution produit des vésicules symétriques, avec NBD-PC répartis également dans les dépliants extérieurs et intérieurs. Dithionite (S 2 O 4 2-) réduit chimiquement le groupe nitro du NBD à un groupe amino non fluorescent. Traitement des liposomes sans protéines avec du dithionite (B, en haut) provoque une réduction de la fluorescence de 50% depuis que les molécules NBD-PC dans le feuillet externe sont réduits: dithionite est chargé négativement et ne peut pas traverser la membrane pour réagir avec des molécules NBD-PC dans le feuillet interne. Traitement dithionite de protéoliposomes contenant opsin-(B, bas), à savoir, protéoliposomes de scramblase-actif, entraîne la perte de f 100%luorescence comme opsin facilite le mouvement de NBD-PC entre l'intérieur et l'feuillet externe. (C) montre des traces de fluorescence idéalisées obtenus sur le traitement des liposomes dépourvus de protéine et protéoliposomes contenant opsin-dithionite. Le taux de perte de fluorescence est le même dans les deux cas, ce qui indique que la réduction chimique du NBD par le dithionite est le taux limitatif, et que le brouillage se produit à une vitesse égale ou supérieure à la vitesse de la réaction chimique. Des traces obtenues à partir d' une expérience réelle sont présentés dans la figure 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les procédés que nous décrivons peuvent être utilisées pour reconstituer et doser d' autres protéines purifiées, ainsi que des mélanges de protéines membranaires obtenues, par exemple, par extraction avec un détergent 22 microsomes.

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Protocol

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1. Préparation de liposomes et protéoliposomes

  1. liposome Formation
    1. En utilisant une seringue en verre, ajouter 1,435 ul POPC (25 mg / ml dans du chloroforme) et 160 ul POPG (25 mg / ml dans du chloroforme) dans un ballon à fond rond pour obtenir 52,5 pmol de lipides dans un rapport molaire de POPC: POPG = 9: 1.
    2. Sécher les lipides pendant 30 minutes en utilisant un évaporateur rotatif à une vitesse de rotation de 145 tours par minute (pas de bain d'eau est nécessaire pour ce volume de solvant), puis transférer le ballon dans un dessicateur sous vide pendant au moins 3 heures, ou pendant une nuit, à la température ambiante (RT).
    3. Hydrater le film lipidique séché avec 10 ml d'HEPES 50 mM pH 7,4, 100 mM de NaCl (ci-après dénommé tampon A), en remuant doucement le ballon jusqu'à ce qu'une homogénéité, les résultats de suspension turbide;
      NOTE: La concentration des lipides à ce stade devrait être 5,25 mM comme aucune perte auraient eu lieu jusqu'à présent.
    4. Sonication de la suspension dans un bain d'eau pendant 10 min à température ambiante avec une fréquence of 40 kHz. La solution se penchera un peu plus claire.
    5. À l'aide d'une extrudeuse, faire passer la suspension 10 fois à travers une membrane ayant une taille de pores de 400 nm, suivi d'un deuxième cycle d'extrusion avec 4 passages à travers une membrane ayant une taille de pores de 200 nm.
      REMARQUE: Le diamètre moyen des LUV résultant est d'environ 175 nm. Si nécessaire, la taille et l'homogénéité des GVU peuvent être contrôlées par diffusion dynamique de lumière en suivant les instructions du fabricant.
    6. Quantifier la concentration en phospholipides de la suspension de LUV comme décrit dans la section 1.2).
      NOTE: En raison des pertes au cours de l'extrusion, la concentration est généralement autour de 3,6 mM.
    7. Stocker les LUV à 4 ° C pendant environ 2 semaines si non utilisé immédiatement.
  2. Quantification phospholipides
    Remarque: pour déterminer la concentration en phospholipides de la suspension LUV utilisée pour la reconstitution, ainsi que celle des protéoliposomes qui sont éventuellement produites, une aliquote de l'échantillon est SUBJECTED à l'oxydation par l'acide perchlorique. Cette procédure se décompose phospholipides pour libérer le phosphate inorganique qui est ensuite quantifié par un essai colorimétrique en comparaison avec les normes 23.
    1. Préparer une solution à 40 mM stock de phosphate de sodium (Na 2 HPO 4) dans de l' eau distillée désionisée.
    2. Diluer la solution mère avec de l'eau distillée désionisée pour obtenir 4 mM et 0,4 mM des solutions qui serviront de normes d'étalonnage de travail.
    3. En utilisant les solutions de travail, préparer des étalons dans des tubes de 13 x 100 mm 2 en verre allant de 0 à 80 nmol de phosphate de sodium dans un volume final de 50 ul.
    4. Prendre 10 pl chacun des échantillons LUV et protéoliposomes à quantifier et diluer avec 40 pl de ddH 2 O dans 13 tubes x 100 mm 2 de verre.
      NOTE: Comme la concentration en lipides des LUV et protéoliposomes est dans la gamme 2,5-5 uM, les 10 ul de l'échantillon doit contenir 25-50 nmol lipide phosphore.
    5. Ajouter de l'acide 300 ul perchlorique à chacune des normes et des échantillons et de la chaleur pendant 1 heure à 145 ° C dans un bloc de chauffage. Mettez billes sur les tubes pour éviter l'évaporation.
    6. Laissez les tubes refroidir à la température ambiante et ajouter 1 ml de ddH 2 O.
    7. Ajouter 400 pi chacun fraîchement préparé 12 g / L molybdate d'ammonium et 50 g / L ascorbate de sodium et vortex pour mélanger.
    8. Chauffer pendant 10 min à 100 ° C avec des billes sur le dessus des tubes. Retirer les tubes du bloc de chauffage et laisser refroidir à température ambiante.
    9. Mesurer l'absorbance des échantillons par rapport à l'ébauche (échantillon standard contenant du phosphate de sodium 0 nmol) avec un spectromètre à une longueur d'onde de 797 nm.
    10. Déterminer la teneur en phosphate d'échantillons sur la courbe étalon.
  3. Reconstitution de Opsin
    NOTE: Il est nécessaire de déterminer les conditions optimales de gonflement pour la reconstitution que ceux-ci dépendent de la nature du détergent, ainsique la composition lipidique et la concentration des LUV. Comme LUV changent leurs propriétés de diffusion de la lumière sur le processus de gonflement peut être contrôlée en mesurant l' absorbance (Figure 2) tel que révisé par Rigaud et Levy 24 et Geertsma et al. 25.
    1. Pipette 800 pi de LUV (de la section 1.1, que la récupération des lipides après extrusion est de 70%, la concentration attendue de LUV est mM de phospholipides 3.6) dans un tube de 2 ml de microcentrifugation.
    2. Ajouter 5,3 ul de tampon A et de 34,7 ul de 10% (p / v) dissous dans du DCM tampon A.
    3. Incuber pendant 3 heures à la température ambiante avec un mélange de bout sur bout.
    4. Pendant ce temps préparer les perles de polystyrène:
      1. Utilisez 400 mg de perles par échantillon et peser dans un récipient en verre.
      2. Lavez-les deux fois avec du méthanol, trois fois avec de l'eau et une fois avec le tampon A. Pour chaque utilisation de l'étape de lavage 5 ml de liquide et remuer lentement pendant 10 min.
        NOTE: Il est recommandé de préparer le polystyrèneperles pour plusieurs échantillons à la fois, par exemple, peser 6 g de perles et on lave avec 75 ml de liquide. des perles en excès peuvent être stockés dans un réfrigérateur pendant plusieurs jours.
    5. Pendant les 30 dernières minutes de la vésicule déstabilisation sécher le phospholipide NBD marqué dans un tube à bouchon vissé en verre ( «reconstitution tube de verre»): Par exemple, 9,5 pi de NBD-PC (1 mg / ml dans le chloroforme, ce qui donne 0,4 mol% des phospholipides totaux) sont séchés sous un courant d'azote dans un tube en verre et ensuite dissous dans 45 ul de 0,1% (p / v) de DCM dans le tampon A.
    6. Au bout de 3 h de déstabilisation vésiculaire ajouter le phospholipide dissous NBD marqué, la protéine DDM-solubilisé et le tampon A de telle sorte que le volume final de 1 ml contient 0,36% (p / v), soit 7 mM, du DCM.
      1. Ainsi, pour produire des liposomes exempts de protéines (utilisé comme échantillon témoin) ajouter 45 pi de NBD-PC (dissous dans 0,1% de DCM), 60 ul de 0,1% de DCM et 55 pi de tampon A; pour protéoliposomes ajouter, pour examenple, 40 pl de protéine (à partir d'une solution mère typique de ~ 110 ng / pl) à 0,1% DCM, 45 ul de NBD-PC (dissous dans 0,1% de DCM), 20 ul de 0,1% de DCM et 55 pi de tampon A .
        NOTE: L'ordre d'addition doit être comme indiqué.
    7. Mélanger l'échantillon à une extrémité d'une heure supplémentaire par rapport à la fin à la température ambiante.
    8. Ajouter 80 mg de billes de polystyrène préparées et incuber l'échantillon avec de bout en bout sur le mélange pendant 1 heure à température ambiante.
    9. Ajouter ensuite 160 mg d'un supplément de perles de polystyrène et on incube avec l'extrémité sur l'autre extrémité le mélange pendant encore 2 heures à température ambiante.
    10. Transférer l'échantillon (en laissant les billes de polystyrène passées derrière) à un tube de verre à bouchon à vis contenant 160 mg de perles de polystyrène frais et mélanger pendant une nuit à 4 ° C.
      NOTE: Le moyen le plus simple pour transférer l'échantillon et éviter d'aspirer des billes est d'utiliser une pipette Pasteur qui est poussé vers le bas du tube de verre, avec une petite pression positive. Une fois que la pointe de la pipette est fermement aufond du tube, l'échantillon peut être retiré facilement sans interférence des perles.
    11. Le lendemain matin, transférer l'échantillon à un tube de micro sans porter sur des billes et placer sur la glace en préparation pour le dosage de l'activité scramblase.

2. scramblase Essai d'activité

NOTE: L'intensité de fluorescence des liposomes ou des protéoliposomes dilués avec le tampon A est surveillé au fil du temps après l'addition de dithionite dans un spectromètre à fluorescence. Pour obtenir une intensité stable de départ, la fluorescence est enregistrée pendant au moins 50 secondes (ou jusqu'à ce qu'un signal stable est atteint) avant d'ajouter dithionite à un échantillon constamment agité et est ensuite suivie pendant au moins 500 secondes après l'ajout de dithionite.

  1. Ajouter 1,950 ul de tampon A à une cuvette en plastique contenant une barre d'agitation Mini.
  2. Ajouter 50 ul du proteo préparé (liposomes) et de laisser l'échantillon équilibrer dans le spectro de fluorescencemètre sous agitation constante pendant plusieurs secondes.
  3. Pendant ce temps , préparer une solution de 1 M dithionite dans 0,5 M tamponnée Tris (par exemple, pour deux échantillons peser 20 mg de dithionite dans un tube de microcentrifugation et se dissolvent dans 114 ul glacée 0,5 M Tris directement avant l' utilisation et garder sur la glace pour la prochaine échantillon).
    NOTE: La solution dithionite doit être fraîchement préparée et ne doit pas être utilisé plus de 20 minutes après la préparation; si plusieurs mesures sont à effectuer, des aliquotes de dithionite peuvent être pesés à l'avance et dissous juste avant utilisation.
  4. Démarrer le suivi de fluorescence (excitation 470 nm, émission 530 nm, largeur de fente de 0,5 nm).
  5. Ajouter 40 ul de la solution de dithionite de 1 M à la cuvette 50 secondes après le début de l'enregistrement de la fluorescence (en utilisant la cloison dans le couvercle de la chambre de la cuvette, si possible), et continuer à enregistrer la fluorescence pendant encore 400-600 sec.
  6. Analyser les données comme décrit dans la section 3.

3.L'analyse des données

  1. Cinétique de Scrambling
    1. Caractériser la trace de fluorescence de chaque échantillon obtenu par le dosage de l' activité scramblase en définissant la fluorescence initiale, F i, avant l'addition de dithionite et la fluorescence du point final F, atteint au bout de > 400 s. F i est déterminé pour chaque échantillon que la valeur moyenne de la fluorescence pour la période de 30 secondes avant l'addition de dithionite.
    2. Déterminer les données de point final correspondant à l'ampleur de la réduction de la fluorescence, R = 100 • F / F i. Nous utilisons les termes R L pour les liposomes sans protéines et R P pour protéoliposomes contenant opsin.
  2. La détermination du poids moléculaire du Fonctionnellement Reconstituée scramblase
    1. Convertir les données de réduction de la fluorescence en fonction de l'équation suivante:
      p (≥1 scramblase) = (R p - R L) / (R max - R L) (équation 1)
      REMARQUE: Où R max est la réduction maximale qui est obtenue lorsque suffisamment de protéine est reconstituée telle que toutes les vésicules dans l'échantillon possèdent au moins une scramblase fonctionnelle, et p est la probabilité qu'une vésicule particulière dans un échantillon reconstitué est «scramblase actif», à savoir, elle possède au moins une scramblase fonctionnelle. La valeur de R L est typiquement de 3 à 45% tandis que R max est typiquement 82,5% 3, au lieu de 100% attendus (R peuvent être déterminées expérimentalement pour protéoliposomes opsin avec un PPR> 1 mg / mmol max). En tant que R max <100% , il est supposé qu'une sous-population de vésicules est réfractaire à la reconstitution. Pour R max = 82,5%, la fraction de vésicules qui est incapable d'accepter la protéine est de 0,35.
    2. Décrire la relation entre p (≥1 scramblase) et PPR (mg de protéine / mmol phospholipides) par les statistiques de Poisson comme suit:
      p (≥1 scramblase) = 1 - e NOTE: Où m = nombre de scramblases par vésiculaire et α = mono-exponentielle constante ajustement en unités de mg de protéine / mmol de phospholipides.
    3. En une fraction des vésicules ne contribue pas à brouiller même à haute PPR (voir la discussion), de modifier l'équation:
      p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Equation 3)
      NOTE: Lorsque PPR * = PPR / (1- f),f est la population réfractaire de vésicules ou, dans ce cas, PPR * = PPR / 0,65 (équation 4).
      REMARQUE: La constante α ajustement est déterminée en ajustant une courbe de p (≥1 scramblase) par rapport à la PPR * avec une fonction mono-exponentielle. Si opsin (poids moléculaire de 41,7 kDa) recompose fonctionnellement dans des vésicules de 175 nm de diamètre (chaque vésicule a 280.000 phospholipides 26) en tant que monomère, alpha = 0,187 mg mmol -1. Si opsin dimérise avant la reconstitution 3 pour produire des vésicules scramblase-actif, α= 0,37 mg mmol -1. Si PPR plutôt que PPR * devaient être utilisés pour l'analyse, les valeurs alpha correspondantes seraient 0,122 et 0,244 mg mmol -1. Ces valeurs prédites pour α supposent que toutes les molécules opsin sont fonctionnellement compétent. Si seulement une fraction des molécules est compétente pour brouiller les lipides, les valeurs correspondantes de α sera plus grande.

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Representative Results

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Nous décrivons la reconstitution de opsin en LUV pour caractériser son activité scramblase en utilisant un test basé sur la fluorescence. Nous analysons les résultats pour placer une limite inférieure du taux de phospholipides opsin médiation de brouillage et de déterminer l'état oligomérique dans lequel opsin reconstitue fonctionnellement dans les vésicules.

Pour déterminer les conditions optimales de reconstitution, il est nécessaire de déterminer de façon empirique la quantité de détergent qui doit être utilisé pour gonfler les LUV pour qu'ils soient réceptifs à l'insertion de la protéine. Une telle expérience est illustrée sur la figure 2A. Aliquotes de POPC: LUV POPG sont traités avec des quantités différentes de DDM pendant 3 heures et l'absorbance de l'échantillon est mesurée à 540 nm, une mesure de la turbidité et donc de la taille des vésicules. La densité optique mesurée à 540 nm (DO 540) graphique montre que les vésicules gonflent comme DDM concentrtion est augmentée de 4-6 mm, d' atteindre un point situé à environ 7 mM de saturation avant de commencer à solubiliser ( ce qui correspond à une perte de turbidité et de DO540 de signal) comme DDM est encore augmentée. NBD-PC est ajouté après le traitement au détergent et les échantillons sont mis en incubation pendant encore une heure avant d'être traité avec des billes de polystyrène pour éliminer le détergent. La distribution de transbilayer de NBD-PC est déterminée en mesurant la perte de fluorescence après l'addition de dithionite aux vésicules (comme décrit ci-dessus). Ainsi, NBD-PC insère dans le feuillet externe des vésicules en l'absence de détergent indiquée par son accessibilité complète dithionite. Pour les vésicules traitées avec> 2 mM DDM NBD-PC est capable de distribuer de manière symétrique dans les deux feuillets de façon que, une fois DDM éliminé 50% du NBD-PC est protégé contre la dithionite.

La figure 2B montre une expérience de déstabilisation-reconstitution similaire (redessinées de la référence 2 </ Sup>), suivi de la reconstitution de opsin cette fois. Dans cette expérience, on peut voir que mM DDM 7 est nécessaire pour la reconstitution opsine de telle sorte que NBD-PC devient quantitative (> 80%) accessible à dithionite à la suite de l'opsine à médiation par le brouillage.

Figure 2
Figure 2:. Reconstitution du NBD-PC et opsine dans des vésicules de détergent déstabilisé (A) Des aliquotes des vésicules sont traitées avec une plage de concentrations de détergent (0-9 mM) en mélangeant extrémité sur l'autre extrémité pendant 3 heures à la température ambiante , . A la fin de la période d'incubation, l'absorption des échantillons à 540 nm est mesurée (ligne noire). NBD-PC (dissous dans 0,1% p / v DDM) est ensuite ajouté et l'échantillon est mis à incuber pendant 1 heure à la température ambiante avant que le détergent est éliminé par traitement des billes de polystyrène. Les liposomes résultants sont analysés par le fluorophore essai de réduction de Escent (ligne rouge) afin de déterminer la mesure dans laquelle NBD-PC est reconstitué de façon symétrique. (B) dans (A) , mais dans cette expérience vésicules formées à partir de phospholipides d'œuf (PC d' œuf / acide phosphatidique d'oeuf, 9: 1 mol / mol) ont été déstabilisé par DCM et opsine a été ajouté conjointement avec NBD-PC, ce qui a la réduction de la fluorescence d'environ 80% une fois que la protéine est reconstituée et efficace capable de faciliter le brouillage de NBD-PC (modifié à partir de la référence 2). Bien que NBD-PC a été symétriquement reconstitué à 2 mM DDM, les conditions idéales pour la reconstitution opsin ont été choisis autour du pic de la DO 540 absorbance, à savoir, le point où les vésicules étaient fortement gonflé en raison de détergent intercalés , mais pas encore solubilisé (indiqué par la flèche). Pour les POPC / POPG (9: 1 mol / mol) des vésicules, une concentration de 8 mM de DCM a été jugée optimale pour les deux NBD-PC et opsine reconstitution./54635/54635fig2large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L'étendue de la réduction de la fluorescence augmente avec la quantité d'opsine utilisée pour la reconstitution. La figure 3A montre des traces de fluorescence obtenues sur l' ajout de dithionite à NBD-PC-liposomes contenant sans protéines (trace noire) et protéoliposomes reconstituées avec opsin à la protéine différents rapports phospholipides (PPR, en unités de mg de protéine par mmol phospholipides, des traces rouges); les traces ont été normalisées de sorte qu'ils ont tous la même fluorescence initiale (F i) de la valeur pour faciliter la visualisation. fits monoexponentielle des traces indiquent des constantes de temps très similaires, allant de 20 à 25 sec; le taux de réduction NBD-PC dithionite médiation dans des liposomes dépourvus de protéine est la même que dans les protéoliposomes, il est seulement possible de placer une estimation plus faible sur le taux d'opsine à médiation par brouillage (voir text pour plus de détails). La figure 3B montre les données analysées obtenues à partir des essais de réduction de la fluorescence produisent des tracés de p (≥1) scramblase (la probabilité d'une vésicule ayant au moins une scramblase) par rapport à la peste des petits ruminants mesurée expérimentalement ( par rapport à la PPR * comme discuté ci-dessus). Comparaison de l'ajustement monoexponentielle des résultats expérimentaux dans des crises hypothétiques correspondant à Opsin être reconstitué comme monomère, dimère ou tétramère montrent que opsin recompose fonctionnellement comme un dimère.

Figure 3
Figure 3:. Activité scramblase de opsin traces (A) de fluorescence correspondant à dithionite traitement des vésicules reconstituées avec NBD-PC et opsin des quantités comprises entre 0 à 4,95 ug, indiqué par le coin. Le montant le plus bas de opsin reconstitué correspond à une PPR de 0,21 mg / mmol ladeuxième montant le plus élevé à 0,43 mg / mmol et le montant le plus élevé à 1,3 mg / mmol, ou 10 opsins par vésiculaire en moyenne. Dithionite a été ajouté à l'époque (flèche) indiquée et NBD fluorescence a été contrôlée pendant encore 400 sec. L'étendue maximale de la réduction de la fluorescence vu dans cette expérience était de 85%, alors que la moyenne sur plusieurs expériences est de 82,5%. (B) la dépendance protéique de brouillage. Les données provenant des expériences similaires à la partie A ont été analysées en utilisant les statistiques de Poisson pour générer un graphique de la probabilité de vésicules ayant au moins une scramblase (p scramblase ≥1) par rapport à la protéine de phospholipide (PPR) des vésicules (protéine a été quantifiée post- la reconstitution par l' analyse Western Blot 3 et phospholipide est déterminé en mesurant le phosphate inorganique libéré lors de l' hydrolyse acide). La ligne rouge représente un ajustement de mono-exponentielle pour les données; les lignes grises pointillées représentent mono-exponentielle unique pour la reconstitution de opsin en 170 nm de diamètre vesicles que des monomères, dimères pré-formés ou tétramères préformé. Comme l'axe des abscisses représente la PPR mesurée expérimentalement (plutôt que PPR * (voir texte principal)), les constantes d' ajustement correspondent à PPR plutôt que PPR * valeurs, comme indiqué dans le texte principal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande cette figure.

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Discussion

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Le dosage de l' activité de l' origine scramblase nous a permis de déterminer que l' opsine a phospholipide scramblase activité 2. L'essai a également permis de caractériser l'activité scramblase de l' opsine en testant la spécificité (nous avons utilisé une variété de lipides rapporteurs NBD marqués tels que le NBD-phosphatidyléthanolamine marquée avec NBD sur une chaîne acyle comme représenté par NBD-PC sur la figure 1A ou sur la groupe de tête, NBD-sphingomyéline ou NBD- phosphatidylsérine 2), l'effet de la composition lipidique des vésicules (par exemple, le taux de cholestérol à différentes quantités comme constituant vésiculaire), et si les différents états conformationnels de opsin et rhodopsine toute l'activité de pièce. Ces analyses ont révélé que l'activité de scramblase de rhodopsine est très rapide (> 10.000 phospholipides par seconde), non spécifique pour le phospholipide et indépendant de l' état ​​conformationnel de la rhodopsine ou si elle contient son chromophore rétinienne 2,3 ou non. Ici,nous avons présenté une méthode détaillée pour générer protéoliposomes contenant opsin et montré comment doser ces préparations pour l'activité de scramblase phospholipides.

Le protocole de reconstitution décrite est optimisée pour la composition lipidique donnée et pour reconstituer opsine après qu'il a été purifié par Chromatographie d'affinité en utilisant comme solubilisant DDM détergent. La composition lipidique ainsi que le détergent peut être modifiée en fonction des besoins de l'expérimentateur, bien que les conditions de reconstitution idéales pour les conditions modifiées doivent être déterminées en effectuant le "gonflement à l' expérience" décrite dans la figure 2. DDM est empirique bien adapté pour le maintien de l'opsine dans un état stable et actif. Cependant, d'autres détergents tels que octyl-β-glucoside, le CHAPS ou le Triton X-100 peuvent être utilisés selon des protocoles similaires. Triton X-100 est un détergent largement utilisé pour la reconstitution de liaison ATP des transporteurs de cassette (transporteurs ABC) comme véhicuncy dans la médiation de la reconstitution de la membrane est supérieure à celle d'autres détergents et il prend également moins de temps pour équilibrer avec des liposomes préformés 24.

Il est possible de déterminer l'état oligomérique de l'opsine fonctionnellement reconstituée si l'ampleur de la réduction de fluorescence est obtenue pour des échantillons reconstitués avec différentes quantités d'opsine, à savoir, sur une large gamme de protéines à des taux de phospholipides (RRP). Pour ce faire, le PPR des vésicules reconstituées doit être explicitement mesurée comme la récupération des protéines et phospholipides peut varier. la récupération phospholipide peut être déterminé par le dosage du phosphate décrit dans la section 1.2, tandis que la récupération des protéines peut être estimée par une analyse quantitative de Western Blot, dans lequel les protéines purifiées utilisées pour la reconstitution sont utilisées pour générer une courbe d'étalonnage qui permet la comparaison de la récupération des échantillons reconstitués à travers la gamme PPR testé (comme expliqué en détail en référence 3).

Le dosage de l'activité de scramblase repose sur l'hypothèse selon laquelle dithionite ne pas pénétrer dans les vésicules. Ce point peut être vérifié en piégeant un journaliste de NBD marqué soluble dans les vésicules et de déterminer si elle peut être réduite par dithionite. A cet effet, NBD-glucose (12,6 pM ajoutés après déstabilisation vésiculaire) est utilisé à la place du NBD-PC. Cette molécule soluble dans l'eau est emprisonnée dans les protéoliposomes une fois que les vésicules sont scellés et doivent donc être protégés de dithionite. Pour rendre le NBD-glucose totalement accessible pour la réduction, le Triton X-100 peuvent être ajoutés (1% p / v) , ce qui se traduit alors par une réduction de 100% 3,27.

Les protéoliposomes peuvent être caractérisés pour vérifier que la reconstitution à la fois des lipides et de la protéine rapporteur est symétrique. Le premier est réalisé par des expériences de trempe collisionnels en utilisant des ions iodure tandis que le second est basé sur une stratégie de protection de la protéase en utilisant AspN protéasecoupe à un site spécifique à proximité de l'extrémité C-terminale de opsin 3.

La transition de la fluorescence initiale (F i) déterminé dans l'activité de scramblase test à la fluorescence point final (F) est complexe, mais pour nos besoins , il peut être raisonnablement approchée par une fonction exponentielle unique de décroissance. La constante de temps associée à la décroissance exponentielle (20 sec) est à peu près la même pour les liposomes inactifs et, protéoliposomes contenant opsin actifs indiquant que le brouillage se produit aussi vite ou plus vite que la vitesse à laquelle le fluorophore NBD est réduite de dithionite. Ainsi, le dosage de l'activité scramblase a une résolution de temps pauvre (limité par dithionite chimie de réduction) qui, actuellement, ne permet la classification des mutants en actif, très lent ou inactif. Cette classification pourrait être vu pour la scramblase de calcium régulé TMEM16 27: à haute Ca 2+ niveaux, la décroissance de la fluorescence a révélé une constante de temps similaire à that vu dans des liposomes exempts de protéines, ce qui indique que l'étape limitante est la réduction chimique du fluorophore NBD par le dithionite de lipide embrouillage. Au contraire, à de faibles niveaux de Ca2 + l'état stationnaire de la réduction de fluorescence n'a pas été atteinte au bout de 900 secondes, ce qui permet de faire la distinction entre les deux composantes cinétiques, une attribué à la réduction de dithionite du feuillet extérieur et le plus lent à l'exposition de NBD-lipides internes-dépliant à l'extérieur.

L'écart entre la prédite perte de fluorescence de 100% sur le dithionite traitement des vésicules préparées avec une haute PPR (figure 1C) par rapport à la réalité expérimentale où il est difficile de dépasser ~ 85% de réduction (figure 3A) indique qu'une fraction des vésicules est réfractaire la reconstitution. Cette fraction peut correspondre à des vésicules qui joint au début de la procédure de reconstitution en tant que détergent est adsorbé sur des billes de polystyrène et sontdonc plus capable de recevoir la protéine. Pour l'analyse décrite dans la section 3, nous avons supposé que cette population réfractaire correspond à une fraction f du total des vésicules. Si nous supposons que la moitié des molécules NBD-PC (le pool d'NBD-PC dans le feuillet externe) dans les vésicules réfractaires est disponible pour le dithionite de réduction, nous estimons f = 2 • (1 - R max / 100), ou 0,35 lorsque R max = 82,5%.

Culot de p (≥1 scramblase) par rapport à la PPR * des données avec une équation monoexponentielle fournit l'α constante en forme, à partir duquel il est possible de déterminer si l'opsine reconstitue fonctionnellement comme un monomère ou un dimère ou un mélange d'états, y compris multimères d'ordre supérieur . L'interprétation de ces résultats se complique si une fraction de molécules opsin ne peut pas fonctionner dans le brouillage. Bien que cela est peu probable étant donné les conditions dans lesquelles opsin est purifié qui garantissent qu'il conserve toutes ses protéines Gactivités du récepteur, une valeur de α correspondant à l'insertion fonctionnelle de dimères peuvent également être interprétés comme l'insertion fonctionnelle de monomères à partir d'une préparation d'opsine où la moitié des protéines sont inactifs en tant scramblases. Un autre point à considérer est que l'analyse que nous présentons suppose que les vésicules utilisées pour la reconstitution sont homogènes en taille. En réalité, les vésicules ont une gamme de diamètres, caractérisé par une distribution gaussienne avec un écart-type correspondant à environ un tiers du diamètre moyen. Heureusement, le résultat de l'analyse de p (≥1 scramblase) par rapport aux données PPR * est pas significativement affectée par l'examen de la vésicule hétérogénéité et donc la simple analyse que nous avons présenté est suffisant pour décrire les données.

Une limitation potentielle des méthodes que nous avons décrit est que la procédure de travail intensif ne permet pas de mesures à haut débit d'un très grand nombre d'échantillons d'unnd que vésiculaire hétérogénéité pourrait perturber la lecture. Le premier problème peut être surmonté en utilisant un format de plaque de microtitrage pour le dosage de scramblase; le second pourrait être résolu à l'avenir par des essais vésiculaires simples en utilisant la microscopie TIRF.

Le dosage de dithionite pour mesurer l'activité scramblase peut être considéré comme très fiable et robuste, une fois les procédures de déstabilisation et de reconstitution sont établies. Une autre approche pour quantifier le transport transmembranaire de phospholipides, qui permet également de vérifier les résultats obtenus à partir de l'essai de dithionite, est de retour d'extraction de chaîne courte NBD-lipides du feuillet externe des vésicules en utilisant gras bovine sans acide sérum albumine 22. Réextraction, ainsi que le dosage de dithionite ont également été utilisées pour caractériser et identifier flippases des ATPases de type P4 et des transporteurs ABC 28-33.

Comme les outils présentés ici peuvent facilement être adaptés en fonction différent besoin les procédures décrites sont polyvalents et vous aideront à identifier et à caractériser scramblases phospholipides dans l'avenir. Apprendre l'identité d'un grand nombre d'entre eux, y compris celle de la scramblase nécessaire à l'expansion des membranes biogènes pendant la croissance cellulaire est d'une importance physiologique extrême.

Pour plus d' informations et une description détaillée de l' analyse des données, le lecteur se reportera aux publications antérieures de notre laboratoire 2-4,27 ainsi que d' autres 22,25,28,30.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 ml extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 ml Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

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References

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Un test basé sur la fluorescence de phospholipides scramblase Activité
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Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).More

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

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