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Biochemistry

Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

doi: 10.3791/54635 Published: September 20, 2016

Abstract

Scramblases transloziert Phospholipiden durch die Membran-Doppelschicht in zwei Richtungen in einer ATP-unabhängige Art und Weise. Die erste scramblase werden identifiziert und biochemisch wurde Opsin prüft, das Apoprotein des Photorezeptors Rhodopsin. Rhodopsin ist ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor in Stabphotorezeptor Scheibenmembranen der Retina lokalisiert, wo es für die Wahrnehmung von Licht verantwortlich ist. Rhodopsin der Scramblase Aktivität nicht auf seinem Liganden abhängt 11- cis - Retinal, das heißt, das Apoprotein Opsin ist auch aktiv als Scramblase. Obwohl die konstitutive und reguliert Scrambling Phospholipid eine wichtige Rolle in der Zellphysiologie zu spielen, nur wenige Phospholipid scramblases wurden bisher neben Opsin identifiziert. Hier beschreiben wir ein Fluoreszenz-basierten Assay von Scramblase Aktivität des Opsin. Opsin rekonstituiert in große unilamellare Liposomen aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerin und eine Spurenmenge an fluoreszierenden NBD-markierten PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl} - sn - glycero-3-phosphocholin). Scramblase Aktivität wird durch Messen der Größe der auf dem NBD-PC-Moleküle in dem inneren Blatt des Vesikels befindet sind in der Lage die äußere Faltblatt zuzugreifen, wo ihre Fluoreszenz chemisch durch ein Reduktionsmittel eliminiert wird, die die Membran nicht passieren kann. Die Methoden, die wir haben eine allgemeine Anwendbarkeit beschreiben und kann verwendet werden, Scramblase Aktivitäten anderer Membranproteine ​​zu identifizieren und zu charakterisieren.

Introduction

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Der Photorezeptor Rhodopsin, eine prototypische G - Protein-gekoppelten Rezeptor (beispielsweise in Bezug Bewertung 1) ist das erste Phospholipid scramblase werden identifiziert und biochemisch verifiziert 2,3. Scramblases sind Phospholipid - Transporter, die die eigen langsamen Geschwindigkeit von Transdoppel Phospholipid Bewegung physiologisch geeigneten Ebenen in einem bidirektionalen, ATP-unabhängige Weise 4-6 erhöhen. Beispiele für ihre Aktionen können im endoplasmatischen Retikulum und bakterielle Cytoplasmamembran zu finden, wo die konstitutive Scrambling für Membran - Homöostase und Wachstum notwendig ist, aber auch für eine Vielzahl von Glycosylierungswege 5. Reguliert Phospholipid Verwürfelung benötigt Phosphatidylserin (PS) auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen zu belichten , wo es als ein "eat-me" -Signal für Makrophagen 7 und stellt eine prokoagulierende Oberfläche auf aktivierten Blutplättchen die Bildung von Proteinfaktor zu katalysierens für die Blutgerinnung benötigt. In Photorezeptorscheibenmembranen hat Scrambling Aktivität des Rhodopsin vorgeschlagen worden , das Phospholipid Ungleichgewicht zwischen den beiden Membran Blättchen der Bilayer entgegenzuwirken , die durch den ATP-abhängigen, unidirektionale Lipid erzeugt wird Flippase ABCA4 4,8,9 10-12.

Trotz der physiologischen Bedeutung von scramblases, ihre Identität blieb schwer bis Rhodopsin als Scramblase in Photorezeptor Scheiben berichtet wurde 2, die Mitglieder des TMEM16 Proteinfamilie wurden als Ca 2+ identifiziert -abhängigen scramblases für PS - Exposition an der Plasmamembran benötigt (in Bezug prüft 13) und das bakterielle Protein FTSW wurde vorgeschlagen , wie ein Lipid II für Peptidoglycansynthese 14 erforderlich Scramblase. Diese Entdeckungen wurden basierend auf der Rekonstitution von gereinigten Proteinen in Liposomen und Demonstration scramblase Aktivität in den resultierenden Proteo die Methodik describ Verwendunghier ed. Andere potenzielle scramblases 15-21 - die MurJ und amj Proteine ​​in Peptidoglycan - Biosynthese beteiligt, WzxE und verwandte Proteine ​​verwickelt in Scrambling O-Antigen - Vorläufer, MPRF Protein benötigt aminoacylierten Phosphatidylglycerin über die bakterielle Cytoplasmamembran zu translozieren und Xkr8 Familienmitglieder , die vorgeschlagen wurden , PS auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen zu belichten - bleiben biochemisch getestet werden. Dies unterstreicht die Bedeutung eines robusten Assays zu identifizieren und Scramblase Aktivität zu charakterisieren.

Hier beschreiben wir die Rekonstitution von gereinigten Opsin, das Apoprotein des Photorezeptors Rhodopsin, in große unilamellare Vesikel (LUVs) und anschließende Analyse der scramblase Aktivität in den resultierenden Proteo eine fluoreszenzbasierten Assay. Es gibt mehrere gut beschriebenen Protokolle in der Literatur für die heterologe Expression und Reinigung von Opsin, deshalb werden wir nichtbeschreiben sie in diesem Protokoll; wir verwenden , um die in Goren beschriebenen Protokolle et al. 3 , die bei etwa 100 ng / & mgr; l in 0,1% (w / v) Dodecylmaltosid (DDM) FLAG-markiertes, thermo Opsin ergibt.

Die Rekonstitution wird durch die Behandlung LUVs mit ausreichend Waschmittel erreicht, so dass sie anschwellen, aber nicht lösen. Unter diesen Bedingungen wird ein Membranprotein - in Form von Protein-Mizellen Detergenz zugeführt - werden in die Liposomen zu integrieren und in die Liposomenmembran nach Entfernung des Detergens rekonstituiert geworden in Proteo führt. Zu rekonstituieren Opsin (als gereinigtes Protein erhalten in 0,1% (w / v) DDM) sind LUVs aus einem Gemisch aus POPC hergestellt (1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn - glycero-3-phosphocholin) und POPG (1- Palmitoyl-2-Oleoyl - sn - glycero-3- [phospho-rac- (1-Glycerin)]) und mit DDM gesättigt vor dem Hinzufügen von Opsin und NBD-PC. Das Detergens wird dann durch Behandlung der Probe mit Polystyrolkügelchen entfernt.

lass = "jove_content"> Das Prinzip der Fluoreszenz basierenden Assay zugrundeliegende Aufgabe wird in 1B gezeigt. LUVs sind symmetrisch mit einer Spurenmenge von NBD-PC oder andere NBD-markierte fluoreszierende Phospholipid reporter (1A) rekonstituiert. Bei Zugabe von Dithionit, eine Membran-impermeablen Dianion, NBD-PC-Moleküle in dem äußeren Blatt der LUVs gerendert nichtfluoreszierenden als nitro-Gruppe von NBD ist mit einem nicht-fluoreszierenden Amino-Gruppe reduziert. Da weder NBD-PC-Moleküle noch Dithionit Lage sind, die Membran auf der Zeitskala des Versuchs (<10 min) zu durchlaufen, ergibt dies 50% ige Reduktion des Fluoreszenzsignals. schnell nach außen kann jedoch, wenn die Liposomen mit einem scramblase, NBD-PC-Moleküle in der inneren Faltblatt rekonstituiert werden verwürfeln, wo sie reduziert sind. Daraus ergibt sich der Gesamtverlust der Fluoreszenz im idealen Fall (Abbildung 1C).

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. Abbildung 1: Schematische Darstellung des Scramblase Aktivitätstest Der Test verwendet eine fluoreszierende NBD-markierten Reporter Lipid; NBD-PC angezeigt wird (A). Große unilamellare Vesikel sind mit einer Spurenmenge von NBD-PC rekonstituiert. Rekonstitution erzeugt symmetrischen Vesikeln mit NBD-PC gleichmäßig verteilt in den äußeren und inneren Blättchen. Dithionit (S 2 O 4 2-) reduziert chemisch die Nitrogruppe von NBD zu einem nicht-fluoreszierenden amino-Gruppe. Die Behandlung von proteinfreien Liposomen mit Dithionit (B, oben) bewirkt eine 50% ige Reduktion der Fluoreszenz , da nur die NBD-PC - Moleküle in der äußeren Leaflet reduziert: Dithionit negativ geladen ist und die Membran nicht überqueren können mit NBD-PC - Moleküle reagieren im inneren Blatt. Dithionit Behandlung von Opsin haltigen Proteo (B, unten), dh scramblase aktive Proteo, Ergebnisse in 100% Verlust der fluorescence als Opsin erleichtert die Bewegung von NBD-PC zwischen dem inneren und dem äußeren Faltblatt. (C) zeigt idealisierte Fluoreszenzspuren erhalten bei der Behandlung von proteinfreien Liposomen und Opsin haltigen Proteo mit Dithionit. Die Geschwindigkeit der Fluoreszenzverlust ist die gleiche in beiden Fällen das anzeigt, dass die chemische Reduktion von NBD von Dithionit ist geschwindigkeitsbestimmend, und das Verwürfeln bei einer Geschwindigkeit gleich oder größer ist als die Geschwindigkeit der chemischen Reaktion auftritt. Spuren von einem tatsächlichen Experiment sind in Abbildung 3 dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Methoden , die wir beschreiben , können verwendet werden , um andere gereinigten Proteine ​​zu rekonstituieren und Assay sowie Mischungen von Membranproteinen erhalten werden , beispielsweise durch Mikrosomen mit Waschmittel 22 zu extrahieren.

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Protocol

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1. Herstellung von Liposomen und Proteoliposomen

  1. Liposome Formation
    1. Verwendung einer Glasspritze, fügen 1.435 ul POPC (25 mg / ml, in Chloroform) und 160 & mgr; l POPG (25 mg / ml, in Chloroform) auf einen Rundkolben wurden 52,5 umol Lipide in einem Molverhältnis POPC zu erhalten: POPG = 9: 1.
    2. Trocknen der Lipide für 30 min unter Verwendung eines Rotationsverdampfer bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 145 rpm (kein Wasserbad wird für dieses Volumen an Lösungsmittel erforderlich), dann übertragen die Kolben auf einem Vakuum-Exsikkator für mindestens 3 Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur (RT).
    3. Hydratisieren des getrockneten Lipidfilms mit 10 ml 50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl (nachfolgend bezeichnet als A-Puffer) durch vorsichtiges den Kolben, bis eine homogene, trübe Suspension Ergebnisse wirbelnden;
      HINWEIS: Die Lipidkonzentration in diesem Stadium wird erwartet, 5,25 mM zu sein, da keine Verluste sollten bisher aufgetreten sind.
    4. Beschallen die Suspension in einem Wasserbad für 10 min bei Raumtemperatur mit einer Frequenz of 40 kHz. Die Lösung aussehen wird etwas klarer.
    5. Unter Verwendung eines Extruders, übergeben Sie die Suspension 10-mal durch eine Membran mit einer 400 nm Porengröße, gefolgt von einem zweiten Zyklus der Extrusion mit 4 Durchgängen durch eine Membran mit einer 200 nm Porengröße.
      HINWEIS: Der mittlere Durchmesser der resultierenden LUVs von ~ 175 nm. Falls erforderlich, können die Größe und die Homogenität der LUVs durch dynamische Lichtstreuung überprüft werden, entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
    6. Quantifizierung der Phospholipid-Konzentration des LUV-Suspension, wie in Abschnitt 1.2) beschrieben.
      ANMERKUNG: Aufgrund der Verluste während der Extrusion, die Konzentration ist in der Regel etwa 3,6 mM.
    7. Speichern der LUVs bei 4 ° C für ca. 2 Wochen, wenn nicht sofort verwendet wird.
  2. Phospholipid Quantifizierung
    ANMERKUNG: Um die Phospholipid-Konzentration der LUV Suspension zur Rekonstitution sowie die der Proteoliposomen verwendet bestimmen, die schließlich erzeugt werden, ein Aliquot der Probe Ändected Oxidation durch Perchlorsäure. Dieses Verfahren bricht Phospholipide unten anorganisches Phosphat freizugeben , die dann durch einen kolorimetrischen Test im Vergleich mit Standards 23 quantifiziert.
    1. Bereiten Sie eine 40 mM Stammlösung von Natriumphosphat (Na 2 HPO 4) in entionisiertem , destilliertem Wasser.
    2. Verdünnen der Stammlösung mit entionisiertem, destilliertem Wasser zu erhalten, 4 mM und 0,4 mM Arbeitslösungen, die als Kalibrierungsstandards dienen.
    3. Unter Verwendung der Arbeitslösungen vorzubereiten Standards in 13 x 100 mm Glasröhrchen 2 im Bereich von 0 bis 80 nmol Natriumphosphat in einem Endvolumen von 50 ul.
    4. Nehmen Sie sich 10 ul jeder der LUV und Proteoliposoms Proben quantifiziert und mit 40 ul ddH 2 O in 13 x 100 mm 2 Glasröhrchen verdünnen.
      Hinweis: Da die Lipidkonzentration der LUVs und Proteo im Bereich von 2,5-5 uM, die 10 ul Probe 25-50 nmol Lipid Phosphor enthalten.
    5. Hinzufügen 300 ul Perchlorsäure zu jedem der Standards und Proben und Wärme für 1 h bei 145 ° C in einem Heizblock. Setzen Marmor auf den Rohren Verdampfung zu verhindern.
    6. Lassen Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur abkühlen lassen und mit 1 ml ddH 2 O.
    7. In 400 ul jeweils frisch zubereitet 12 g / l Ammoniummolybdat und 50 g / l Natriumascorbat und Wirbel zu mischen.
    8. Hitze 10 min bei 100 ° C mit Murmeln oben auf die Rohre. Entfernen Sie die Schläuche aus dem Heizblock und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    9. Die Extinktion der Proben gegen den Rohling (Standardprobe, die 0 nmol Natriumphosphat) mit einem Spektrometer bei einer Wellenlänge von 797 nm.
    10. Bestimmen Sie den Phosphatgehalt der Proben gegen die Kalibrierung Standardkurve.
  3. Rekonstitution von Opsin
    HINWEIS: Es ist notwendig, die optimale Quellung Bedingungen für die Rekonstitution zu bestimmen, da diese abhängig von der Art des Waschmittels sowieals Lipidzusammensetzung und der Konzentration der LUVs. Als LUVs auf Schwellung des Prozesses ihre Lichtstreuungseigenschaften verändern kann durch Messung der Absorption (Abbildung 2) als rezensiert von Rigaud und Levy 24 und Geertsma et al überwacht werden. 25.
    1. Pipette 800 ul LUVs (aus dem Abschnitt 1.1, wie Lipid Erholung nach der Extrusion 70%, die erwartete Konzentration von LUVs ist 3,6 mM Phospholipid) in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Hinzufügen, 5,3 ul Puffer A und 34,7 & mgr; l 10% (w / v) DDM in Puffer A gelöst
    3. Inkubieren für 3 Stunden bei Raumtemperatur mit end-over-end Mischen.
    4. Vorbereitung der Zwischenzeit die Polystyrol-Kügelchen:
      1. Verwenden Sie 400 mg Kügelchen pro Probe und wiegen sie in einem Becherglas aus.
      2. Waschen Sie zweimal mit Methanol, dreimal mit Wasser und einmal mit Puffer A. Für jeden Waschschritt Einsatz 5 ml Flüssigkeit und rühre langsam für 10 min.
        HINWEIS: Es wird empfohlen, die Polystyrol herzustellenPerlen auf einmal für mehrere Proben, beispielsweise in 6 g Perlen wiegen und mit 75 ml Flüssigkeit zu waschen. Überschüssige Perlen können in einem Kühlschrank für mehrere Tage aufbewahrt werden.
    5. Während der letzten 30 Minuten der Vesikel Destabilisierung trocknen die NBD markierte Phospholipid in einem Schraubverschluss Glasrohr ( "Rekonstitution Glasrohr '): Pro Probe, 9,5 ul NBD-PC (1 mg / ml in Chloroform, wodurch man 0,4 Mol% der gesamten Phospholipiden) werden unter einem Stickstoffstrom in einem Glasröhrchen getrocknet und anschließend in 45 ul 0,1% (w / v) DDM in Puffer A gelöst
    6. Nach 3 h Vesikel Destabilisierung fügen den gelösten-NBD-markiertes Phospholipid, das DDM-solubilisierten Protein und Puffer A , so dass das Endvolumen von 1 ml 0,36% (w / v), das heißt, 7 mM, DDM.
      1. Somit proteinfreien Liposomen (verwendet als Kontrollprobe) in 45 ul NBD-PC (gelöst in 0,1% DDM), 60 ul 0,1% DDM und 55 ul Puffer A zu erzeugen; für Proteo hinzufügen, für PrüfungB. 40 & mgr; l Protein (aus einer typischen Stammlösung von ~ 110 ng / ul) in 0,1% DDM, 45 & mgr; l von NBD-PC, (in 0,1% DDM) gelöst, 20 ul 0,1% DDM und 55 & mgr; l Puffer A .
        Hinweis: Die Reihenfolge der Zugabe werden sollte, wie aufgelistet.
    7. Die Probe wird für eine zusätzliche Stunde Ende über Ende bei Raumtemperatur.
    8. In 80 mg der hergestellten Polystyrol-Kügelchen und Inkubation der Probe mit end-over-end bei RT für 1 h gemischt werden.
    9. Als nächstes fügen Sie eine zusätzliche 160 mg Polystyrol-Kügelchen und Inkubation mit End-over-end bei RT für weitere 2 Stunden gemischt wird.
    10. Übertragen Sie die Probe (Abfahrt die verbrauchten Polystyrolkügelchen hinter) auf eine Glas Schraubverschluss Röhrchen mit 160 mg frisch Polystyrolkügelchen und über Nacht bei 4 ° C mischen.
      HINWEIS: Der einfachste Weg, um die Probe zu übertragen und zu vermeiden Ansaugen Perlen ist eine Pasteurpipette zu verwenden, die mit einem kleinen positiven Druck auf den Boden der Glasröhre gedrückt wird. Sobald die Spitze der Pipette ist fest an derBoden des Rohres, dann kann die Probe leicht, ohne von den Kügelchen Interferenz zurückgezogen werden.
    11. Am nächsten Morgen, übertragen Sie die Probe auf ein Mikrozentrifugenröhrchen ohne Perlen und auf Eis in Vorbereitung auf die Scramblase Aktivitätstest Durchführung über.

2. Scramblase Aktivitätstest

HINWEIS: Die Fluoreszenzintensität der Liposomen oder Proteoliposomen mit Puffer A verdünnt wird über die Zeit nach der Zugabe von Dithionit in einem Fluoreszenz-Spektrometer überwacht. Um eine stabile Ausgangsintensität zu erhalten, wird die Fluoreszenz für mindestens 50 sec aufgezeichnet (oder bis ein stabiles Signal erreicht wird), bevor Dithionit zu einer konstant gerührten Probe zugegeben und anschließend wird dann für mindestens 500 s nach Zugabe von Dithionit.

  1. In 1.950 ul Puffer A zu einer Plastikküvette ein Mini Rührstab enthält.
  2. In 50 ul der vorbereiteten proteo (Liposomen) und lassen Sie die Probe in der Fluoreszenz SPECTRO äquilibrierenMeter unter ständigem Rühren für mehrere Sekunden.
  3. Inzwischen bereiten eine Lösung von 1 M Dithionit in 0,5 M ungepufferte Tris (zB für zwei Proben 20 mg Dithionit in ein Mikrozentrifugenröhrchen abwiegen und in 114 ul eiskaltem 0,5 M Tris direkt vor dem Gebrauch und auf Eis halten für die nächste auflösen Sample).
    HINWEIS: Die Dithionit-Lösung muss frisch zubereitet werden und sollte nicht mehr als 20 min nach der Herstellung verwendet werden; wenn viele Messungen vorgenommen werden, Aliquots von Dithionit können im Voraus werden abgewogen und unmittelbar vor der Verwendung gelöst.
  4. Starten Sie die Fluoreszenzüberwachung (Anregung 470 nm, Emission 530 nm, Spaltbreite 0,5 nm).
  5. In 40 ul der 1 M Dithionitlösung in die Küvette 50 Sekunden nach der Fluoreszenz Starten der Aufnahme (mit dem Septum im Deckel der Küvette Kammer, wenn möglich) und weiterhin die Fluoreszenz für eine weitere 400-600 sec aufzeichnen.
  6. Analysieren Sie die Daten, wie in Kapitel 3 beschrieben.

3.Datenanalyse

  1. Kinetik der Scrambling
    1. Charakterisieren Sie die Fluoreszenzspur jedes durch die Scramblase Aktivitätstest erhaltenen Probe durch die anfängliche Fluoreszenz definiert, F i, vor der Zugabe von Dithionit und der Endpunkt Fluoreszenz, F, erreichte nach> 400 sec. F i wird für jede Probe als Mittelwert der Fluoreszenz für den Zeitraum von 30 sec bestimmt vor der Zugabe von Dithionit.
    2. Bestimmen die Endpunktdaten entsprechend dem Ausmaß des Fluoreszenzreduktion, R = 100 • F / F i. Wir verwenden die Begriffe R L für proteinfreien Liposomen und R P für Opsin enthaltenden Proteo.
  2. Bestimmung des Molekulargewichts des Funktionell Rekonstituiertes Scramblase
    1. Konvertieren der Fluoreszenzreduktionsdaten gemäß der folgenden Gleichung:
      p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R max - R L) (Gleichung 1)
      HINWEISWobei R max die maximale Reduktion ist , die erhalten wird , wenn ausreichend Protein, rekonstituiert wird , dass alle Vesikel in der Probe mindestens eine funktionelle scramblase besitzen, und p ist die Wahrscheinlichkeit , dass ein bestimmter Vesikel in einer rekonstituierten Probe wird als "Scramblase-aktiv", dh sie besitzt mindestens eine funktionelle scramblase. Der Wert für R L beträgt typischerweise 45% 3 , während R max ist typischerweise 82,5% 3, anstelle des erwarteten 100% (R max kann experimentell für Opsin Proteoliposomen mit einem PPR von> 1 mg / mmol bestimmt werden). Als R max <100% wird davon ausgegangen , dass eine Subpopulation von Vesikeln zur Rekonstitution refraktären ist. Für R max = 82,5%, der Anteil an Vesikeln , die Protein nicht annehmen kann ist 0.35.
    2. Beschreiben Sie die Beziehung zwischen p (≥1 Scramblase) und PPR (mg Protein / mmol Phospholipid) durch Poisson-Statistik wie folgt:
      p (≥1 Scramblase) = 1 - e ANMERKUNG: wo m = Anzahl der scramblases pro Vesikel und α = mono-exponentiellen Anpassung konstant in Einheiten von mg Protein / mmol Phospholipid.
    3. Als ein Teil der Vesikel trägt nicht auch bei hohen PPR (siehe Diskussion) zu kriechen, ändern Sie die Gleichung:
      p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Gleichung 3)
      HINWEIS: Wenn PPR * = PPR / (1 ​​- f), wobei f die feuerfeste Population von Vesikeln oder in diesem Fall, PPR = * PPR / 0,65 (Gleichung 4).
      HINWEIS: Die Passform Konstante α wird durch den Einbau eines Graphen von p bestimmt (≥1 Scramblase) im Vergleich zu PPR * mit einem Mono-Exponentialfunktion. Wenn Opsin (Molekulargewicht 41,7 kDa) rekonstituiert funktionell in 175-nm-Durchmesser Vesikel (jedes Vesikel besitzt 280.000 Phospholipide 26) als ein Monomer, α = 0,187 mg mmol -1. Wenn Opsin dimerisiert vor 3 der Rekonstitution Scramblase aktive Vesikel zu erhalten, dann α= 0,37 mg mmol -1. Wenn PPR nicht PPR * für die Analyse verwendet werden würde, dann würden die entsprechenden α Werte 0,122 und 0,244 mg mmol -1 sein. Diese vorhergesagten Werte für α annehmen, dass alle Opsinmoleküle funktionell zuständig sind. Wenn nur ein Bruchteil der Moleküle befähigt ist, Lipide zu verwürfeln, dann werden die entsprechenden Werte von α größer sein.

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Representative Results

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Wir beschreiben die Rekonstitution von Opsin in LUVs unter Verwendung eines fluoreszenzbasierten Assays seiner Scramblase Aktivität zu charakterisieren. Wir analysieren die Ergebnisse eine untere Grenze auf die Geschwindigkeit des Opsin-vermittelten Phospholipid zu platzieren Scrambling und die oligomere Zustand zu bestimmen, in dem Opsin funktionell in den Vesikeln rekonstituiert.

Um eine optimale Rekonstituierung Bedingungen identifizieren, ist es erforderlich, empirisch die Menge an Waschmittel zu bestimmen, die verwendet werden, müssen die LUVs zu quellen, so dass sie zu Proteininsertion empfänglich sind. Ein solcher Versuch ist in 2A dargestellt. Aliquots von POPC: POPG LUVs mit unterschiedlichen Mengen an DDM für 3 h und die Extinktion der Probe behandelt werden, wird bei 540 nm ein Maß für die Trübung und damit der Vesikelgröße gemessen. Die optische Dichte bei 540 nm (OD 540) gemessen Graph zeigt , daß die Vesikel quellen als DDM Konzentration 4-6 mM erhöht wird, bei etwa 7 mM einen Sättigungspunkt erreicht , bevor (entsprechend Verlust von Trübung und OD 540 - Signal) als DDM weiter erhöht zu lösen beginnt. NBD-PC wird nach der Detergensbehandlung zugegeben und die Proben werden weiter für eine Stunde inkubiert, bevor sie mit Polystyrolkügelchen behandelt Detergens zu entfernen. Die Transdoppel Verteilung von NBD-PC wird durch Messen Fluoreszenzverlust nach Dithionit zu den Vesikeln Zugabe bestimmt (wie oben beschrieben). Somit fügt NBD-PC in den Außenpackungsbeilage von Vesikeln in Abwesenheit von Detergens, durch ihre vollständige Zugänglichkeit angegeben Dithionit. Für Vesikel mit> 2 mM DDM behandelt, NBD-PC in der Lage, die symmetrisch in beide Faltblätter zu verteilen, so dass, sobald DDM 50% der NBD-PC entfernt wird, ist aus Dithionit geschützt.

2B zeigt eine ähnliche Destabilisierung-Rekonstitution Experiment (neu gezeichnet von Referenz 2 </ Sup>), diesmal, um die Wiederherstellung der Opsin-Tracking. In diesem Experiment ist ersichtlich, daß 7 mM DDM für Opsin Rekonstitution erforderlich ist ersichtlich, daß NBD-PC wird quantitativ (> 80%) zugänglich als Folge von Dithionit Opsin-vermittelten Verwürfelung.

Figur 2
Fig . 2: Rekonstitution von NBD-PC und Opsin in detergens destabilisiert Vesikel (A) Aliquote der Vesikel werden mit einer Reihe von Detergens - Konzentrationen (0-9 mM) behandelt , von end-over-end 3 Stunden Mischen bei Raumtemperatur . Am Ende der Inkubationszeit die Absorption der Proben bei 540 nm gemessen wird (schwarze Linie). NBD-PC (gelöst in 0,1% w / v DDM) wird dann zugegeben und die Probe wird für eine weitere 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, bevor das Waschmittel durch Polystyrolkügelchen Behandlung entfernt wird. Die resultierenden Liposome werden durch die fluor analysiert zierReduktionsTest (rote Linie), um das Ausmaß zu bestimmen, in dem NBD-PC symmetrisch anrühren. (B) Wie unter (A) , aber in diesem Experiment Vesikel aus Ei - Phospholipiden gebildet (Ei - PC / Ei - Phosphatidsäure, 9: 1 mol / mol) wurden mit DDM destabilisiert und Opsin wurde zusammen mit NBD-PC aufgenommen, in ein resultierendes Fluoreszenzreduktion von etwa 80% , wenn das Protein effizient rekonstituiert wird und in der Lage zu erleichtern , von NBD-PC Verwürfelung (modifiziert nach Referenz 2). Obwohl NBD-PC symmetrisch an 2 mM DDM rekonstituiert wurde, wurden die optimalen Bedingungen für die Rekonstitution Opsin um den Peak von OD 540 Extinktion gewählt, das heißt, der Punkt , an dem die Vesikel aufgrund interkalierten Waschmittel stark gequollenen waren , aber noch nicht solubilisierte (durch die angegebenen Pfeil). Für POPC / POPG (9: 1 mol / mol) Vesikel, einer DDM Konzentration von 8 mM wurde festgestellt, sowohl für NBD-PC und Opsin Rekonstitution optimal./54635/54635fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Das Ausmaß der Fluoreszenzreduktion steigt mit der Menge an Opsin zur Rekonstitution verwendet. 3A zeigt Spuren Fluoreszenz erhalten über das Hinzufügen von Dithionit zu NBD-PC-haltige Protein freien Liposomen (schwarze Kurve) und Proteo Rekonstitution mit Opsin an verschiedenen Protein - Phospholipid - Verhältnisse (PPR, in Einheiten von mg Protein pro mmol Phospholipid, rote Spuren); die Spuren wurden normalisiert , so dass sie alle die gleiche Anfangsfluoreszenz (F i) Wert für eine einfachere Visualisierung haben. Monoexpotentielles Passungen der Spuren zeigen sehr ähnliche Zeitkonstanten von 20 bis 25 sec reicht; als die Rate der Dithionit-vermittelten NBD-PC Reduktion in proteinfreien Liposomen die gleiche wie in den Proteo ist, ist es nur möglich, eine niedrigere Schätzung auf die Rate der Opsin-vermittelten (siehe Scrambling zu platzieren text für weitere Details). 3B zeigt die analysierten Daten aus den Fluoreszenz - Assays Reduktion erhaltenen Plots von p zu ergeben (≥1) Scramblase (die Wahrscheinlichkeit eines Vesikel mindestens eine Scramblase) im Vergleich zu den experimentell gemessenen PPR (bezogen auf PPR mit * wie oben erörtert). Vergleich der monoexponentielle Anpassung der experimentellen Ergebnisse in hypothetischen fits entsprechenden als Monomer rekonstituiert Opsin wird, Dimer oder Tetramer zeigen, dass Opsin funktionell als Dimer rekonstituiert.

Figur 3
Abbildung 3:. Scramblase Aktivität von Opsin (A) Fluoreszenz Spuren entsprechende Behandlung von Vesikeln mit NBD-PC und Opsin Mengen im Bereich zwischen 0 bis 4,95 ug, angedeutet durch den Keil Rekonstitution Dithionit. Die geringste Menge an Opsin Rekonstitution entspricht einer PPR von 0,21 mg / mmol, demzweithöchste Menge auf 0,43 mg / mmol und die höchste Menge auf 1,3 mg / mmol oder 10 Opsinen pro Vesikel im Durchschnitt. Dithionit wurde bei der angegebenen Zeit (Pfeil) zugegeben und NBD-Fluoreszenz wurde für weitere 400 sec überwacht. Die maximale Ausdehnung der Fluoreszenzreduktion in diesem Experiment gesehen betrug 85%, während der Durchschnitt über viele Experimente bei 82,5%. (B) Protein Abhängigkeit von Scrambling. Daten aus Experimenten ähnlich Platten A wurden mit Poisson-Statistik analysiert, um eine graphische Darstellung der Wahrscheinlichkeit von Vesikeln mindestens eine scramblase (p ≥1 scramblase) gegenüber dem Protein zu Phospholipid-Verhältnis (PPR) mit der Vesikel zu erzeugen (Protein post- quantifiziert Rekonstitution von Western - Blot - Analyse 3 und Phospholipid wurde durch Messung anorganischem Phosphat freigesetzt auf saure Hydrolyse) bestimmt. Die rote Linie stellt eine mono-exponentiellen Anpassung für die Daten; die gestrichelte graue Linien repräsentieren Mono exponentielle Anpassungen für die Rekonstitution von Opsin in 170 nm-Durchmesser vesicles als Monomere, Dimere vorgeformten oder vorgeformten Tetrameren. Da die x-Achse die experimentell gemessene PPR darstellt ( und nicht PPR * (siehe Haupttext)) entsprechen die Passform Konstanten PPR statt PPR * Werte, wie im Haupttext erörtert. Bitte hier klicken um eine größere Version zu sehen diese Figur.

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Die Scramblase Aktivitätstest konnten wir ursprünglich das Opsin Phospholipid Scramblase zu bestimmen Aktivität 2 hat. Der Assay auch erlaubt uns Opsin der scramblase Aktivität zu charakterisieren , indem die Spezifität zu testen (verwendeten wir eine Vielzahl von NBD-markierten Reporter Lipiden wie NBD-Phosphatidylethanolamin, mit NBD an einer Acylkette markiert , wie für NBD-PC in Figur 1A gezeigt ist , oder auf die Kopfgruppen-, NBD-Sphingomyelin oder NBD- Phosphatidylserin 2), die Wirkung der Vesikel Lipid - Zusammensetzung (zB Cholesterin in unterschiedlichen Mengen als Vesikel Bestandteil ), und ob die verschiedenen Konformationen von Opsin und Rhodopsin alle Aktivitäts Scramblase Ausstellung. Diese Analysen zeigten , dass Rhodopsin die Scramblase Aktivität sehr schnell (> 10.000 Phospholipide pro Sekunde), nicht spezifisch für das Phospholipid und unabhängig von Rhodopsin der Konformation oder ob es enthält seine Chromophor Retinal 2,3. Hier,präsentierten wir ein detailliertes Verfahren Proteo enthält Opsin zu erzeugen, und zeigte, wie diese Vorbereitungen für Phospholipid Scramblase Aktivität zu untersuchen.

Das beschriebene Rekonstitution Protokoll wird für die gegebene Lipidzusammensetzung optimiert und für die Rekonstitution Opsin nachdem es durch Affinitätschromatographie unter Verwendung DDM als solubilisierendes Detergenz gereinigt wurde. Die Lipidzusammensetzung sowie dem Waschmittel können je nach den Bedürfnissen der Experimentator geändert werden, auch wenn die ideale Rekonstitution Bedingungen veränderten Bedingungen durch Ausführen der "Quellung-experiment" in Abbildung 2 beschrieben bestimmt werden. DDM ist empirisch gut geeignet für Opsin in stabilen und aktiven Zustand zu halten. Jedoch sind auch andere Detergenzien, wie Octyl-β-glucosid, CHAPS oder Triton X-100 können folgende ähnliche Protokolle verwendet werden. Triton X-100 ist ein weit verbreitetes Reinigungsmittel zur Rekonstitution ATP-bindenden Kassette Transporter (ABC-Transporter) als efficiency in Membran Rekonstitution vermittelnde höher ist als der andere Detergenzien und es nimmt auch weniger Zeit mit vorgeformten Liposomen 24 zu äquilibrieren.

Es ist möglich den oligomeren Zustand des funktionell rekonstituierten Opsin , wenn das Ausmaß des Fluoreszenzreduktion zu bestimmen , für Proben rekonstituiert mit unterschiedlichen Mengen an Opsin erhalten wird, dh über einen Bereich von Protein zu Phospholipid - Verhältnis (PPRs). Um dies zu tun, muss der PPR der rekonstituierten Vesikel explizit als Gewinnung von Protein und Phospholipid gemessen werden kann variieren. Phospholipid Rückgewinnung kann in Abschnitt 1.2, während die Proteinrückgewinnung beschrieben durch die Phosphat-Assay bestimmt werden kann durch quantitative Western Blot-Analyse, in der die gereinigten Proteine ​​für Wiederherstellungen verwendet, werden verwendet, geschätzt werden, um eine Kalibrierungskurve zu erzeugen, die in Vergleich zu der Gewinnung von rekonstituierten Proben ermöglicht die PPR getesteten Bereich (wie im Detail in Bezug auf 3 erklärt).

Die scramblase Aktivitätstest ist auf der Annahme aufgebaut, Dithionit nicht in die Vesikel zu durchdringen. Dieser Punkt kann durch Einfangen eines löslichen NBD-markierte Reporter innerhalb der Vesikel und Bestimmen, überprüft werden, ob sie von Dithionit reduziert werden kann. Hierzu NBD-Glucose (12,6 & mgr; M nach Vesikel Destabilisierung hinzugefügt) anstelle von NBD-PC verwendet. Dieses wasserlösliche Molekül innerhalb der Proteoliposomen eingefangen, sobald die Vesikel versiegelt und sollte daher aus Dithionit geschützt werden. Um die NBD-Glukose vollständig zugänglich für die Reduktion, Triton X-100 machen können hinzugefügt werden (1% w / v) , die dann führt zu einer 100% Reduktion 3,27.

Die Proteo können gekennzeichnet sein, dass die Rekonstitution zu überprüfen, sowohl der Reporter Lipid- und Protein symmetrisch ist. Ersteres wird durch Stoßlöschung Experimente erreicht unter Verwendung von Iodid-Ionen, während letztere auf einer Protease Schutzstrategie basiert mit AspN Protease, dieschneidet an einer bestimmten Stelle in der Nähe des C-Terminus von Opsin 3.

Der Übergang von der anfänglichen Fluoreszenz (F i) in der scramblase Aktivität bestimmt Assay zum Endpunkt Fluoreszenz (F) ist komplex, aber für unsere Zwecke kann vernünftigerweise von einer einzigen exponentiellen Zerfallsfunktion angenähert werden. Die Zeitkonstante der exponentiellen Abnahme zugeordnet (20 sec) ist etwa die gleiche für inaktive Liposomen und aktiv, Opsin enthaltenden Proteo anzeigt, dass Verwürfelung so schnell auftritt, oder schneller ist als die Rate, mit der die NBD Fluorophor durch Dithionit reduziert. So ist die Scramblase Aktivitätstest hat eine schlechte Zeitauflösung (begrenzt durch Dithionit Reduktionschemie), die derzeit nur Klassifikation von Mutanten in aktive erlaubt, sehr langsam oder inaktiv ist. Diese Klassifizierung könnte für die Kalzium-regulierten Scramblase TMEM16 27 gesehen werden: bei hohen Ca 2+ -Spiegel ergab die Fluoreszenzabklingkurve eine Zeitkonstante ähnlich wie that in proteinfreien Liposomen zu sehen, was darauf hinweist, dass die Rate begrenzenden Schritt ist die chemische Reduktion des NBD-Fluorophor von Dithionit als Lipid Verwürfelung. Im Gegenteil, bei niedrigen Ca 2+ -Spiegel wurde der stationäre Zustand von Fluoreszenzreduktion nicht nach 900 sec erreicht, wodurch es möglich zwischen zwei kinetischen Komponenten, einer zugeordneten der Dithionit Reduzierung des Außenpackungsbeilage und der langsamere zur Belichtungs zu unterscheiden inner Faltblatt NBD-Lipide nach außen.

Die Diskrepanz zwischen dem vorhergesagten 100% Verlust der Fluoreszenz auf der Behandlung mit Dithionit von Vesikeln mit hoher PPR (1C) gegenüber dem experimentellen Realität vorbereitet , wo es schwierig ist , zu überschreiten ~ 85% Reduktion (3A) legt nahe , dass ein Teil der Vesikel ist refraktären der Rekonstitution. Dieser Anteil könnte entsprechen, die Dichtung zu Vesikeln früh während der Rekonstitution als Reinigungsmittel auf die Polystyrol-Kügelchen adsorbiert und sinddaher nicht mehr Protein zu erhalten. Für die Analyse in Abschnitt 3 beschrieben, gingen wir davon aus, dass diese refraktärste auf einen Bruchteil entspricht f der gesamten Vesikel. Wenn wir , dass die Hälfte der NBD-PC - Moleküle (der Pool von NBD-PC in der äußeren Beilage) in den feuerfesten Vesikel ist für Dithionit Reduktion verfügbar annehmen, dann schätzen wir f = 2 • (1 - R max / 100), oder 0,35 , wenn R max = 82,5%.

Einbau von p (≥1 scramblase) gegen PPR * Daten mit einer mono-exponentiellen Gleichung die fit Konstante α liefert, aus denen es möglich ist, zu bestimmen, ob Opsin funktionell als Monomer oder Dimer oder ein Gemisch von Zuständen einschließlich Multimere höherer Ordnung rekonstituiert . Die Interpretation dieser Ergebnisse wird kompliziert, wenn ein Bruchteil Opsin Moleküle nicht in Scrambling funktionieren kann. Dies ist zwar unwahrscheinlich, dass die Bedingungen gegeben, unter denen Opsin gereinigt wird, die gewährleistet, dass er alle seine G-Protein behältRezeptor-Aktivitäten, ein Wert von α zu der funktionalen Insertion von Dimeren entsprechen könnte auch als funktionelle Insertion von Monomeren aus einer Präparation von Opsin interpretiert werden, bei denen die Hälfte der Proteine ​​sind inaktive als scramblases. Ein weiterer Punkt ist, dass die Analyse, die wir präsentieren wird davon ausgegangen, dass die Vesikel zur Rekonstitution verwendet homogen sind groß. In Wirklichkeit haben die Vesikel einen Bereich von Durchmessern durch eine Gauß'sche Verteilung mit einer Standardabweichung entsprechend etwa einem Drittel des mittleren Durchmessers gekennzeichnet. Glücklicherweise ist das Ergebnis der Analyse von p (≥1 scramblase) gegen PPR * -Daten nicht signifikant durch Berücksichtigung der Vesikel Heterogenität betroffen, und so die einfache Analyse, die wir präsentiert ausreichend ist, die Daten zu beschreiben.

Eine potentielle Beschränkung der Methoden, die wir beschrieben ist, dass die arbeitsintensive Prozedur Messungen einer sehr hohen Anzahl von Proben, die nicht mit hohem Durchsatz erlaubt einend, dass Vesikel Heterogenität könnte das Auslesen stören. Das erste Problem kann durch die Verwendung eines Mikrotiterplatten-Format für den Scramblase Assay überwunden werden; der zweite könnte in Zukunft durch einzelne Vesikel Tests unter Verwendung von TIRF-Mikroskopie gelöst werden.

Der Dithionit Assay für Scramblase Aktivität messen kann als sehr zuverlässig und robust angesehen werden, sobald eine Destabilisierung und Rekonstitution Verfahren festgelegt werden. Ein alternativer Ansatz Transmembrantransport von Phospholipiden zu quantifizieren, das heißt von der äußeren Faltblatt der Vesikel Verifizieren auch Albumin 22 fettsäurefreies Rinderserum mit kurzkettigen NBD-Lipide, aus dem Dithionit Test erhaltenen Ergebnisse ermöglicht die Rückextraktion von. Rückextraktion haben sowie die Dithionit - Assay auch flippases der P4-Typ - ATPasen und ABC - Transporter eingesetzt worden 28-33 zu charakterisieren und zu identifizieren.

Da die hier vorgestellten Geräte können leicht nach differe angepasst werdennt muss die beschriebenen Verfahren sind vielseitig und werden bei der Identifizierung und Charakterisierung von Phospholipid scramblases in der Zukunft helfen. die Identität vieler dieser Lernen, einschließlich des Scramblase notwendig für den Ausbau von biogenen Membranen während des Zellwachstums ist von größter physiologischer Bedeutung.

Weitere Informationen und eine detaillierte Beschreibung der Datenanalyse werden die Leser zu früheren Veröffentlichungen aus unserem Labor genannt 2-4,27 sowie andere 22,25,28,30.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 ml extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 ml Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

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References

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Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity
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Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).More

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

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