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Biochemistry

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

doi: 10.3791/54635 Published: September 20, 2016

Abstract

Scramblases traslocano fosfolipidi attraverso il doppio strato di membrana bidirezionale in modo ATP-indipendente. Il primo scramblase per essere identificati e biochimicamente verificato è stato opsin, la apoprotein della rodopsina fotorecettori. Rhodopsin è un recettore accoppiato alla proteina G localizzato in rod fotorecettori membrane a disco della retina dove è responsabile per la percezione della luce. Attività scramblase di Rhodopsin non dipende dal suo ligando 11- cis -retinal, cioè, il opsin apoprotein è anche attivo come scramblase. Sebbene fosfolipidi costitutiva e regolato scrambling svolgono un ruolo importante nella fisiologia cellulare, solo pochi scramblases fosfolipidi sono stati identificati finora oltre opsin. Qui si descrive un saggio di fluorescenza a base di attività di scramblase opsin. Opsina viene ricostituito in grandi liposomi unilamellari composti di fosfatidilcolina, phosphatidylglycerol e una quantità traccia di fluorescenza NBD marcato PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-il) ammino] esanoile} - sn -glycero-3-phosphocholine). attività Scramblase è determinata misurando la misura in cui le molecole NBD-PC situati nel foglietto interno della vescicola sono in grado di accedere al foglietto esterno dove la loro fluorescenza viene eliminata chimicamente da un agente riducente che non può attraversare la membrana. I metodi che descriviamo hanno applicabilità generale e può essere utilizzato per identificare e caratterizzare le attività scramblase di altre proteine ​​di membrana.

Introduction

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La rodopsina fotorecettore, un G protein-coupled receptor prototipo (recensito ad esempio in riferimento 1), è il primo scramblasi essere identificati e biochimicamente verificato 2,3. Scramblases sono trasportatori fosfolipidi che aumentano il tasso intrinsecamente lento movimento transbilayer fosfolipide a fisiologicamente livelli appropriati in un bidirezionale, modalità ATP-indipendenti 4-6. Esempi di loro azioni possono essere trovati nel reticolo endoplasmatico e batterica membrana citoplasmatica dove è necessaria scrambling costitutivo per l'omeostasi di membrana e la crescita, così come per una varietà di percorsi di glicosilazione 5. Scrambling fosfolipide regolamentata è necessaria per esporre fosfatidilserina (PS) sulla superficie delle cellule apoptotiche dove agisce come un "mangia-me" -signal per macrofagi 7 e fornisce una superficie procoagulante sulle piastrine attivate per catalizzare la produzione di fattore proteicos necessaria per la coagulazione del sangue. In membrane disco fotorecettori, l'attività scrambling di rodopsina è stato suggerito di contrastare lo squilibrio fosfolipidi tra i due volantini membrana del doppio strato che viene generato dalla ATP-dipendente, lipidi unidirezionale flippase ABCA4 4,8,9 10-12.

Nonostante l'importanza fisiologica di scramblases, la loro identità è rimasta inafferrabile fino rodopsina è stato segnalato come un scramblase nei dischi dei fotorecettori 2, i membri della famiglia di proteine ​​TMEM16 sono stati identificati come Ca 2+ scramblases -dipendenti necessari per l'esposizione di PS a livello della membrana plasmatica (recensione in riferimento 13), e la proteina batterica FTSW stato proposto come scramblase richiesto un lipide II per la sintesi del peptidoglicano 14. Queste scoperte sono state basate sulla ricostituzione delle proteine ​​purificate in liposomi e dimostrazione di attività scramblase nelle proteoliposomi risultanti mediante la metodologia describcato qui. Altri potenziali scramblases 15-21 - Le proteine ​​MurJ e AMJ implicati nella biosintesi peptidoglicano, WzxE e proteine ​​correlate implicati in rimescolando precursori O-antigene, le proteine ​​MPRF bisogno di traslocare phosphatidylglycerol aminoacylated attraverso la membrana citoplasmatica batterica, e membri della famiglia Xkr8 che sono stati proposti esporre PS sulla superficie delle cellule apoptotiche - restano da testare biochimicamente. Questo mette in evidenza l'importanza di un saggio robusto per identificare e caratterizzare l'attività scramblase.

Qui, descriviamo la ricostituzione di opsin purificata, la apoprotein della rodopsina fotorecettore, in grandi vescicole unilamellari (luvs), e la successiva analisi dell'attività scramblase nelle proteoliposomi risultante utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza. Ci sono diversi protocolli ben descritto in letteratura per l'espressione eterologa e purificazione di opsin, quindi non ci saràdescriverlo in questo protocollo; usiamo i protocolli descritti nelle Goren et al. 3, che i rendimenti FLAG-tag, opsina termostabile a circa 100 ng / ml a 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).

Ricostituzione si ottiene trattando luvs con detersivo sufficiente in modo che si gonfiano, ma non si sciolgono. In queste condizioni, una proteina di membrana - fornita in forma di micelle proteina-detergente - integrerà nei liposomi e diventare ricostituito nella membrana del liposoma alla rimozione del detersivo, causando proteoliposomi. Per ricostituire opsin (ottenuto come proteina purificata nello 0,1% (w / v) DDM), luvs sono preparati da una miscela di POPC (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine) e POPG (1- palmitoil-2-oleoyl- SN -glycero-3- [fosfo-rac- (1-glicerolo)]) e satura di DDM prima di aggiungere opsina e NBD-PC. Il detergente viene poi rimosso mediante trattamento del campione con perle di polistirene.

lass = "jove_content"> Il principio alla base del saggio basato sulla fluorescenza è mostrato nella Figura 1B. Luvs sono simmetricamente ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC o un altro giornalista di fosfolipidi fluorescente NBD marcato (Figura 1A). In aggiunta ditionito, un non fluorescente dianione membrana impermeant, molecole NBD-PC nel foglietto esterno delle luvs sono resi come nitro-gruppo di NBD è ridotta ad un ammino-gruppo non fluorescente. Poiché né molecole NBD-PC né ditionito sono in grado di attraversare la membrana sulla scala temporale dell'esperimento (<10 min), questo si traduce in una riduzione del 50% del segnale fluorescente. Tuttavia, se i liposomi sono ricostituiti con una scramblase, molecole NBD-PC nel foglietto interno possono rimescolare rapidamente all'esterno dove vengono ridotti. Ciò comporta la perdita totale della fluorescenza nel caso ideale (Figura 1C).

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. Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di attività scramblase Il saggio utilizza una fluorescenza NBD marcato reporter di lipidi; NBD-PC è mostrato (A). Le grandi vescicole unilamellari sono ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC. Ricostituzione produce vescicole simmetriche, con NBD-PC distribuito equamente negli opuscoli esterne ed interne. Ditionito (S 2 O 4 2-) riduce chimicamente il nitro-gruppo di NBD ad un ammino-gruppo non fluorescente. Trattamento di liposomi privi di proteine ​​con ditionito (B, top) causa una riduzione del 50% della fluorescenza poiché solo le molecole NBD-PC nel foglietto esterno vengono ridotti: ditionito è caricato negativamente e non possono attraversare la membrana per reagire con molecole NBD-PC nel foglietto interno. Trattamento dithionite di proteoliposomi opsin contenenti (B, in basso), vale a dire, proteoliposomi scramblase-attiva, si traduce in perdita di 100% di fluorescence come opsina facilita il movimento di NBD-PC tra l'interno e il foglietto esterno. (C) mostra le tracce di fluorescenza idealizzate ottenuti sul trattamento liposomi senza proteine ​​e proteoliposomi opsin contenenti con ditionito. Il tasso di perdita di fluorescenza è la stessa in entrambi i casi che indicano che la riduzione chimica dei NBD da ditionito è limitante, e che scrambling avviene ad una velocità uguale o superiore alla velocità della reazione chimica. Tracce ottenuti da un esperimento reale sono mostrati in figura 3. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

I metodi che descriviamo possono essere utilizzati per ricostituire e saggiare altre proteine ​​purificate, nonché miscele di proteine ​​di membrana ottenute, ad esempio, estraendo microsomi con detergente 22.

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Protocol

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1. Preparazione di liposomi e proteoliposomi

  1. Formazione liposomi
    1. Usando una siringa di vetro, aggiungere 1.435 microlitri POPC (25 mg / ml, in cloroformio) e 160 microlitri POPG (25 mg / ml, in cloroformio) in un pallone a fondo rotondo da ottenere 52,5 mmol lipidi in un rapporto molare di POPC: POPG = 9: 1.
    2. Essiccare i lipidi per 30 minuti usando un evaporatore rotante ad una velocità di rotazione di 145 rpm (senza bagno d'acqua è necessaria per questo volume di solvente), quindi trasferire il pallone in un essiccatore sotto vuoto per almeno 3 ore, o durante la notte, a temperatura ambiente (RT).
    3. Idratare il film lipidico essiccato con 10 ml di 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl (di seguito indicato come tampone A) agitando delicatamente il pallone fino a omogenei, risultati sospensione torbida;
      NOTA: La concentrazione di lipidi in questa fase dovrebbe essere 5,25 mM come perdite dovrebbero sono verificate finora.
    4. Sonicare la sospensione a bagnomaria per 10 minuti a temperatura ambiente con una frequenza of 40 kHz. La soluzione sarà un po 'più chiara.
    5. Utilizzando un estrusore, passare la sospensione per 10 volte attraverso una membrana con dimensione dei pori di 400 nm, seguito da un secondo ciclo di estrusione con 4 passa attraverso una membrana con dimensione dei pori di 200 nm.
      NOTA: Il diametro medio delle luvs risultante è ~ 175 nm. Se necessario, le dimensioni e l'omogeneità delle luvs possono essere controllati da Dynamic Light Scattering secondo le istruzioni del produttore.
    6. Quantificare la concentrazione di fosfolipidi della sospensione LUV come descritto nel paragrafo 1.2).
      NOTA: A causa delle perdite durante l'estrusione, la concentrazione è di solito circa 3,6 mm.
    7. Conservare i luvs a 4 ° C per circa 2 settimane, se non utilizzato immediatamente.
  2. Quantificazione fosfolipide
    NOTA: Per determinare la concentrazione di fosfolipidi della sospensione LUV usato per la ricostituzione, così come quella dei proteoliposomi che vengono eventualmente generati, una aliquota del campione è subjeCTED all'ossidazione da acido perclorico. Questa procedura si rompe fosfolipidi per rilasciare fosfato inorganico che viene poi quantificato mediante un saggio colorimetrico in confronto con standard 23.
    1. Preparare una soluzione 40 mM magazzino di fosfato di sodio (Na 2 HPO 4) in acqua distillata deionizzata.
    2. Diluire la soluzione madre con acqua distillata deionizzata per ottenere 4 mm e 0,4 mm di soluzioni che serviranno come standard di calibrazione di lavoro.
    3. Utilizzando le soluzioni di lavoro, preparare standard in 13 provette x 100 mm 2 di vetro che vanno da 0 a 80 nmol fosfato di sodio in un volume finale di 50 pl.
    4. Prendere 10 ml ciascuno dei campioni Luv e proteoliposome da quantificare e diluire con 40 ml di DDH 2 O in 13 tubi x 100 mm 2 di vetro.
      NOTA: Poiché la concentrazione di lipidi delle luvs e proteoliposomi è nell'intervallo 2.5-5 mM, 10 microlitri del campione dovrebbe contenere 25-50 nmol lipidi fosforo.
    5. Aggiungere 300 pl di acido perclorico a ciascuno degli standard e campioni e calore per 1 ora a 145 ° C su una piastra riscaldante. Mettere marmi sui tubi per evitare l'evaporazione.
    6. Lasciate che i tubi raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere 1 ml di DDH 2 O.
    7. Aggiungere 400 ml ciascuna di appena preparato 12 g / L molibdato di ammonio e 50 g / L di ascorbato di sodio e vortex per miscelare.
    8. Calore per 10 min a 100 ° C con marmi sopra dei tubi. Rimuovere i tubi dal blocco di riscaldamento e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente.
    9. Misurare l'assorbanza dei campioni contro il (campione standard contenente 0 nmol sodio fosfato) in bianco con uno spettrometro ad una lunghezza d'onda di 797 nm.
    10. Determinare il contenuto di fosfati di campioni contro la curva standard di calibrazione.
  3. Ricostituzione di opsin
    NOTA: È necessario determinare le condizioni ottimali per la ricostituzione gonfiore quanto questi dipendono dalla natura del detergente, nonchéla composizione lipidica e la concentrazione dei luvs. Come luvs cambiano le loro proprietà di scattering di luce sul gonfiore del processo possono essere monitorati misurando l'assorbanza (figura 2), come recensito da Rigaud e Levy 24 e Geertsma et al. 25.
    1. Pipettare 800 ml di luvs (dal punto 1.1, come il recupero dei lipidi dopo l'estrusione è del 70%, la concentrazione prevista di luvs è da 3.6 mm fosfolipidi) in una provetta per microcentrifuga da 2 ml.
    2. Aggiungere 5,3 ml di tampone A e 34,7 ml di 10% (w / v) DDM disciolto in tampone A.
    3. Incubare per 3 ore a temperatura ambiente con miscelazione end-over-end.
    4. Nel frattempo preparare le perle di polistirene:
      1. Utilizzare 400 mg di perline per campione e pesare in un bicchiere di vetro.
      2. Lavare due volte con metanolo, tre volte con acqua e una volta con tampone A. Per ogni utilizzo fase di lavaggio 5 ml di liquido e mescolare lentamente per 10 minuti.
        NOTA: Si consiglia di preparare il polistireneperline per diversi campioni alla volta, ad esempio, pesano in 6 g di perline e lavare con 75 ml di liquido. perline in eccesso possono essere conservate in frigorifero per diversi giorni.
    5. Durante gli ultimi 30 min di vescicole destabilizzazione asciugare il fosfolipide NBD marcato in un tubo di vetro con tappo a vite ( 'la ricostituzione tubo di vetro'): Per esempio, 9,5 ml di NBD-PC (1 mg / ml in cloroformio, ottenendo 0,4 moli% dei fosfolipidi totali) sono a secco sotto flusso di azoto in un tubo di vetro e successivamente disciolto in 45 ml di 0,1% (w / v) DDM in tampone A.
    6. Dopo 3 h di vescicole destabilizzazione aggiungere il fosfolipide sciolto-NBD-marcato, la proteina DDM-solubilizzato e tampone A tale che il volume finale di 1 ml contiene 0,36% (w / v), cioè, 7 mM, DDM.
      1. Così, per generare liposomi privi di proteine ​​(usato come campione di controllo) aggiungere 45 ml di NBD-PC (sciolti in 0,1% DDM), 60 ml di 0,1% DDM e 55 ml di tampone A; per proteoliposomi aggiungere, per l'esamepio, 40 ml di proteine ​​(da una tipica soluzione stock di ~ 110 ng / ml) nel 0,1% DDM, 45 ml di NBD-PC (disciolti in 0,1% DDM), 20 ml di 0,1% DDM e 55 ml di tampone A .
        NOTA: L'ordine delle aggiunte deve essere come indicato.
    7. Mescolare il campione per un fine hr supplementare rispetto all'estremità a temperatura ambiente.
    8. Aggiungere 80 mg delle perle di polistirene preparato e incubare il campione con end-over-end miscelazione per 1 ora a RT.
    9. Successivo aggiungere un ulteriore 160 mg di perle di polistirene e incubare con end-over-end miscelazione per ulteriori 2 ore a RT.
    10. Trasferire il campione (lasciando le sferette di polistirene spesi dietro) in una provetta di vetro con tappo a vite contenenti 160 mg di perle di polistirene freschi e mescolare notte a 4 ° C.
      NOTA: Il modo più semplice per trasferire il campione ed evitare risucchiando perline è usare una pipetta Pasteur che viene spinto verso il fondo del tubo di vetro con una leggera pressione positiva. Una volta che la punta della pipetta è saldamente alfondo del tubo, il campione può essere estratto facilmente senza interferenze dalle perline.
    11. La mattina seguente, trasferire il campione in una provetta da microcentrifuga senza riporto di perline e posto sul ghiaccio in preparazione per il saggio di attività scramblase.

2. Scramblase Activity Assay

NOTA: L'intensità di fluorescenza di liposomi o proteoliposomi diluiti con tampone A è monitorata nel tempo dopo l'aggiunta di ditionito in uno spettrometro a fluorescenza. Per ottenere un'intensità partire stabile, la fluorescenza viene registrato per almeno 50 secondi (o fino a quando si ottiene un segnale stabile) prima di aggiungere ditionito ad un campione costantemente agitata e viene poi seguito per almeno 500 secondi dopo l'aggiunta ditionito.

  1. Aggiungere 1.950 ml di tampone A ad una cuvetta di plastica contenente un mini stir-bar.
  2. Aggiungere 50 ml di Proteo preparata (liposomi) e lasciare che il campione di equilibrare in Spectro a fluorescenzameter con agitazione costante per diversi secondi.
  3. Nel frattempo preparare una soluzione di 1 M ditionito in 0,5 M buffer Tris (ad esempio, per due campioni pesare 20 mg di ditionito in una provetta per microcentrifuga e dissolvono in 114 microlitri ghiacciata 0,5 M Tris direttamente prima dell'uso e mantenere in ghiaccio per il prossimo campione).
    NOTA: La soluzione ditionito deve essere preparata al momento e non deve essere utilizzato più di 20 minuti dopo la preparazione; se molte misurazioni devono essere effettuate, aliquote di ditionito possono essere pesati in anticipo e sciolti destra prima dell'uso.
  4. Avviare il monitoraggio a fluorescenza (eccitazione 470 nm, emissione di 530 nm, fessura di larghezza 0,5 nm).
  5. Aggiungere 40 ml di soluzione di ditionito 1 M alla cuvetta 50 sec dopo aver iniziato la fluorescenza registrazione (utilizzare il setto nel coperchio della camera cuvetta se possibile) e continuare a registrare la fluorescenza per un ulteriore 400-600 sec.
  6. Analizzare i dati come descritto nella sezione 3.

3.Analisi dei dati

  1. Cinetica di Scrambling
    1. Caratterizzare la traccia fluorescenza di ciascun campione ottenuto dal saggio di attività scramblase definendo fluorescenza iniziale, F i, prima di aggiungere ditionito, e la fluorescenza end-point, F, raggiunta dopo> 400 sec. F i è determinato per ogni campione come il valore medio della fluorescenza per il periodo di 30 sec prima dell'aggiunta ditionito.
    2. Determinare i dati end-point corrispondente alla misura della riduzione di fluorescenza, R = 100 • F / F i. Usiamo i termini R L per liposomi senza proteine ​​e R P per proteoliposomi opsin contenenti.
  2. Determinare il peso molecolare del Funzionalmente ricostituito Scramblase
    1. Convertire i dati di riduzione di fluorescenza secondo la seguente equazione:
      p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R max - R L) (Equazione 1)
      NOTA: Dove R max è la massima riduzione che si ottiene quando la proteina sufficiente ricostituito tale che tutti vescicole nel campione possiedono almeno un scramblase funzionali, e p è la probabilità che una particolare vescicole in un campione ricostituito viene 'scramblase-active', cioè, possiede almeno un scramblase funzionale. Il valore di R L è tipicamente 45% 3 mentre R max è tipicamente 82,5% 3, anziché il previsto 100% (R può essere determinata sperimentalmente per proteoliposomi opsin con PPR> 1 mg / mmol max). Come R max <100% si assume che una sotto-popolazione di vescicole refrattaria alla ricostituzione. Per R max = 82,5%, la frazione di vescicole che è in grado di accettare proteina è 0.35.
    2. Descrivere la relazione tra p (≥1 scramblase) e PPR (mg di proteina / mmol fosfolipidi) dalle statistiche Poisson come segue:
      p (≥1 scramblase) = 1 - e NOTA: Dove m = numero di scramblases per vescicole e α = mono-esponenziale costante adattamento in unità di mg fosfolipidi proteine ​​/ mmol.
    3. Come una frazione delle vescicole non contribuisce a scrambling anche ad alte PPR (vedi la discussione), modificare l'equazione:
      p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Equazione 3)
      NOTA: Dove PPR * = PPR / (1- f), dove f è la popolazione refrattaria di vescicole o, in questo caso, PPR * = PPR / 0.65 (Equazione 4).
      NOTA: L'adattamento α costante è determinata inserendo un grafico di p (≥1 scramblase) rispetto PPR * con funzione mono-esponenziale. Se opsina (peso molecolare 41,7 kDa) ricostituisce funzionalmente in vescicole 175-nm di diametro (ogni vescicola ha 280.000 fosfolipidi 26) come monomero, a = 0,187 mg mmol -1. Se opsina dimerizza prima della ricostituzione 3 per produrre vescicole scramblase-attivo, allora α= 0,37 mg mmol -1. Se PPR piuttosto che PPR * dovevano essere utilizzati per l'analisi, quindi i corrispondenti valori alfa sarebbero 0,122 e 0,244 mg mmol -1. Questi valori previsti per α per scontato che tutte le molecole opsin sono funzionalmente competente. Se solo una frazione delle molecole è competente per rimescolare i lipidi, allora i corrispondenti valori di α sarà maggiore.

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Representative Results

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Descriviamo la ricostituzione di opsin in luvs per caratterizzare la propria attività scramblase usando un test basato sulla fluorescenza. Analizziamo i risultati di porre un limite inferiore del tasso di fosfolipidi opsin mediata scomposizione e per determinare lo stato oligomerico in cui opsin ricostituisce funzionalmente nelle vescicole.

Per identificare le condizioni ottimali di ricostituzione, è necessario determinare empiricamente la quantità di detersivo che deve essere utilizzato per gonfiare i luvs modo che siano ricettivi all'inserimento proteine. Tale esperimento è illustrata in Figura 2A. Aliquote di POPC: luvs POPG sono trattati con diverse quantità di DDM per 3 ore e l'assorbanza del campione è misurata a 540 nm, una misura di torbidità e quindi di dimensioni vescicole. La densità ottica misurata a 540 nm (OD 540) grafico mostra che le vescicole gonfiano come DDM Conczione è aumentato da 4-6 mm, raggiungere un punto di saturazione a circa 7 mM prima di iniziare a solubilizzare (corrispondente alla perdita di torbidità e OD 540 segnale) come DDM è ulteriormente aumentata. NBD-PC è aggiunto dopo il trattamento detergente e campioni sono ulteriormente incubati per un'ora prima di essere trattati con perle di polistirene per rimuovere detergente. La distribuzione transbilayer di NBD-PC è determinata misurando la perdita di fluorescenza dopo l'aggiunta ditionito alle vescicole (come descritto sopra). Così, NBD-PC inserisce nel foglietto esterno di vescicole in assenza di detersivo, indicata dalla sua completa accessibilità ditionito. Per vescicole trattati con> 2 mM DDM, NBD-PC è in grado di distribuire simmetricamente in entrambi i volantini modo che una volta DDM è stato rimosso il 50% del NBD-PC è protetto da ditionito.

La figura 2B mostra un esperimento di destabilizzazione-ricostituzione simile (ridisegnato da riferimento 2 </ Sup>), questa volta il tracciamento della ricostituzione del opsin. In questo esperimento si può notare che il 7 mM DDM è necessario per la ricostituzione opsin tale che NBD-PC diventa quantitativamente (> 80%) accessibili a ditionito come risultato di opsin mediata scrambling.

figura 2
Figura 2:. Ricostituzione NBD-PC e opsin in vescicole detergenti-destabilizzato (A) Aliquote delle vescicole sono trattati con un intervallo di concentrazioni detergenti (0-9 mM) mescolando end-over-end per 3 ore a temperatura ambiente . Al termine del periodo di incubazione l'assorbanza dei campioni a 540 nm viene misurata (linea nera). NBD-PC (sciolti in 0,1% w / v DDM) viene quindi aggiunta e il campione viene incubato per un ulteriore 1 ora a temperatura ambiente prima che il detergente viene rimosso mediante trattamento perle di polistirene. I liposomi risultanti vengono analizzati dal fluor saggio riduzione escent (linea rossa) per determinare la misura in cui NBD-PC è simmetricamente ricostituito. (B) Come in (A), ma in questo esperimento vescicole formate da fosfolipidi uova (egg PC / uovo fosfatico, 9: 1 mol / mol) sono stati destabilizzato con DDM e opsin stato aggiunto insieme con NBD-PC, con un conseguente riduzione di fluorescenza di circa 80% dopo la proteina è efficacemente ricostituito e in grado di facilitare scrambling di NBD-PC (modificato dal riferimento 2). Sebbene NBD-PC è simmetricamente ricostituita a 2 mM DDM, le condizioni ideali per la ricostituzione opsin stati scelti attorno al picco di OD 540 assorbanza, cioè il punto in cui le vescicole erano altamente gonfio a causa di detersivo intercalato ma non ancora solubilizzato (indicato dal freccia). Per POPC / POPG (9: 1 mol / mol) vescicole, una concentrazione DDM di 8 mm è risultato essere ottimale sia per NBD-PC e opsin ricostituzione./54635/54635fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

La misura della riduzione di fluorescenza aumenta con la quantità di opsin usato per la ricostituzione. La figura 3A mostra tracce di fluorescenza ottenuti sull'aggiunta di ditionito di NBD-PC contenente liposomi privi di proteine ​​(traccia nera) e proteoliposomi ricostituiti con opsin a proteine ​​diverso da rapporti di fosfolipidi (PPR, in unità di mg di proteina per mmol fosfolipidi, tracce di rosso); le tracce sono state normalizzate in modo che tutti hanno la stessa fluorescenza iniziale (F i) il valore per facilitare la visualizzazione. adatta monoesponenziale delle tracce indicano molto simili costanti di tempo, che vanno dal 20-25 sec; come il tasso di riduzione NBD-PC ditionito mediata in liposomi privi di proteine ​​è la stessa nelle proteoliposomi, è solo possibile inserire una stima più bassa sul tasso di opsin mediata scrambling (vedi text per maggiori dettagli). La Figura 3B mostra i dati analizzati ottenuti dai test di riduzione di fluorescenza da cedere appezzamenti di p (≥1) scramblase (la probabilità di una vescicola avente almeno un scramblase) rispetto al PPR misurata sperimentalmente (relative al PPR * come discusso sopra). Il confronto del fit monoesponenziale dei risultati sperimentali in ipotetici attacchi corrispondenti a opsin essere ricostituita come uno spettacolo di monomero, dimero o tetramero che opsin ricostituisce funzionalmente come un dimero.

Figura 3
Figura 3:. Attività Scramblase di opsin tracce (A) fluorescenza corrispondenti a ditionito trattamento delle vescicole ricostituite con NBD-PC e opsin importi compresi tra 0-4,95 mg, indicato con il cuneo. La quantità più bassa di opsin ricostituito corrisponde ad un regime di collocamento di 0,21 mg / mmol lasecondo importo più alto di 0,43 mg / mmol e la più alta quantità di 1,3 mg / mmol, o 10 opsine per vescicola in media. Ditionito stato aggiunto al momento indicato (freccia) e NBD fluorescenza è stata monitorata per altri 400 sec. La misura massima della riduzione di fluorescenza visto in questo esperimento è stato dell'85% mentre la media nel corso di molti esperimenti è 82,5%. (B) la dipendenza delle proteine ​​di scrambling. I dati provenienti da esperimenti simili a pannello A sono stati analizzati utilizzando statistica di Poisson per generare un grafico della probabilità di vescicole aventi almeno un scramblase (p ≥1 scramblase) contro la proteina rapporto fosfolipidi (PPR) delle vescicole (proteina è stata quantificata post- ricostituzione mediante analisi Western Blot 3 e fosfolipidi è stato determinato misurando il fosfato inorganico rilasciato per idrolisi acida). La linea rossa rappresenta una misura mono-esponenziale per i dati; le linee grigie tratteggiate rappresentano adatta mono-esponenziale per la ricostituzione di opsin in 170 nm di diametro vesicles come monomeri, dimeri preformate o tetrameri preformati. Come l'asse x rappresenta il PPR misurata sperimentalmente (piuttosto che PPR * (vedi testo principale)), le costanti fit corrispondono a PPR, piuttosto che PPR * valori, come discusso nel testo principale. Cliccate qui per vedere una versione più grande questa figura.

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Il saggio di attività scramblase ci ha permesso inizialmente di determinare che opsin ha fosfolipidi attività scramblase 2. Il test ha anche permesso di caratterizzare l'attività scramblase di opsin testando specificità (abbiamo usato una varietà di lipidi giornalista NBD-etichettati come NBD-fosfatidiletanolamina, marcato con NBD su una catena acilica come mostrato ad NBD-PC in Figura 1A, o headgroup, NBD-sfingomielina o NBD- fosfatidilserina 2), l'effetto di vescicole composizione lipidica (ad esempio, colesterolo a diverse quantità come vescicole costituente), e se i diversi stati conformazionali opsina e rodopsina attività tutti mostrano scramblase. Queste analisi hanno rivelato che l'attività scramblase di rodopsina è molto veloce (> 10.000 fosfolipidi al secondo), non specifico per il fosfolipide e indipendente dello stato conformazionale della rodopsina o se contiene il suo cromoforo retinale 2,3 o meno. Qui,abbiamo presentato un metodo dettagliato per generare proteoliposomi contenenti opsina e mostrato come saggio di queste preparazioni per l'attività scramblasi.

Il protocollo ricostituzione descritto è ottimizzato per una data composizione lipidica e per la ricostituzione opsin dopo che è stato purificato mediante cromatografia di affinità utilizzando DDM come solubilizzante detergente. La composizione lipidica nonché il detergente può essere modificato secondo le esigenze dello sperimentatore, anche se le condizioni di ricostituzione ideali per mutate condizioni devono essere determinato eseguendo la "rigonfiamento-esperimento" descritto nella figura 2. DDM è empiricamente ben adatto per mantenere opsin in condizioni stabili e attivi. Tuttavia, altri detergenti come ottil-β-glucoside, CHAPS o Triton X-100 possono essere utilizzati seguendo protocolli simili. Triton X-100 è un detergente ampiamente utilizzato per la ricostituzione trasportatori ATP-binding cassette (ABC) trasportatori come il suo efficieNCY nella mediazione ricostituzione membrana è superiore a quello di altri detergenti e ci vuole anche meno tempo per equilibrare con liposomi preformati 24.

È possibile determinare lo stato oligomerico del opsin funzionalmente ricostituito se si ottiene il grado di riduzione fluorescente per campioni ricostituiti con diverse quantità di opsin, cioè, su una gamma di proteine ​​per rapporti fosfolipidi (PPRS). Per fare questo, il PPR delle vescicole ricostituite deve essere esplicitamente misurato come recupero di proteine ​​e fosfolipidi possono variare. recupero fosfolipidi può essere determinata mediante il saggio di fosfato descritto nella sezione 1.2, mentre il recupero di proteine ​​può essere stimato mediante analisi quantitativa Western Blot in cui le proteine ​​purificate utilizzate per ricostruzioni vengono utilizzati per generare una curva di calibrazione che permette il confronto al recupero dei campioni ricostituiti tutti la gamma PPR testato (come spiegato in dettaglio in riferimento 3).

Il saggio di attività scramblase è costruito sul presupposto che ditionito non permeare nelle vescicole. Questo punto può essere verificato intrappolando un reporter NBD marcato solubili all'interno delle vescicole e determinare se può essere ridotta di ditionito. A questo scopo, NBD-glucosio (12.6 mM aggiunti dopo vescicole destabilizzazione) si utilizza invece NBD-PC. Questa molecola solubile in acqua è intrappolato all'interno delle proteoliposomi una volta che le vescicole sono sigillate e devono quindi essere protetti da ditionito. Per rendere il NBD-glucosio completamente accessibile per la riduzione, Triton X-100 può essere aggiunto (1% w / v), che si traduce poi in riduzione del 100% 3,27.

I proteoliposomi possono essere caratterizzati per verificare che la ricostituzione sia della lipidi e proteine ​​giornalista è simmetrica. Il primo è raggiunto mediante esperimenti di tempra collisionali utilizzando ioni ioduro mentre il secondo si basa su una strategia di protezione proteasi usando ASPN proteasi chetaglia in un sito specifico vicino al C-terminale della opsin 3.

Il passaggio dalla fluorescenza iniziale (F i) determinato saggio di attività scramblase al punto finale di fluorescenza (F) è complessa, ma per i nostri scopi si può ragionevolmente approssimato da una singola funzione di decadimento esponenziale. La costante di tempo associata al decadimento esponenziale (20 sec) è più o meno lo stesso per liposomi inattivi e, proteoliposomi opsin contenenti attivi che indicano che rimescolando si verifica più veloce, o più veloce rispetto alla velocità con cui il fluoroforo NBD si riduce di ditionito. Così il saggio di attività scramblase ha una risoluzione di tempo povero (limitata dalla ditionito chimica riduzione) che consente attualmente solo classificazione dei mutanti in attivo, molto lento o inattivo. Questa classificazione potrebbe essere visto per la scramblase calcio-regolate TMEM16 27: ad alti Ca 2+ livelli, il decadimento di fluorescenza ha rivelato una costante di tempo simile a that visto in liposomi libera di proteine, che indica che il fattore limitante è la riduzione chimica del NBD-fluoroforo da ditionito di lipidi scrambling. Al contrario, a bassi Ca 2+ livelli allo stato stazionario della riduzione fluorescente non è stato raggiunto dopo 900 sec, rendendo possibile distinguere tra due componenti cinetici, quello assegnato alla riduzione ditionito del foglietto esterno e quello più lento all'esposizione di NBD-lipidi interni-volantino verso l'esterno.

La discrepanza tra il predetto perdita 100% della fluorescenza sul ditionito trattamento delle vescicole preparati con alta PPR (Figura 1C) rispetto alla realtà sperimentale in cui è difficile superare ~ riduzione del 85% (Figura 3A) suggerisce che una frazione delle vescicole refrattaria della ricostituzione. Questa frazione potrebbe corrispondere a vescicole che sigillo presto durante la procedura di ricostituzione come detergente viene assorbito per le perle di polistirene e sonoquindi più in grado di ricevere proteine. Per l'analisi di cui al punto 3, abbiamo ipotizzato che questa popolazione refrattaria corrisponde ad una frazione F del totale delle vescicole. Se assumiamo che la metà delle molecole NBD-PC (il pool di NBD-PC nel foglietto esterno) nelle vescicole refrattari è disponibile per ditionito di riduzione, quindi si stima f = 2 • (1 - R max / 100), o 0.35 quando R max = 82,5%.

Lato di p (≥1 scramblase) rispetto PPR * dati con una equazione mono-esponenziale fornisce l'α costante forma, da cui è possibile determinare se opsin ricostituisce funzionalmente come monomero o dimero, o una miscela di stati inclusi multimeri ordine superiore . L'interpretazione di questi risultati si complica se una frazione di molecole opsin non può funzionare in scrambling. Mentre questo è improbabile date le condizioni in cui si purifica opsin che devono garantire che mantiene tutta la sua proteina Gattività del recettore, un valore di α corrispondente all'inserimento funzionale dei dimeri potrebbero anche essere interpretate come l'inserimento funzionale di monomeri da una preparazione di opsin dove metà delle proteine ​​sono inattivi come scramblases. Un altro punto da considerare è che l'analisi che presentiamo presuppone che le vescicole utilizzati per la ricostituzione sono omogenei dimensioni. In realtà, le vescicole hanno una gamma di diametri caratterizzati da una distribuzione gaussiana con una deviazione standard pari a circa un terzo del diametro medio. Fortunatamente, il risultato dell'analisi di p (≥1 scramblase) rispetto PPR * dati non è significativamente influenzato dalla considerazione di vescicole eterogeneità e quindi la semplice analisi che abbiamo presentato è sufficiente a descrivere i dati.

Un potenziale limitazione dei metodi che abbiamo descritto è che la procedura intensità di lavoro non consente misurazioni ad elevata capacità di un elevato numero di campioni di unND che vescicole eterogeneità potrebbe disturbare la lettura. Il primo problema può essere superato utilizzando un formato micropiastra piastra per il saggio scramblase; il secondo potrebbe essere risolto in futuro da saggi di vescicole singoli usando la microscopia TIRF.

Il test per la misurazione dell'attività ditionito scramblase può essere considerato molto affidabile e robusto volta procedure destabilizzazione e ricostituzione sono stabiliti. Un approccio alternativo per quantificare il trasporto transmembrana di fosfolipidi, che permette anche di verificare i risultati ottenuti dal test ditionito, è tornato estrazione di catena corta NBD-lipidi dal foglietto esterno delle vescicole usando grassi bovina privi di acido albumina sierica 22. Back-estrazione e dosaggio ditionito sono stati anche impiegati per caratterizzare e identificare flippases delle ATPasi P4 tipo e trasportatori ABC 28-33.

Come gli strumenti qui presentati possono essere facilmente adattati in base alle different bisogno le procedure descritte sono versatili e vi aiuterà a identificare e caratterizzare scramblases fosfolipidi in futuro. Apprendimento l'identità di molti di questi, compresa quella del scramblase necessaria per l'espansione delle membrane biogene durante la crescita cellulare è della massima importanza fisiologica.

Per ulteriori informazioni e la descrizione dettagliata di analisi dei dati, si rimanda alle pubblicazioni precedenti dal nostro laboratorio 2-4,27 così come gli altri 22,25,28,30.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 ml extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 ml Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

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References

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Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity
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Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).More

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

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