Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности

doi: 10.3791/54635 Published: September 20, 2016

Abstract

Scramblases транслокации фосфолипидов поперек мембраны бислой двунаправленным в АТФ-независимым способом. Первый scramblase быть идентифицированы и проверены биохимически был Opsin, апопротеина фоторецептора родопсина. Родопсин является G-белком рецептор локализован в стержень фоторецепторов дисковые мембраны сетчатки, где он отвечает за восприятие света. Scramblase деятельность родопсина не зависит от его лиганда 11- цис - -retinal, т.е. апопротеинового опсина также активен как scramblase. Хотя конститутивный и регулируется фосфолипид скремблирования играют важную роль в клеточной физиологии, лишь несколько фосфолипидов scramblases были определены до сих пор, кроме опсином. Здесь мы опишем флуоресцентного анализа на основе из scramblase активности Opsin в. Opsin восстанавливали в большие однослойные липосомы, состоящие из фосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и следовые количества флуоресцентного НБД-меченых ПК (1-рalmitoyl-2- {6- [7-нитро-2-1,3-benzoxadiazole-4-ил) амино] гексаноил} - зп глицеро-3-фосфохолин). Scramblase активность определяют путем измерения степени, в которой молекулы НБД-PC, расположенные во внутреннем листке везикулы способны получить доступ к наружной листовку, где их флуоресценции химически устранен с помощью восстанавливающего агента, который не может пересекать мембрану. Методы, описанные нами находит широкое применение и могут быть использованы для идентификации и характеристики scramblase деятельности других мембранных белков.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Фоторецепторов родопсин, прототипическим G-белком рецептор (рассмотрен, например , в ссылке 1), является первым фосфолипид scramblase быть идентифицированы и биохимически проверено 2,3. Scramblases являются фосфолипидов транспортеров , которые увеличивают внутренне медленную скорость transbilayer фосфолипидов движения физиологически соответствующих уровней в двунаправленной, АТФ-независимым способом 4-6. Примерами их действий могут быть найдены в эндоплазматический ретикулум и бактериальной цитоплазматической мембраны , где конститутивным скремблирования необходим для мембранного гомеостаза и роста, а также для различных путей гликозилирования 5. Регулируемый фосфолипид скремблирование необходимо подвергать фосфатидилсерина (PS) на поверхности апоптотических клеток , где он действует как "съесть-меня" -сигнала для макрофагов 7 и обеспечивает поверхность прокоагулянтную на активированных тромбоцитах , чтобы катализировать образование фактора белкаы необходимы для свертывания крови. В фоторецепторов дисковых мембран, карабкаясь активность родопсина была предложено , чтобы противодействовать фосфолипидов дисбаланс между двумя мембранами листков бислоя , который генерируется АТФ-зависимый, однонаправленного липида флиппазы abca4 4,8,9 10-12.

Несмотря на Физиологическое значение scramblases, их идентичность остаются неясными до родопсина не сообщалось как scramblase в фоторецепторных дисков 2, были идентифицированы членами семейства белков TMEM16 , как Са 2+ -зависимые scramblases , необходимые для облучения PS в плазматической мембране (обзор в ссылке 13), и бактериальный белок FtsW был предложен как липид II scramblase требуется для синтеза пептидогликана 14. Эти открытия были основаны на восстановлении очищенных белков в липосомы и демонстрации scramblase активности в результате протеолипосом с использованием методологии describред здесь. Другие потенциальные scramblases 15-21 - эти белки MurJ и Amj замешанные в пептидогликана биосинтеза, WzxE и родственные белки участвуют в скремблирования O-антиген предшественников, ФЗПНМ белков необходимо для транслоцироваться аминоацилирована фосфатидилглицерин через цитоплазматическую мембрану бактериальной, и члены семьи Xkr8 , которые были предложены выставить PS на поверхности апоптотических клеток - остаются для тестирования биохимически. Это подчеркивает важность надежного анализа, чтобы определить и охарактеризовать scramblase активность.

Здесь мы описываем воссоздание очищенного опсином, апопротеина фоторецептора родопсина, в большие однослойные везикулы (БУВ), и последующий анализ scramblase активности в результате протеолипосом с использованием флуоресцентного анализа на основе. Есть несколько хорошо описанных протоколов, доступных в литературе для гетерологичной экспрессии и очистки опсином, поэтому мы не будемописать его в этом протоколе; мы используем протоколов , описанных в Горен и др. 3 , который дает ФЛАГ-меченый, термостабильный опсина при температуре около 100 нг / мкл в 0,1% (вес / объем) dodecylmaltoside (ДДМ).

Разбавление достигается путем обработки БУВ с достаточным моющим средством таким образом, что они набухают, но не растворяются. В этих условиях, мембранный белок - поставляется в виде белково-детергентных мицелл - интегрирует в липосомы и стать восстанавливали в липосомальной мембраны при удалении моющего средства, в результате чего протеолипосомах. Для того, чтобы восстановить опсином (полученный в виде очищенного белка в 0,1% (вес / об) DDM), БУВ получают из смеси РОРС (1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин) и POPG (1- пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3- [фосфо-рац- (1-глицерин)]) и насыщали DDM перед добавлением опсином и NBD-PC. Моющее средство удаляют путем обработки образца с полистирольных шариков.

деваха = "jove_content"> Принцип , лежащий в основе флуоресцентного анализа на основе показана на рисунке 1В. БУВ симметрично разведен с помощью микроскопического количества NBD-PC или другого НБД-меченого флуоресцентной фосфолипидного репортера (Рис . 1А) При добавлении дитионита, мембраносвязанным impermeant дианион, молекулы НБД-ПК в наружном листке БУВ оказываются нефлуоресцирующего как нитро-группой NBD сводится к нефлуоресцентном амино-группы. Поскольку ни молекулы НБД-PC, ни дитионит способны проходить через мембрану, на временной шкале эксперимента (<10 мин), это приводит к уменьшению на 50 флуоресцентного сигнала%. Тем не менее, если липосомы разведен с помощью scramblase, молекулы НБД-ПК во внутреннем листке может быстро вскарабкаться к внешней стороне, где они уменьшаются. Это приводит к полной потере флуоресценции в идеальном случае (рис 1C).

эс / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. Рисунок 1: Схематическое изображение анализа scramblase активности Анализ используется люминесцентная NBD-меченых репортер липида; НБД-ПК показан (А). Большие однослойные везикулы восстанавливали микроскопического количества NBD-PC. Разбавление производит симметричные везикул, с НБД-PC распределенной равномерно во внешних и внутренних листков. Дитионит (S 2 O 4 2-) химически уменьшает нитро-группу NBD к нефлуоресцентном амино-группы. Лечение безбелковых липосом с дитионита (B, вверху) приводит к снижению на 50% от флуоресценции , так как только молекулы НБД-ПК в наружной листовке снижаются: дитионит отрицательно заряженными и не могут пересекать мембрану , чтобы вступать в реакцию с молекулами НБД-PC во внутреннем листке. Дитионит лечение Opsin содержащих протеолипосом (B, внизу), т.е. scramblase-активных протеолипосомы, приводит к 100% потере еluorescence, как опсином облегчает перемещение НБД-PC между внутренним и наружным листком. (С) показывает идеализированные флуоресценции следы , полученные на лечении небелковых липосом и Opsin содержащих Протеолипосомы с дитионита. Скорость потери флуоресцентной одинакова в обоих случаях, указывающих, что химическое восстановление NBD дитионитом является ограничивающим скорость, и что скремблирования происходит со скоростью, равной или большей, чем скорость химической реакции. Следы , полученные от фактического эксперимента показаны на рисунке 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Методы , описанные нами могут быть использованы для восстановления и пробирного другие очищенные белки, а также их смеси мембранных белков , полученных, например, путем экстракции микросом с помощью моющих средств 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Получение липосом, и протеолипосомах

  1. липосом Формирование
    1. С помощью стеклянного шприца, добавьте 1,435 мкл POPC (25 мг / мл, в хлороформе) и 160 мкл POPG (25 мг / мл, в хлороформе), в круглодонную колбу, чтобы получить 52,5 мкмоль липидов в мольном соотношении РОРС: POPG = 9: 1.
    2. Сухие липиды в течение 30 мин с помощью роторного испарителя при скорости вращения 145 оборотов в минуту (без воды ванны не требуется для этого объема растворителя), а затем перенести колбу на вакуумном эксикаторе в течение по меньшей мере 3 ч или в течение ночи при комнатной температуре (RT).
    3. Увлажняют высушенную липидную пленку с 10 мл 50 мМ HEPES рН 7,4, 100 мМ NaCl (далее упоминаемый в качестве буфера А) путем осторожно взбалтывая колбу до получения однородной, мутная результаты подвески;
      Примечание: Концентрация липида на данном этапе, как ожидается, будет 5,25 мМ, как без потерь не должно иметь место до сих пор.
    4. Разрушать ультразвуком суспензию в водяной бане в течение 10 мин при комнатной температуре с частотой OF 40 кГц. Решение будет выглядеть несколько яснее.
    5. С помощью экструдера, Суспензию пропускали 10 раз через мембрану с размером пор 400 в нм, за которым следует второй цикл экструзии с 4 проходит через мембрану с размером пор 200 нм.
      Примечание: Средний диаметр полученных БУВ составляет ~ 175 нм. При необходимости, размер и однородность БУВ можно проверить с помощью динамического рассеяния света в соответствии с инструкциями изготовителя.
    6. Количественная фосфолипидов концентрацию LUV суспензии, как описано в разделе 1.2).
      Примечание: Из-за потерь во время экструзии, концентрация, как правило, около 3,6 мМ.
    7. Хранить БУВ при температуре 4 ° С в течение приблизительно 2 недель, если не использовать сразу.
  2. фосфолипидов Количественное
    Примечание: Для определения фосфолипидной концентрации LUV суспензии, используемой для восстановления, а также, что из протеолипосомах, которые в конечном счете сгенерированных аликвоту образца Тематические ссылкиИДКТК окисления хлорной кислотой. Эта процедура разрушает фосфолипиды выпустить неорганического фосфата , который затем определяют количественно с помощью колориметрического анализа по сравнению со стандартами 23.
    1. Готовят 40 мМ исходного раствора фосфата натрия (Na 2 HPO 4) в деионизованной дистиллированной воде.
    2. Развести маточного раствора деионизированной дистиллированной водой, чтобы получить 4 мМ и 0,4 мМ рабочие растворы, которые будут служить в качестве калибровочных стандартов.
    3. Использование рабочих растворов следует подготовить стандарты в 13 х 100 мм 2 стеклянные трубки в диапазоне от 0 до 80 нмоль фосфата натрия в конечном объеме 50 мкл.
    4. Взять по 10 мкл каждого из LUV и proteoliposome проб должны быть определены количественно и разбавляют 40 мкл DDH 2 O в 13 х 100 мм 2 стеклянные трубки.
      Примечание: По мере того как концентрация липидов в БУВ и протеолипосомах находится в диапазоне 2,5-5 мкм, 10 мкл образца должен содержать 25-50 нмоль липидного фосфора.
    5. Добавьте 300 мкл хлорной кислоты к каждому из стандартов и образцов и высокой температуре в течение 1 ч при 145 ° С в нагревательном блоке. Поместите шарики на трубы, чтобы предотвратить испарение.
    6. Пусть трубы охлаждают до комнатной температуры и добавляют 1 мл DDH 2 O.
    7. Добавьте 400 мкл каждого из свежеприготовленного 12 г / л молибдата аммония и 50 г / л аскорбата натрия и вихревые перемешать.
    8. Тепло в течение 10 мин при 100 ° C с шариками в верхней части пробирки. Удалить труб из нагревательного блока и дайте им остыть до комнатной температуры.
    9. Измеряют поглощение образцов против заготовки (стандартного образца, содержащего 0 нмоль фосфата натрия) с помощью спектрометра при длине волны 797 нм.
    10. Определить содержание фосфатов образцов по отношению к стандартной кривой калибровки.
  3. Воссоздание Opsin
    Примечание: Необходимо, чтобы определить оптимальные условия припухлость восстановления, поскольку они зависят от природы моющего средства, а такжев качестве липидной композиции и концентрации БУВ. Как БУВ изменяют свои свойства рассеяния света на отечность процесс можно контролировать путем измерения оптической плотности (рисунок 2), рассмотренный Риго и Леви 24 и Geertsma и др. 25.
    1. Пипетка 800 мкл БУВ (из раздела 1.1; а восстановление липидного после экструзии составляет 70%, ожидаемая концентрация БУВ составляет 3,6 мМ фосфолипидов) в пробирке 2 мл.
    2. Добавить 5,3 мкл буфера А и 34,7 мкл 10% (вес / объем) ДДМ, растворенного в буфере А.
    3. Выдержите в течение 3 ч при комнатной температуре с конечным над уровнем конца перемешивания.
    4. В то же время подготовить полистирольные шарики:
      1. Используйте 400 мг шариков на образец и взвесить их в стеклянном стакане.
      2. Промыть их дважды с метанолом, три раза водой и один раз буфером A. Для каждого шага использования промывной 5 мл жидкости и медленно перемешивать в течение 10 мин.
        Примечание: Рекомендуется подготовить полистиролшарики для нескольких образцов одновременно, например, весят в 6 г гранул и промывают 75 мл жидкости. Избыточные шарики можно хранить в холодильнике в течение нескольких дней.
    5. В течение последних 30 мин везикул дестабилизацию просушить НБД-меченного фосфолипида в шнековом-колпачок стеклянной трубки ( 'восстановление стеклянная трубка'): на одну пробу, 9,5 мкл НБД-PC (1 мг / мл в хлороформе, получа 0,4 моль% от общего количества фосфолипидов) сушат под струей азота в стеклянной трубке, а затем растворяли в 45 мкл 0,1% (вес / об) DDM в буфере А.
    6. После 3 ч везикул дестабилизацию добавить растворенный-НБД-меченного фосфолипида РГМ-растворимый белок и буфер А так, чтобы конечный объем 1 мл содержит 0,36% (вес / объем), то есть, 7 мМ, ДДМ.
      1. Таким образом, чтобы генерировать небелковых липосом (используемые в качестве контрольного образца) добавляют 45 мкл НБД-PC (растворенного в 0,1% DDM), 60 мкл 0,1% DDM и 55 мкл буфера А; для протеолипосом добавить, для экзаменаPLE, 40 мкл белка (от типичного исходного раствора ~ 110 нг / мкл) в 0,1% DDM, 45 мкл НБД-PC (растворенного в 0,1% DDM), 20 мкл 0,1% DDM и 55 мкл буфера А ,
        Примечание: Порядок добавления должны быть в списке.
    7. Перемешивают образец еще в течение конца ч в течение конца при комнатной температуре.
    8. Добавляют 80 мг приготовленных гранул полистирола и инкубирование образца с конечным над уровнем конца перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре.
    9. Затем добавить еще 160 мг гранул полистирола и инкубировать с концом поверх конца перемешивание еще в течение 2 ч при комнатной температуре.
    10. Переносят образец (оставляя затраченные полистирольные шарики позади) к стеклянному с завинчивающейся крышкой пробирку, содержащую 160 мг свежего гранул полистирола и перемешать в течение ночи при температуре 4 ° С.
      Примечание: Самый простой способ переноса образца и избежать поглощая бусинок использовать пипетку Пастера, который нажимается на нижней части стеклянной трубки с небольшим положительным давлением. После того, как кончик пипетки твердо нанижней части трубы, затем образец может быть легко снята без помех со стороны бортов.
    11. На следующее утро, перенести образец в пробирке без переноса бусы и место на льду в рамках подготовки к пробе scramblase активности.

2. Scramblase Анализ активности

Примечание: Интенсивность флуоресценции липосом или протеолипосомах разбавлены буфером А контролируется с течением времени при добавлении дитионита в флуоресцентном спектрометре. Для получения стабильной начальную интенсивность флуоресценции регистрируется в течение по крайней мере 50 секунд (или до тех пор, стабильный сигнал не будет достигнуто) перед добавлением дитионита к образцу непрерывно перемешивают и затем следует по крайней мере, 500 сек после добавления дитионит.

  1. Добавьте 1950 мкл буфера А на пластиковую кювету, содержащую мини-бар перемешайте.
  2. Добавляют 50 мкл приготовленной Proteo (липосом), и пусть образец уравновешиваться в флуоресцентном спектрометр при постоянном перемешивании в течение нескольких секунд.
  3. В то же время приготовить раствор 1 М дитионита в 0,5 М небуферизованном Трис (например, для двух образцов отвешивают 20 мг дитионита в пробирке и растворяют в 114 мкл охлажденного на льду 0,5 М Трис непосредственно перед использованием и хранить на льду в течение следующего образец).
    Примечание: дитионит раствор должен быть подготовлен свеже и не должно быть использовано более чем через 20 мин после приготовления; если много измерений должны быть сделаны, аликвоты дитионита могут быть взвешены заранее и растворяют непосредственно перед использованием.
  4. Запустите мониторинг флуоресценции (возбуждение 470 нм, эмиссия 530 нм, ширина щели 0,5 нм).
  5. Добавьте 40 мкл 1 М раствора дитионита в кювету 50 сек после начала флуоресценцию съемки (с использованием перегородку в крышке камеры кювета если это возможно) и продолжают регистрировать флуоресценцию в течение еще 400-600 сек.
  6. Анализ данных, как описано в разделе 3.

3.Анализ данных

  1. Кинетика Scrambling
    1. Охарактеризуйте флуоресценции след каждого образца , полученного с помощью анализа scramblase активности путем определения начального флюоресценции, F I, перед добавлением дитионита, а конечная точка флюоресценции, F, достигается после того, как > 400 сек. F I определяется для каждого образца как среднее значение флуоресценции , за период 30 сек перед добавлением дитионита.
    2. Определить данные конечной точки , соответствующие степени восстановления флуоресценции, R = 100 • F / F я. Мы используем термины R L для безбелковых липосом и R P для Opsin содержащих протеолипосом.
  2. Определение молекулярной массой Функционально Scramblase восстановленного
    1. Преобразование данных по уменьшению флуоресценции в соответствии со следующим уравнением:
      р (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R макс - R L) (уравнение 1)
      ЗАМЕТКА: Где R макс является максимальное сокращение, которое получается , когда достаточное количество белка восстанавливали таким образом, что все пузырьки в образце обладают , по меньшей мере , одну функциональную scramblase, и р есть вероятность того, что конкретный везикул в реконструированном образце 'scramblase-активный », то есть он обладает , по меньшей мере , одной функциональной scramblase. Значение R L , как правило , 45% , тогда как 3 R Макс , как правило , 82,5% 3, вместо ожидаемого 100% (R макс может быть определено экспериментально для опсином протеолипосомах с ППР> 1 мг / ммоль). Как R макс <100% предполагается , что субпопуляции везикул является невосприимчивой к восстановления. Для R макс = 82,5%, доля везикул , что не может принять белок 0,35.
    2. Опишите связь между р (≥1 scramblase) и ППР (мг белка / ммоль фосфолипидов) по статистике Пуассона следующим образом:
      р (≥1 scramblase) = 1 - е ПРИМЕЧАНИЕ: Если м = количество scramblases на пузырьке, а = моно-экспоненциальной подгонки постоянной в единицах мг белка / ммоль фосфолипидов.
    3. Поскольку доля везикул не способствует карабкаться даже при высокой PPR (обсуждение см), изменить уравнение к:
      р (≥1 scramblase) = 1 - ехр (-PPR * / α) (уравнение 3)
      Примечание: Там , где ППР = ППР / (1- е), где F является огнеупорный популяция везикул или, в данном случае, ППР = ППР / 0,65 (Уравнение 4).
      Примечание: Подгонка константа α определяется путем подгонки график р (≥1 scramblase) по сравнению с PPR * с моно-показательной функции. Если опсина (молекулярная масса 41,7 кДа) функционально реконструируют в пузырьках 175 нм диаметра (каждый пузырек имеет 280,000 фосфолипиды 26) в качестве мономера, а = 0,187 мг ммоль -1. Если опсина димеризуется до восстановления 3 с получением scramblase-активных везикул, то α= 0,37 мг ммоль -1. Если PPR PPR , а не * должны были быть использованы для анализа, то соответствующие значения альфа будет 0,122 и 0,244 мг ммоль -1. Эти предсказанные значения для а предположим, что все молекулы Opsin функционально компетентны. Если только часть молекул компетентен карабкаться липиды, то соответствующие значения а будет больше.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Описано воссоздание опсином в БУВ охарактеризовать его scramblase активности с использованием флуоресцентного анализа на основе. Анализируются результаты поместить нижний предел скорости опсина-опосредованной фосфолипида скремблирования и для определения олигомерного состояния, в котором опсина функционально реконструируют в везикулы.

Для определения оптимальных условий восстановление, необходимо определить эмпирически количество моющего средства, которое должно быть использовано для пополняют БУВ так, что они восприимчивы к вставке белка. Такой эксперимент показан на фигуре 2А. Аликвоты РОРС: POPG БУВ лечат с различными количествами РГМ в течение 3 ч, и поглощение образца измеряют при 540 нм, мера мутности и, следовательно, размер везикул. Оптическую плотность измеряли при 540 нм (OD 540) график показывает , что везикулы разбухает DDM Концвания увеличивается от 4-6 мм, достигнет точки насыщения на уровне около 7 мМ до начала растворять ( что соответствует потере мутности и OD 540 сигнала) , как DDM дополнительно увеличивается. НБД-ПК добавляется после обработки моющим средством, и образцы дополнительно инкубировали в течение одного часа перед обработкой гранул полистирола для удаления моющего средства. Распределение transbilayer из НБД-ПК определяется путем измерения потери флуоресценции после добавления дитионит к везикул (как описано выше). Таким образом, НБД-ПК вставляет в наружный листок везикул в отсутствие детергента, обозначенном его полной доступности к дитионит. Для получения везикул, обработанных> 2 мМ DDM, НБД-ПК способен распределить симметрично на обеих створок, так что, как только ДДМ удаляется 50% от НБД-компьютер защищен от дитионит.

На фиг.2В показан аналогичный дестабилизацию-восстановление эксперимента (перерисован из справки 2 </ SUP>), на этот раз отслеживать воссоздание опсином. В этом эксперименте, можно увидеть, что 7 мМ ДДМ необходим для опсина восстановления таким образом, что НБД-компьютер становится количественно (> 80%), которое доступно для дитионита в результате опсина-опосредованной скремблирования.

фигура 2
Рис . 2: Воссоздание НБД-PC и опсином в моющие-дестабилизировали везикул (А) Аликвоты везикулы обрабатывают диапазоном концентраций детергентов (0-9 мМ) путем смешивания конечного перепроизводство конец в течение 3 ч при комнатной температуре , В конце инкубационного периода измеряют оптическую плотность образцов при длине волны 540 нм (черная линия). НБД-ПК (растворенного в 0,1% вес / об DDM) затем добавляют и образец инкубировали в течение еще 1 ч при комнатной температуре до того, как моющее средство удаляют путем обработки гранул полистирола. Полученные липосомы анализируют с помощью Fluor Анализ снижения escent (красная линия), чтобы определить, в какой степени НБД-PC симметрично воссозданную. (В) , как в (A) , но в этом эксперименте везикулы , образованные из Яичные фосфолипиды (яичный PC / яичный фосфатидной кислоты, 9: 1 моль / моль) дестабилизируется с РГМ, и опсина был добавлен вместе с НБД-PC, в результате чего снижение флуоресценции около 80% после того , как белок эффективно восстанавливали и способен облегчить скремблирование НБД-PC (модифицированный из справки 2). Несмотря на то, НБД-ПК был симметрично восстановленная на 2 мМ DDM, идеальные условия для воссоздании опсином были выбраны вокруг пика OD 540 оптической плотности, то есть точки , где везикулы сильно опухшие из - за внедренного моющего средства , но еще не растворенной (обозначенный стрела). Для POPC / POPG (9: 1 моль / моль) везикулы, концентрации DDM 8 мм было установлено, что оптимальным для обоих НБД-PC и опсина восстановления./54635/54635fig2large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Степень снижения флуоресценции возрастает с количеством опсином , используемого для восстановления. На фиг.3А показана флуоресцентных следы , полученные при добавлении дитионита НБД-PC-содержащих небелковых липосом (черный след) и протеолипосомах восстанавливаемые опсину при различных белков в фосфолипидных соотношениях (PPR, в единицах мг белка на ммоль фосфолипидов, красные следы); следы были нормированы так , что все они имеют один и тот же начальный флуоресценции (F I) значение для облегчения визуализации. Моноэкспоненциален припадки следов указывают на очень похожие постоянные времени, начиная от 20-25 сек; поскольку скорость дитионит-опосредованное сокращение НБД-PC в безбелковых липосом является такой же, как в протеолипосомах, можно лишь поместить более низкую оценку на скорость опсина-опосредованной скремблирования (см текст для более подробной информации). Рисунок 3B показывает анализируемые данные , полученные из анализов по снижению флуоресценции с получением участков р (≥1) scramblase (вероятность везикулы , имеющей по меньшей мере один scramblase) по сравнению с экспериментально измеренной ППР (PPR , связанной с * как обсуждалось выше). Сравнение моноэкспоненциальный приступе экспериментальных результатов в гипотетических припадков, соответствующих опсином можно разводить в качестве мономера, димера или тетрамера, показывают, что опсина воссоздает функционально как димер.

Рисунок 3
Рис . 3: Scramblase активность опсином (А) Флуоресцентные следы , соответствующие дитионит лечение везикул воссозданных с НБД-PC и Opsin количествах в диапазоне от 0-4.95 мкг, обозначенное клина. Наименьшее количество опсином восстановленного соответствует PPR 0,21 мг / ммоль,второй по величине количество до 0,43 мг / ммоль и наибольшее количество до 1,3 мг / ммоль, или 10 опсинов в пузырьке в среднем. Дитионит был добавлен в указанное время (стрелка) и НБД флуоресценции контролировали в течение еще 400 секунд. Максимальная степень снижения флуоресценции видели в этом эксперименте составляла 85%, тогда как в среднем в течение многих экспериментов 82,5%. (В) белок зависимость скремблирования. Данные экспериментов, аналогичных панели А были проанализированы с использованием статистики Пуассона для генерации график вероятности везикул, имеющих по меньшей мере один scramblase (р ≥1 scramblase) в зависимости от белка к фосфолипид отношение (PPR) везикул (белок количественно пост- восстановление с помощью вестерн - блот анализа 3 и фосфолипид определяли путем измерения неорганического фосфата , выделяющейся при кислотного гидролиза). Красная линия представляет собой моно-показательная, пригодный для данных; штриховые серые линии представляют собой моно-экспоненциальная приспосабливает для воссоздания опсином в 170 нм диаметра Vesicles в качестве мономеров, предварительно сформированных димеров или предварительно сформированных тетрамеры. Поскольку ось х представляет экспериментально измеренная PPR (а не PPR * (см основной текст)), подходит константы соответствуют PPR , а не PPR * значения, как описано в основном тексте. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Анализ scramblase активности позволил нам изначально определить , что опсина обладает фосфолипидов scramblase активностью 2. Анализ также позволил нам охарактеризовать scramblase активность Opsin путем тестирования специфичности (мы использовали различные НБД-меченых репортер липидов , таких как НБД-фосфатидилэтаноламина, меченные NBD на ацильной цепи , как показано на НБД-ПК на рисунке 1А, или на головная группа, НБД-сфингомиелина или NBD- фосфатидилсерин 2), эффект везикулы липидного состава (например, холестерин в разных количествах в качестве везикул составляющей), и является ли различных конформационных состояний опсином и родопсина все они демонстрируют scramblase активность. Эти анализы показали , что scramblase активность родопсина является очень быстро (> 10000 фосфолипиды в секунду), неспецифические для фосфолипидов и не зависит от конформационного состояния родопсина или действительно ли он содержит его хромофор сетчатки глаза 2,3. Вот,мы представили детальный метод для генерации Протеолипосомы, содержащих Opsin и показал, как для анализа этих препаратов для фосфолипидов scramblase активности.

Описанный протокол восстановление оптимизирован для данной композиции липидов и для воссоздании опсином после того, как он был очищен с помощью аффинной хроматографии с использованием в качестве солюбилизирующего DDM моющего средства. Состав липидной, а также моющее средство может быть изменено в соответствии с потребностями экспериментатора, хотя идеальные условия восстанавливающие для измененных условий должны быть определены путем выполнения "набуханием эксперимент" , описанный на рисунке 2. ДДМ эмпирически хорошо подходит для поддержания Opsin в стабильном и активном состоянии. Тем не менее, другие моющие средства, такие как октил-бета-глюкозид, CHAPS или Тритон Х-100 могут быть использованы следующие аналогичные протоколы. Triton X-100 является широко используемым моющее средство для воссоздании АТФ-связывающего кассетного транспортеров (ABC транспортерные) в качестве efficieNCY в опосредовании мембраны воссоздание выше , чем других моющих средств , и это также занимает меньше времени для уравновешивания с предварительно сформированными липосомами 24.

Можно определить олигомерный состояние функционально водостойких опсином если степень флуоресцентного редукции получена для образцов , восстановленных с различными количествами опсином, то есть в диапазоне от белка к фосфолипидных соотношений (ДОП). Для того чтобы сделать это, ППР восстановленным пузырьках должна быть явно измеряется как восстановление белка и фосфолипида может изменяться. Фосфолипиды восстановление может быть определено с помощью анализа фосфата, описанного в разделе 1.2, в то время как выход белка может быть оценена с помощью количественного анализа вестерн-блот, в котором очищенные протеины, используемые для reconstitutions используются для создания калибровочной кривой, что позволяет проводить сравнение с восстановлением разведенных образцов поперек диапазон PPR испытания (как описано подробно в ссылке 3).

Анализ scramblase активность основана на предположении, что дитионит не проникает в везикулы. Эта точка может быть проверена путем захвата растворимого NBD-меченых репортер в пузырьках и определения, может ли она быть уменьшена дитионита. Для этой цели, НБД-глюкоза (12,6 мкМ добавлены после того, как пузырек дестабилизацию) используется вместо НБД-PC. Этот водорастворимый молекула захватывается в протеолипосомах раз везикулы уплотнены и, следовательно, должны быть защищены от дитионит. Для того, чтобы НБД-глюкоза полностью доступным для восстановления, тритон Х-100 могут быть добавлены (1% вес / об) , который затем приводит к снижению 3,27 100%.

В протеолипосомы можно охарактеризовать, чтобы проверить, что восстановление как репортер липидов и белков является симметричным. Первое достигается столкновительными экспериментов закалочных с использованием ионов иодида в то время как последний основан на стратегии защиты протеазы с использованием AspN протеазы, которыеразрезает на конкретном участке вблизи С-конца опсином 3.

Переход от начальной флуоресценции (F I) , определенной в анализе scramblase активности до конечной точки флуоресценции (F) является сложной, но для наших целей он может быть разумно аппроксимировать одной экспоненциальной функцией распада. Постоянная времени, связанный с экспоненциальным спадом (20 сек), примерно одинакова для неактивных липосом и активных, опсином содержащих протеолипосомах, указывающими, что скремблирования происходит так быстро, или быстрее, чем скорость, с которой флуорофор НБД уменьшается на дитионит. Таким образом, анализ активности scramblase имеет плохое разрешение по времени (ограничение по химии дитионита сокращения), которая в настоящее время только допускает классификацию мутантов в активный, очень медленно или неактивным. Эта классификация может рассматриваться для кальция регулируется scramblase TMEM16 27: при высоких уровнях 2+ Ca, распад флуоресценции выявили постоянную времени , аналогичную тхат видели в безбелковых липосом, что указывает, что скорость лимитирующей стадией является химическое восстановление НБД-флуорофором дитионитом, чем липид скремблирования. Наоборот, при низком уровне Са 2+ не было достигнуто стационарное состояние флуоресцентного сокращения после 900 сек, что делает возможным различать два кинетических компонентов, присвоенной к уменьшению дитионита внешнего листка и более медленную к выдержке внутрипартийной листовку НБД-липидов на внешней стороне.

Расхождение между предсказанным потерей 100% флуоресценции на дитионита обработки везикул , полученных с высокой PPR (рис 1C) по сравнению с экспериментальной реальности , где трудно превысить ~ 85% скидки (Рисунок 3A) предполагает , что часть везикул является огнеупорный на восстановление. Эта фракция может соответствовать везикулы, что печать на ранней стадии процедуры восстанавливающего в качестве моющего средства адсорбируется на полистирольных шариков инет поэтому больше не в состоянии получить белок. Для анализа , описанного в разделе 3, мы предположили , что эта огнеупорная населения соответствует доле ф от общего количества везикул. Если предположить , что половина молекул НБД-PC (пул НБД-PC в наружной листовке) в тугоплавких везикул доступен для дитионита редукции, то мы оцениваем F = 2 • (1 - R макс / 100), или 0,35 при R макс = 82,5%.

Место р (≥1 scramblase) по сравнению с PPR * данные с моно-показательное уравнение обеспечивает пригонку константа а, из которого можно определить, является ли воссоздает опсина функционально в качестве мономера или димера, или смесь состояний, включая высшие мультимеры порядка , Интерпретация этих результатов усложняется, если доля молекул Opsin не может функционировать в скремблирования. Хотя это маловероятно, учитывая условия, при которых опсина очищают, которые гарантируют, что она сохраняет все ее белка Gдеятельность рецепторов, значение альфа, соответствующей функциональной вставки димеров также может быть истолковано в качестве функциональной вставки мономеров из препарата опсином где половина белки неактивны в качестве scramblases. Еще один момент, чтобы рассмотреть, что анализ, который мы представляем, что предполагает везикулы, используемые для восстановления являются однородными по размеру. В действительности, везикулы имеют диапазон диаметров, характеризующихся гауссовым распределением со стандартным отклонением соответствует приблизительно одной трети от среднего диаметра. К счастью, результаты анализа р (≥1 scramblase) по сравнению с PPR * Данные не оказывает существенного влияния на рассмотрение везикул неоднородностью и так простого анализа, что мы представили достаточно для описания данных.

Потенциальным ограничением методов, которые мы описали, что процедура работы ресурсоемких не позволяют измерять с высокой пропускной способностью очень высокого числа образцов Аой, что пузырек гетерогенность может нарушить отсчет. Первая проблема может быть преодолена с помощью формата Микротитровальный-пластины для анализа scramblase; вторая может быть решена в будущем единичных анализов везикул с использованием TIRF микроскопии.

Анализ дитионит для измерения scramblase активности можно рассматривать как очень надежный и прочный, как только процедуры дестабилизация и восстанавливающие установлены. Альтернативный подход для количественного определения трансмембранного переноса фосфолипидов, что также позволяет проверить результаты , полученные из анализа дитионит, является обратной экстракции короткоцепочечных НБД-липиды из внешнего листовке везикул с использованием не содержащего жирных кислот бычьего сывороточного альбумина 22. Обратной экстракции, а также тест с дитионит также применяют для характеристики и идентификации flippases из самых ATPases Р4 типа и ABC транспортеров 28-33.

По мере того как инструменты, представленные здесь, могут быть легко адаптированы в соответствии с differeнт потребности описанные процедуры являются универсальными и поможет в идентификации и характеристике фосфолипидов scramblases в будущем. Изучение идентичности многих из них, что из scramblase необходимого для расширения биогенных мембран в процессе роста клеток в том числе и имеет огромное физиологическое значение.

Для получения дополнительной информации и детального описания анализа данных, читатели могут обратиться к предыдущим публикациям из нашей лаборатории 2-4,27, а также другие 22,25,28,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840457C POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 810130C NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid VWR Scientific EM-5330 HEPES
NaCl Sigma S7653-1KG NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside Anatrace D310 5 GM DDM
Fluorimeter cuvettes sigma C0918-100EA cuvettes
Spectrofluorometer Photon Technology International, Inc. fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85% Sigma 157953-5G dithionite
GraphPad Prism 5 software Prism
Tris Base VWR JTX171-3 Tris
LIPEX 10 ml extruder  Northern Lipids, Inc. Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm Sigma 28156-243 Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110607 400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter Sigma WHA110606 200 nm membrane
sodium phosphate Sigma S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm VWR Scientific 47729-572 glass tubes
Perchloric acid Sigma 30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma A-7302 ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A7631-25G sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents Bio Rad 1523920 polystyrene beads
 2.0 ml Microtubes clear VWR Scientific 10011-742 Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube VWR Scientific 53283-800 Reconstitution glass tubes
Zetasizer  Malvern  DLS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
  2. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
  3. Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
  4. Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. (2015).
  5. Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
  6. Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
  7. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
  8. Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
  9. Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
  10. Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
  11. Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51, (2010), 247-261 (2010).
  12. Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
  13. Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
  14. Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
  15. Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
  16. Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
  17. Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
  18. Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
  19. Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
  20. Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
  21. Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80, (2), 290-299 (2011).
  22. Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
  23. Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
  24. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  25. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
  26. Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
  27. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
  28. Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
  29. Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
  30. Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
  31. Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
  32. Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
  33. Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).
Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).More

Ploier, B., Menon, A. K. A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity. J. Vis. Exp. (115), e54635, doi:10.3791/54635 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter