Abstract
Scramblases translokerar fosfolipider över membranbiskiktet båda riktningarna i en ATP-oberoende sätt. Den första scramblase identifieras och biokemiskt verifieras var opsin, apoproteinet av ljusmätare rhodopsin. Rhodopsin är en G-proteinkopplad receptor lokaliserad i stavfotoreceptorskivmembran hos näthinnan där det är ansvarig för uppfattningen av ljus. Rhodopsin s scramblase aktivitet beror inte på dess ligand 11- cis -retinal, dvs är apoprotein opsin också verksam som scramblase. Även konstitutiv och reglerad fosfolipid förvränga spela en viktig roll i cellfysiologi, har endast ett fåtal fosfolipid scramblases hittills identifierats förutom opsin. Här beskriver vi en fluorescensbaserad analys av opsin s scramblase aktivitet. Opsin bereds i stora unilamellära liposomer sammansatta av fosfatidylkolin, fosfatidylglycerol och en spårmängd av fluorescerande NBD-märkt PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-bensoxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl} - sn-glycero-3-fosfokolin). Scramblase aktivitet bestäms genom att mäta i vilken utsträckning NBD-PC-molekyler som finns i den inre bipacksedel vesikeln kan komma åt den yttre broschyr där deras fluorescens kemiskt elimineras genom ett reduktionsmedel som inte kan passera membranet. De metoder som vi beskriver har allmän tillämpbarhet och kan användas för att identifiera och karakterisera scramblase verksamheten i andra membranproteiner.
Introduction
Fotoreceptorn rhodopsin, en prototypisk G-proteinkopplade receptorer (översikt exempelvis i referens 1), är den första fosfolipid scramblase identifieras och biokemiskt verifierade 2,3. Scramblases är fosfolipid transportörer som ökar i sig långsam transbilayer fosfolipid rörelse för att fysiologiskt lämpliga nivåer i en dubbelriktad, ATP-oberoende sätt 4-6. Exempel av sina handlingar kan hittas i det endoplasmatiska nätverket och bakteriell cytoplasmiska membranet där det behövs för membran homeostas och tillväxt konstitutiv klättra, liksom för en rad olika glykosylering vägar 5. Regleras fosfolipid behövs kodning för att exponera fosfatidylserin (PS) på ytan av apoptotiska celler där den verkar som en "äta-me" -signal för makrofager 7 och ger en prokoagulerande yta på aktiverade blodplättar för att katalysera produktionen av proteinfaktors behövs för blodproppar. I ljusmätare skivmembran har rhodopsin s förvrängnings aktivitet föreslagits för att motverka den fosfolipid obalansen mellan de två membran broschyrer av dubbelskiktet som genereras av den ATP-beroende, ensriktad lipid Flippase ABCA4 4,8,9 10-12.
Trots den fysiologiska betydelsen av scramblases förblev sin identitet svårfångade tills rhodopsin rapporterades som en scramblase i ljusmätare skivor två medlemmar av TMEM16 proteinfamiljen identifierades som Ca2 + -beroende scramblases behövs för PS exponeringen vid plasmamembranet (ses med hänvisning 13), och den bakteriella proteinet FtsW föreslogs som en lipid II scramblase krävs för peptidoglykansyntesen 14. Dessa upptäckter baserades på beredning av renade proteiner i liposomer och demonstration av scramblase aktivitet i de resulterande proteoliposomer hjälp av den metod described här. Andra potentiella scramblases 15-21 - de MurJ och AMJ proteiner inblandade i peptidoglykan-biosyntesen, WzxE och besläktade proteiner inblandade i krypterings O-antigen prekursorer MprF protein som behövs för att translokerar aminoacyleras fosfatidylglycerol över bakteriella cytoplasmiska membranet, och Xkr8 familjemedlemmar som har föreslagits att exponera PS på ytan av apoptotiska celler - återstår att testas biokemiskt. Detta understryker vikten av en robust analys för att identifiera och karakterisera scramblase aktivitet.
Här beskriver vi den rekonstitution av renat opsin, apoproteinet av fotoreceptorn rhodopsin, in stora unilamellära vesiklar (LUV: er), och efterföljande analys av scramblase aktiviteten i de resulterande proteoliposomer med användning av en fluorescensbaserad analys. Det finns flera väl beskrivna protokoll som finns i litteraturen för heterolog expression och rening av opsin, därför kommer vi intebeskriva det i detta protokoll; vi använder protokollen i et al. Goren 3 vilket ger FLAG-märkt, termostabilt opsin vid ca 100 ng / | il i 0,1% (vikt / volym) dodekylmaltosid (DDM).
Rekonstituering uppnås genom att behandla LUV med tillräcklig tvättmedel så att de sväller men inte upplösas. Under dessa betingelser, ett membranprotein - tillförs i form av protein-detergent-miceller - kommer att integrera in i liposomerna och bli rekonstitueras in i liposommembranet vid avlägsnande detergent, vilket resulterar i proteoliposomer. Att rekonstituera opsin (erhållen såsom ett renat protein i 0,1% (vikt / volym) DDM), är LUV: er framställs från en blandning av POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-fosfokolin) och POPG (1- palmitoyl-2-oleoyl--sn-glycero-3- [fosfo-rac- (1-glycerol)]) och mättades med DDM innan du lägger opsin och NBF-PC. Detergenten avlägsnas därefter genom behandling av provet med polystyrenpärlor.
lass = "jove_content"> Principen för fluorescensbaserad analys visas i figur 1B. LUV är symmetriskt rekonstitueras med en spårmängd av NBD-PC eller annan NBD-märkt fluorescerande fosfolipid reporter (Figur 1A). Vid tillsats av ditionit, är ett membran-impermeant dianjon, är NBD-PC-molekyler i den yttre bipacksedel av nämnda LUV gjorts icke-fluorescerande såsom nitrogrupp till NBD reduceras till en icke-fluorescerande amino-grupp. Eftersom varken NBD-PC-molekyler eller ditionit kan passera membranet på tidsskalan för försöket (<10 min), resulterar detta i 50% minskning av fluorescenssignalen. Men om liposomerna rekonstitueras med ett scramblase kan NBD-PC-molekyler i det inre bipacksedel förvränga snabbt till utsidan där de reduceras. Detta resulterar i en total förlust av fluorescens i det ideala fallet (Figur 1C).
es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. Figur 1: Schematisk representation av scramblase aktivitetsanalysen Analysen använder en fluorescerande NBD-märkt reporter lipid; NBF-PC visas (A). Stora unilamellära vesiklar rekonstitueras med en spårmängd av NBD-PC. Beredning producerar symmetriska blåsor, med NBD-PC fördelas jämnt i de yttre och inre broschyrer. Ditionit (S 2 O 4 2-) reducerar kemiskt nitrogrupp till NBD till en icke-fluorescerande amino-grupp. Behandling av proteinfria liposomer med ditionit (B, överst) orsakar en minskning av fluorescens 50% eftersom endast de NBD-PC-molekyler i ytterblad reduceras: ditionit är negativt laddad och kan inte korsa membranet att reagera med NBD-PC-molekyler i den inre bipacksedel. Ditionit behandling av opsin innehållande proteoliposomer (B, botten), det vill säga, scramblase aktiva proteoliposomer, resulterar i 100% förlust av fluorescence som opsin underlättar förflyttning av NBF-PC mellan den inre och den yttre bipacksedel. (C) visar idealiserade fluorescens spår som erhållits på att behandla proteinfria liposomer och opsin innehåller proteoliposomer med ditionit. Graden av fluorescensförlust är densamma i båda fallen tyder på att den kemiska reduktionen av NBF av ditionit är hastighetsbegränsande och att förvränga sker med en hastighet som är lika med eller större än hastigheten för den kemiska reaktionen. Spår som erhållits från en faktisk experiment visas i Figur 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De metoder som vi beskriver kan användas för att rekonstruera och analysera andra renade proteiner, liksom blandningar av membranproteiner som erhållits, till exempel, genom att extrahera mikrosomer med rengöringsmedel 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av liposomer och proteoliposomer
- liposombildning
- Med användning av en glasspruta, tillsätt 1435 pl POPC (25 mg / ml, i kloroform) och 160 | j, l POPG (25 mg / ml, i kloroform) till en rundbottnad kolv för erhållande av 52,5 | j, mol lipider i ett molärt förhållande av POPC: POPG = 9: 1.
- Torka de lipider för 30 min med användning av en rotationsindunstare vid en rotationshastighet av 145 rpm (inget vattenbad behövs för denna volym lösningsmedel), sedan överföra kolven till en vakuumexsickator under minst 3 h, eller över natten, vid rumstemperatur (RT).
- Hydratisera den torkade lipidfilmen med 10 ml 50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl (hädanefter benämnd buffert A) genom att försiktigt snurra kolven tills en homogen, grumlig suspension resultat;
OBS: Lipidkoncentrationen i detta skede förväntas bli 5,25 mM eftersom inga förluster borde ha skett hittills. - Sonikera suspensionen i ett vattenbad under 10 min vid rumstemperatur med en frekvens of 40 kHz. Lösningen kommer att se något klarare.
- Användning av en extruder, passera suspensionen 10 gånger genom ett membran med en 400 nm porstorlek, följt av en andra cykel av extrudering med 4 passerar genom ett membran med en 200 nm porstorlek.
OBS: Medeldiametern av de resulterande LUV är ~ 175 nm. Om nödvändigt, kan storleken och homogeniteten hos nämnda LUV kontrolleras genom dynamisk ljusspridning i enlighet med tillverkarens instruktioner. - Kvantifiera fosfolipidkoncentration av LUV suspensionen som beskrivs i avsnitt 1.2).
OBS: På grund av förluster under strängsprutning, är koncentrationen vanligtvis omkring 3,6 mM. - Lagra nämnda LUV vid 4 ° C under ca 2 veckor, om den inte används omedelbart.
- fosfolipid Kvantifiering
OBS: För att bestämma fosfolipidkoncentration av LUV fjädring som används för beredning, liksom att de proteoliposomer som eventuellt genereras, är en delmängd av provet subjected mot oxidation av perklorsyra. Detta förfarande bryter ner fosfolipider för att frigöra oorganiskt fosfat som sedan kvantifieras genom en kolorimetrisk analys i jämförelse med standarder 23.- Bered en 40 mM stamlösning av natriumfosfat (Na 2 HPO 4) i avjoniserat destillerat vatten.
- Späd stamlösningen med avjoniserat destillerat vatten för att erhålla 4 mM och 0,4 mM arbetslösningar som kommer att tjäna som kalibreringsstandarder.
- Med hjälp av arbetslösningar, utarbeta standarder i 13 x 100 mm 2 glasrör som sträcker sig 0-80 nmol natriumfosfat i en slutlig volym av 50 pl.
- Ta 10 l var och en av LUV och proteoliposome prover som ska kvantifieras och späd med 40 fil DDH 2 O i 13 x 100 mm 2 glasrör.
OBS: Som lipidkoncentration av nämnda LUV och proteoliposomer är i intervallet från 2,5 till 5 ^ M, 10 | il av provet bör innehålla 25-50 nmol lipid fosfor. - Tillsätt 300 | il perklorsyra till var och en av de standarder och prover och värme under 1 h vid 145 ° C i ett värmeblock. Sätta kulor på rören för att förhindra avdunstning.
- Låt rören svalna till rumstemperatur och tillsätt 1 ml av DDH 2 O.
- Tillsätt 400 | il vardera av nyberedd 12 g / L ammoniummolybdat och 50 g / L natriumaskorbat och vortexa att blanda.
- Värme under 10 minuter vid 100 ° C med kulor på toppen av rören. Avlägsna rören från värmeblocket och låt dem svalna till rumstemperatur.
- Mät absorbansen hos proverna mot råämnet (standardprov som innehåller 0 nmol natriumfosfat) med en spektrometer vid en våglängd av 797 nm.
- Fastställa innehållet fosfat prov mot kalibreringsstandard kurvan.
- Ombildning av opsin
OBS: Det är nödvändigt att fastställa optimala svullnad villkor för beredning som dessa beror på vilken typ av tvättmedel, samtsåsom lipidkompositionen och koncentration av nämnda LUV. Som LUV ändrar sina ljusspridande egenskaper på svullnad processen kan övervakas genom mätning av absorbansen (Figur 2) som granskats av Rigaud och Levy 24 och Geertsma et al. 25.- Pipett 800 pl LUV (från avsnitt 1.1, som lipid återhämtning efter extrudering är 70%, är den förväntade koncentrationen av LUV: er 3,6 mM fosfolipid) i en 2 ml mikrofugrör.
- Lägg 5,3 pl av buffert A och 34,7 | il av 10% (vikt / volym) DDM upplöst i buffert A.
- Inkubera under 3 h vid rumstemperatur med ände-över-ände blandning.
- Samtidigt förbereda polystyrenpärlor:
- Använd 400 mg av pärlor per prov och väga dem i en glasbägare.
- Tvätta dem två gånger med metanol, tre gånger med vatten och en gång med buffert A. För varje tvättsteg användning 5 ml vätska och rör om långsamt under 10 min.
OBS: Det rekommenderas att förbereda polystyrenpärlor för flera prover på en gång, till exempel, väger i 6 g pärlor och tvätta med 75 ml vätska. Överskott pärlor kan förvaras i kylskåp i flera dagar.
- Under de sista 30 min av vesikler destabilisering torka NBD-märkt fosfolipid i en skruvkork glasrör (beredning glasrör): Per prov, 9,5 pl NBF-PC (1 mg / ml i kloroform, vilket gav 0,4 mol% av totala fosfolipider) torkas under en ström av kväve i ett glasrör och därefter löstes i 45 pl av 0,1% (vikt / volym) DDM i buffert A.
- Efter 3 h av vesikel destabilisering lägga den upplösta-NBD-märkt fosfolipid, DDM-solubiliserade protein och buffert A så att den slutliga volymen med 1 ml innehåller 0,36% (vikt / volym), det vill säga, 7 mM, DDM.
- Således, för att generera proteinfria liposomer (som används som ett kontrollprov) tillsätt 45 | il av NBD-PC (löst i 0,1% DDM), 60 pl av 0,1% DDM och 55 | il av buffert A; för proteoliposomer lägga till examenpel 40 pl protein (från en typisk förrådslösning av ~ 110 ng / | il) i 0,1% DDM, 45 pl av NBD-PC (löst i 0,1% DDM), 20 fil av 0,1% DDM och 55 | il av buffert A .
OBS: Tillsatsordningen bör vara de som listas.
- Således, för att generera proteinfria liposomer (som används som ett kontrollprov) tillsätt 45 | il av NBD-PC (löst i 0,1% DDM), 60 pl av 0,1% DDM och 55 | il av buffert A; för proteoliposomer lägga till examenpel 40 pl protein (från en typisk förrådslösning av ~ 110 ng / | il) i 0,1% DDM, 45 pl av NBD-PC (löst i 0,1% DDM), 20 fil av 0,1% DDM och 55 | il av buffert A .
- Blanda provet under ytterligare hr ände över ände vid rumstemperatur.
- Tillsätt 80 mg för de framställda polystyrenpärlor och inkubera provet med ände-över-ände blandning under 1 h vid RT.
- Nästa lägga till en extra 160 mg polystyrenpärlor och inkubera med ände-över-ände blandning under ytterligare 2 h vid RT.
- Överförs prov (lämnar de förbrukade polystyrenpärlor bakom) till en glasskruvlock rör innehållande 160 mg av färska polystyrenpärlor och blanda över natt vid 4 ° C.
OBS: Det enklaste sättet att överföra provet och undvika att suga upp pärlor är att använda en Pasteur-pipett som trycks till botten av glasröret med lite positivt tryck. När spetsen av pipetten är fast påbotten av röret, då provet kan tas ut enkelt utan interferens från pärlorna. - Nästa morgon, överföra provet till ett mikrofugrör utan föra över pärlor och placera på is som förberedelse för scramblase aktivitetsanalys.
2. Scramblase Aktivitetsanalys
OBS: Fluorescensintensiteten hos liposomer eller proteoliposomer utspädda med buffert A övervakas över tiden vid tillsats av ditionit i en fluorescensspektrometer. För att få en stabil start intensitet, är fluorescens noterats för minst 50 sekunder (eller tills en stabil signal uppnås) innan du lägger ditionit till en ständigt omrörd provet och sedan följdes under minst 500 sek efter tillsats ditionit.
- Lägg 1,950 pl buffert A till en plastkyvett innehåller en mini omrörarstav.
- Tillsätt 50 l av det beredda Proteo (liposomer) och låt provet jämvikt i fluorescens spectromätare med konstant omröring i flera sekunder.
- Samtidigt förbereda en lösning av 1 M ditionit i 0,5 M obuffrad Tris (t.ex. för två prover väga ut 20 mg av ditionit i ett mikrofugrör och lös i 114 pl iskall 0,5 M Tris direkt före användning och hålla på is för nästa prov).
OBS: ditionitlösning måste beredas och bör inte användas mer än 20 minuter efter beredning; om många mätningar skall göras, kan alikvoter av ditionit vägas ut i förväg och löstes precis innan användning. - Starta fluorescensövervakning (excitation 470 nm, emission 530 nm, spaltbredd 0,5 nm).
- Tillsätt 40 ul av 1 M ditionitlösning till kyvetten 50 sek efter start av fluorescensen inspelning (använd septum i locket på kuvettkammaren om möjligt) och fortsätta att registrera fluorescens under ytterligare 400-600 sek.
- Analysera data som beskrivs i avsnitt 3.
3.Dataanalys
- Kinetiken för Scrambling
- Karakterisera fluorescens spår av varje prov som erhållits genom scramblase aktivitetsanalys genom att definiera den initiala fluorescensen, F ^, före tillsats av ditionit, och slutpunkts fluorescens, F, nås efter> 400 sek. F i bestäms för varje prov som medelvärdet av fluorescens för 30 sek perioden före tillsats av ditionit.
- Bestämma de slutpunktsdata motsvarande omfattningen av fluorescensminskning, R = 100 • F / F i. Vi använder termerna R L för proteinfria liposomer och R P för opsin innehållande proteoliposomer.
- Bestämning av molekylvikten för de Funktionellt rekonstituerade Scramblase
- Konvertera data fluorescens Sänkningen enligt följande ekvation:
p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (Rmax - R L) (Ekvation 1)
NOTERA: Där Rmax är den maximala minskningen som erhålles när tillräckligt med protein rekonstitueras sådan att alla vesiklar i provet besitter minst en funktionell scramblase, och p är sannolikheten att en viss vesikel i en rekonstituerade provet 'scramblase-aktiv ", dvs äger den åtminstone en funktionell scramblase. Värdet för R L är typiskt 45% 3 medan Rmax är typiskt 82,5% 3, i stället för den förväntade 100% (Rmax kan bestämmas experimentellt för opsin proteoliposomer med en PPR av> 1 mg / mmol). Som Rmax <100% antas att en undergrupp av vesiklar är refraktär till beredning. För R max = 82,5%, är den del av blåsor som inte kan godta protein 0,35. - Beskriva relationen mellan p (≥1 scramblase) och PPR (mg protein / mmol fosfolipid) av Poisson statistik enligt följande:
p (≥1 scramblase) = 1 - e - Som en del av de vesiklar inte bidrar till förvränga även vid hög PPR (se diskussion), ändra ekvationen till:
p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Ekvation 3)
OBS: Om PPR * = PPR / (1- f), där f är den eldfasta population av vesiklar eller, i det här fallet, PPR * = PPR / 0,65 (ekvation 4).
OBS: fit konstant α bestäms genom att montera en graf av p (≥1 scramblase) kontra PPR * med en mono-exponentiell funktion. Om opsin (molekylvikt 41,7 kDa) återskapar funktionellt i vesiklar 175-nm diameter (varje vesikel har 280.000 fosfolipider 26) som en monomer, a = 0,187 mg mmol -1. Om opsin dimeriserar före beredning 3 och gav scramblase aktiva blåsor, då α= 0,37 mg mmol -1. Om PPR snarare än PPR * skulle användas för analys, då de motsvarande a-värden skulle vara 0,122 och 0,244 mg mmol -1. Dessa förutsagda värden för α antar att alla opsin molekyler är funktionellt kompetenta. Om endast en fraktion av molekylerna är behörig att förvränga lipider, sedan motsvarande värden för α blir större.
- Konvertera data fluorescens Sänkningen enligt följande ekvation:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver beredning av opsin i LUV att karakterisera dess scramblase aktivitet med hjälp av en fluorescensbaserad analys. Vi analyserar resultaten för att placera en undre gräns på graden av opsin-medierad fosfolipid kryptering och för att bestämma den oligomera tillstånd i vilket opsin rekonstituerar funktionellt i vesiklarna.
Att identifiera optimala beredning förhållanden, är det nödvändigt att bestämma empiriskt mängden tvättmedel som skall användas för att svälla LUV så att de är mottagliga för protein insättning. Ett sådant experiment visas i fig 2A. Alikvoter av POPC: POPG LUV är behandlade med olika mängder av DDM för 3 h och absorbansen för provet mäts vid 540 nm, ett mått på grumlighet och därmed av vesikelstorlek. Den optiska densiteten mättes vid 540 nm (OD 540) Diagrammet visar att vesiklarna sväller som DDM concentrtion ökas 4-6 mM, nå en mättnadspunkt på omkring 7 mM innan du börjar lösa (motsvarande förlust av grumlighet och OD 540 signal) som DDM ökas ytterligare. NBF-PC tillsätts efter behandlingen tvättmedel och proverna inkuberades ytterligare en timme innan den behandlades med polystyrenkulor att avlägsna rengöringsmedel. Den transbilayer distribution av NBF-PC bestäms genom att mäta fluorescensförlust efter tillsats ditionit till vesiklar (som beskrivits ovan). Sålunda infogar NBD-PC in i den yttre bipacksedel av vesiklar i frånvaro av detergent, anges av dess fullständig tillgång till ditionit. För vesiklar behandlade med> 2 mM DDM, NBD-PC kan fördela symmetriskt i båda broschyrer så att när DDM avlägsnas 50% av NBF-PC är skyddad från ditionit.
Figur 2B visar en liknande destabilisering-beredning experiment (ritas från referens 2 </ Sup>), den här gången spåra beredning av opsin. I detta experiment kan det ses att 7 mM DDM behövs för opsin rekonstitution så att NBD-PC blir kvantitativt (> 80%) tillgänglig för ditionit som ett resultat av opsin-medierad krypteringskod.
Figur 2:. Rekonstitution av NBD-PC och opsin i detergent-destabiliseras vesiklar (A) Alikvoter av vesiklarna behandlas med ett intervall av tvättmedels koncentrationer (0-9 mM) genom blandning ände-över-ände under 3 h vid rumstemperatur . Vid slutet av inkubationsperioden absorbansen av proverna vid 540 nm mäts (svart linje). NBD-PC (löst i 0,1% vikt / volym DDM) tillsätts sedan och provet inkuberades under ytterligare 1 h vid rumstemperatur innan detergenten avlägsnas genom polystyrenpärlor behandling. De resulterande liposomerna analyseras genom fluorescensföreningen analys escent minskning (röd linje) för att bestämma i vilken utsträckning NBF-PC är symmetriskt rekonstitueras. (B) såsom i (A), men i detta experiment vesiklar bildade av äggfosfolipider (ägg-PC / ägg fosfatidinsyra, 9: 1 mol / mol) destabiliseras med DDM, och opsin tillsattes tillsammans med NBD-PC, vilket resulterar i en fluorescens minskning med cirka 80% när proteinet effektivt beredas och kan underlätta klättra av NBD-PC (modifierad från referens 2). Även NBD-PC var symmetriskt rekonstituerades vid 2 mM DDM var idealiska förutsättningar för beredning opsin valt runt toppen av OD 540 absorbans, dvs den punkt där blåsor var mycket svullen på grund av inskjutna rengöringsmedel men ännu inte upplöst (indikeras av pil). För POPC / POPG (9: 1 mol / mol) vesiklar, en DDM koncentration av 8 mM befanns vara optimal för både NBD-PC och opsin rekonstitution./54635/54635fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Omfattningen av fluorescens minskning ökar med mängden opsin som används för beredning. Figur 3A visar fluorescens spår som erhållits på att lägga ditionit till NBD-PC-innehållande proteinfria liposomer (svart spår) och proteoliposomer ombildade med opsin på annat protein till fosfolipid förhållanden (PPR, i enheter av mg protein per mmol fosfolipid, röda spår); spåren har normaliserats så att de alla har samma initiala fluorescensen (F i) värdet för enklare visualisering. Monoexponentiellt anfall av spåren visar mycket likartade tidskonstanter, som sträcker sig från 20 till 25 sek; i takt med ditionit-medierad NBD-PC minskning av proteinfria liposomer är densamma som i de proteoliposomer, är det endast möjligt att placera en lägre uppskattning på graden av opsin-medierad klättra (se text för mer information). Figur 3B visar de analyserade data som erhållits från fluorescens minskning analyser för att ge tomter p (≥1) scramblase (sannolikheten för en vesikel som har åtminstone en scramblase) jämfört med experimentellt uppmätta PPR (relaterat till PPR * såsom diskuterats ovan). Jämförelse av monoexponentiellt passning av de experimentella resultaten i hypotetiska passar motsvarande opsin rekonstitueras som en monomer, dimer eller tetramer visar att opsin återskapar funktionellt som en dimer.
Figur 3:. Scramblase aktivitet opsin (A) Fluorescence spår motsvarande ditionit behandling av vesiklar ombildade med NBD-PC och opsin mängder som sträcker sig mellan 0-4,95 ng, indikeras av kilen. Den lägsta mängden opsin beredda motsvarar en PPR av 0,21 mg / mmol, dennäst högsta belopp till 0,43 mg / mmol och det högsta beloppet till 1,3 mg / mmol, eller 10 opsins per vesikler i genomsnitt. Ditionit tillsattes vid den angivna tiden (pil) och NBD fluorescensen övervakades under ytterligare 400 sek. I största möjliga utsträckning av fluorescens minskning ses i detta experiment var 85%, medan genomsnittet under många experiment är 82,5%. (B) Protein beroende förvränga. Data från experiment liknande panel A analyserades med användning Poisson statistik för att generera en graf över sannolikheten för vesiklar som har åtminstone en scramblase (p ≥1 scramblase) kontra proteinet till fosfolipid-förhållande (PPR) av vesiklarna (protein kvantifierades post- rekonstituering genom Western Blot-analys 3 och fosfolipid bestämdes genom att mäta oorganiskt fosfat som frisätts vid syrahydrolys). Den röda linjen representerar en mono-exponentiell anpassning för data; de streckade grå linjerna representerar mono exponentiell passar för beredning av opsin i 170 nm-diameter vesicles som monomerer, förformade dimerer eller förformade tetramerer. Som x-axeln representerar experimentellt uppmätta PPR (snarare än PPR * (se huvudtexten)), tillpassningskonstanter motsvarar PPR snarare än PPR * värden, vilket diskuteras i huvudtexten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den scramblase aktivitetsanalysen möjligt för oss från början för att fastställa att opsin har fosfolipid scramblase aktivitet 2. Analysen även tillät oss att karakterisera opsin s scramblase aktivitet genom att testa specificiteten (vi använde en mängd NBD-märkta reporter lipider såsom NBF-fosfatidyletanolamin, märkt med NBF på en acylkedja som visas för NBD-PC i figur 1A, eller på huvudgrupp, NBD-sfingomyelin eller NBD- fosfatidylserin 2), effekten av blås lipid sammansättning (t.ex. kolesterol i olika mängder som vesikler beståndsdel), och om de olika konformationstillstånd opsin och rhodopsin alla uppvisar scramblase aktivitet. Dessa analyser visade att rhodopsin s scramblase aktivitet är mycket snabb (> 10.000 fosfolipider per sekund), icke-specifik för fosfolipid och oberoende av rhodopsin är konformationstillstånd eller om det innehåller dess kromofor retinal 2,3 eller inte. Här,vi fram en detaljerad metod för att generera proteoliposomer innehåller opsin och visade hur man analys dessa preparat för fosfolipid scramblase aktivitet.
Den beskrivna rekonstitution-protokollet är optimerad för det givna lipidkomposition och för att rekonstituera opsin efter att den renades genom affinitetskromatografi med användning av DDM som solubiliserande detergent. Lipidkompositionen liksom tvättmedel kan ändras beroende på behoven hos försöks, Även om det ideala beredning förutsättningar för förändrade villkor måste bestämmas genom att utföra "svullnad-experiment" som beskrivs i figur 2. DDM är empiriskt väl lämpad för att upprätthålla opsin i stabilt och aktivt tillstånd. Emellertid kan andra detergenter såsom oktyl-β-glukosid, CHAPS eller Triton X-100 användas efter liknande protokoll. Triton X-100 är en allmänt använd detergent för att rekonstituera ATP-bindande kassetttransportörer (ABC-transportörer) som dess efficieNCY i medla membran beredning är högre än i andra rengöringsmedel och det tar också mindre tid att jämvikt med förformade liposomer 24.
Det är möjligt att bestämma den oligomera tillståndet i funktionellt rekonstituerade opsin om omfattningen av fluorescerande reduktion erhålles för prover rekonstituerade med olika mängder av opsin, dvs., över ett område av protein till fosfolipid-förhållanden (PPR). För att göra detta måste PPR av de rekonstituerade vesiklar uttryckligen mätt som återvinning av protein och fosfolipid kan variera. Phospholipid återhämtning kan bestämmas genom fosfatanalys som beskrivs i avsnitt 1.2, medan proteinutvinning kan uppskattas genom kvantitativ Western Blot-analys, i vilken de renade proteiner som används för reconstitutions används för att generera en kalibreringskurva som möjliggör jämförelser för indrivning av ombildade prover över PPR testade området (såsom förklaras i detalj med hänvisning 3).
Den scramblase aktivitetsanalysen är byggt på antagandet att ditionitjon inte tränga in vesiklarna. Denna punkt kan verifieras genom att fånga en löslig NBD-märkt reporter inom vesiklarna och avgöra om det kan minskas genom ditionit. För detta ändamål är NBD-glukos (12,6 pM tillsatts efter vesikel destabilisering) användes i stället för NBD-PC. Denna vattenlösliga molekyl fångas inom proteoliposomer när vesikler är förseglade och bör därför skyddas från ditionit. För att göra NBD-glukos fullt tillgänglig för att minska, kan Triton X-100 tillsättas (1% w / v), som sedan resulterar i 100% minskning 3,27.
De proteoliposomer kan karakteriseras för att verifiera att beredning av både reportern lipid och protein är symmetrisk. Den förra uppnås genom kollisioner släck experiment med användning av jodidjoner medan den senare är baserad på ett proteas skyddsstrategi med användning Aspn proteas somskär vid ett specifikt ställe i närheten av C-terminalen av opsin 3.
Övergången från den initiala fluorescensen (F i) bestämdes i scramblase aktivitetsanalys till slutpunkten fluorescens (F) är komplex, men för våra ändamål det rimligtvis kan approximeras med en enkel exponentiell avklingning funktion. Tidskonstanten i samband med den exponentiella förfall (20 sek) är ungefär densamma för inaktiva liposomer och aktiva, opsin innehållande proteoliposomer indikerar att klättra sker lika snabbt, eller snabbare än den hastighet med vilken NBD fluoroforen reduceras med ditionit. Således scramblase aktivitetsanalysen har en dålig tidsupplösning (begränsas av ditionit reduktion kemi) som för närvarande endast tillåter klassificering av mutanter i aktiv, mycket långsamt eller inaktiv. Denna klassificering kan ses för kalciumreglerade scramblase TMEM16 27: vid höga Ca2 + nivåer visade fluorescens förfall en tidskonstant liknande that ses i proteinfria liposomer, vilket indikerar att det hastighetsbegränsande steget är den kemiska reduktionen av NBD-fluoroforen med ditionit än lipid krypteringskod. Tvärtom, vid låga Ca 2 + nivåer steady state av fluorescerande minskning inte uppnåddes efter 900 sekunder, vilket gör det möjligt att skilja mellan två kinetiska komponenter, en tilldelad ditionit minskning av den yttre bipacksedel och långsammare att exponeringen inre-broschyr NBF-lipider på utsidan.
Diskrepansen mellan den förutsagda 100% förlust av fluorescens på ditionit behandling av vesiklar framställda med hög PPR (Figur 1C) kontra den experimentella verkligheten där det är svårt att överskrida ~ 85% reduktion (figur 3A) antyder att en fraktion av vesiklarna är eldfast beredning. Denna fraktion kan motsvara blåsor som tätar tidigt under beredning som tvättmedel adsorberas till polystyrenpärlor och ärdärför inte längre kunna ta emot proteinet. För den analys som beskrivs i avsnitt 3, antog vi att detta eldfasta befolkning motsvarar en bråkdel f av den totala blåsor. Om vi antar att hälften av NBD-PC-molekyler (poolen av NBD-PC i den yttre bipacksedel) i eldfasta vesiklar är tillgänglig för ditionit minskning, då räknar vi f = 2 • (1 - R max / 100), eller 0,35 när R max = 82,5%.
Montering av p (≥1 scramblase) versus PPR * data med en mono-exponentiell ekvation ger passform konstant α, från vilken det är möjligt att avgöra om opsin rekonstituerar funktionellt som en monomer eller dimer, eller en blandning av tillstånd inklusive högre ordningens multimerer . Tolkningen av dessa resultat blir komplicerat om en bråkdel av opsin molekyler inte kan fungera i klättra. Även om detta är osannolikt med tanke på de förhållanden under vilka opsin renas som garanterar att den behåller all sin G-proteinreceptoraktiviteter, ett värde på α motsvarar den funktionella införande av dimerer kan också tolkas som den funktionella införande av monomerer från en beredning av opsin där hälften av proteinerna är inaktiva som scramblases. En ytterligare punkt att tänka på är att den analys som vi presenterar förutsätter att vesiklar som används för beredning är homogena i storlek. I verkligheten vesiklarna har ett område av diametrar som kännetecknas av en Gauss-fördelning med en standardavvikelse som motsvarar ungefär en tredjedel av medeldiametern. Lyckligtvis är resultatet av analysen av p (≥1 scramblase) kontra PPR * uppgifter inte nämnvärt påverkas av hänsyn till vesikler heterogenitet och så enkel analys som vi presenterade är tillräcklig för att beskriva data.
En potentiell begränsning av de metoder som vi beskrivna är att den arbetsintensiva procedur inte tillåter hög genomströmning mätningar av ett mycket stort antal prov pernd att vesikler heterogenitet kan störa avläsningen. Det första problemet kan övervinnas genom användning av en mikrotiter-plattformat för den scramblase analys; den andra skulle kunna lösas i framtiden genom enstaka vesikler analyser med hjälp av TIRF mikroskopi.
Den ditionit analys för att mäta scramblase aktivitet kan betraktas som mycket tillförlitlig och robust när destabilisering och tillredningssätt är etablerade. Ett alternativt tillvägagångssätt för att kvantifiera trans transport av fosfolipider, som också medger att verifiera resultaten från den ditionit analys är återextraktion av kortkedjiga NBD-lipider från den yttre bipacksedel av vesiklarna med hjälp av fettsyrafritt bovinserumalbumin 22. Återextraktion liksom ditionit analysen har också använts för att karakterisera och identifiera flippases av P4-typ ATPaser och ABC-transportörer 28-33.
De verktyg som presenteras här kan lätt anpassas till different behöver de beskrivna förfarandena är mångsidiga och kommer att hjälpa till att identifiera och karakterisera fosfolipid scramblases i framtiden. Att lära sig identiteten på många av dessa, däribland från scramblase nödvändig för utbyggnaden av biogena membran under celltillväxt är av yttersta fysiologisk betydelse.
För ytterligare information och detaljerad beskrivning av dataanalys, är läsarna hänvisas till tidigare publikationer från vårt laboratorium 2-4,27 liksom andra 22,25,28,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
| 1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
| Dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
| Fluorimeter cuvettes | sigma | C0918-100EA | cuvettes |
| Spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. | fluorimeter | |
| Sodium hydrosulfite technical grade, 85% | Sigma | 157953-5G | dithionite |
| GraphPad Prism 5 software | Prism | ||
| Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
| LIPEX 10 ml extruder | Northern Lipids, Inc. | Extruder | |
| Whatman, Drain disc, PE, 25 mm | Sigma | 28156-243 | Disc support |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110607 | 400 nm membrane |
| Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110606 | 200 nm membrane |
| sodium phosphate | Sigma | S3264-500G | |
| VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm | VWR Scientific | 47729-572 | glass tubes |
| Perchloric acid | Sigma | 30755-500ML | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma | A-7302 | ammonium molybdate |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A7631-25G | sodium ascorbate |
| Bio-Beads SM2 adsorbents | Bio Rad | 1523920 | polystyrene beads |
| 2.0 ml Microtubes clear | VWR Scientific | 10011-742 | Reconstitution tubes |
| Reconstitution glass tube | VWR Scientific | 53283-800 | Reconstitution glass tubes |
| Zetasizer | Malvern | DLS |
References
- Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
- Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
- Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
- Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
- Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
- Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
- Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
- Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
- Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
- Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
- Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
- Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
- Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
- Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
- Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
- Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
- Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
- Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
- Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
- Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
- Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
- Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
- Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
- Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
- Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
- Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
- Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
- Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
- Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).
