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Developmental Biology

लंबी अवधि के लिए एक जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54636
Automatic Translation
*1, *1, 2
1Department of Orthopaedic Surgery, VU University Medical Center Amsterdam, MOVE Research Institute Amsterdam, 2Department of Anatomy, Embryology & Physiology, Academic Medical Center Amsterdam
* These authors contributed equally

Abstract

इसकी उपलब्धता के कारण, कम लागत, फ्लैट ज्यामिति, और पारदर्शिता, पूर्व लड़की भ्रूण ओवो ऐसे gastrulation 2 के रूप में morphogenetic घटनाओं के अध्ययन के लिए एक प्रमुख कशेरुकी पशु मॉडल, neurulation 3 बन गया है - 5, 6 somitogenesis, दिल झुकने 7, 8, और मस्तिष्क गठन 9 - 13, जल्दी embryogenesis के दौरान। morphogenetic प्रक्रियाओं को समझने की कुंजी उन्हें समय चूक इमेजिंग द्वारा गतिशील पालन करने के लिए है। लड़की embryogenesis पूर्व ओवो के समय चूक फिल्मों के अधिग्रहण भ्रूण 14 के आसपास के तापमान और आर्द्रता नियंत्रण करने के लिए एक मशीन के लिए कम समय के लिए खिड़कियों या जरूरत के लिए या तो सीमित किया गया है। यहाँ, हम संस्कृति लड़की के लिए एक नई तकनीक उच्च संकल्प समय चूक प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग के लिए पूर्व ओवो भ्रूण प्रस्तुत करते हैं। जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच अच्छी तरह से स्थापित फिल्टर पेपर वाहक techn का एक प्रकार हैique (ईसी-संस्कृति) 1 और एक जलवायु चैम्बर के लिए आवश्यकता के बिना लड़की भ्रूण के संवर्धन के लिए अनुमति देता है। भ्रूण दो समान फिल्टर पेपर वाहकों के बीच sandwiched है और पूरी तरह से एक सरल, तापमान नियंत्रित मध्यम प्रकाश खनिज तेल की एक परत से ढका में डूबे रखा है। कम से कम 28-विखंड चरण (HH16) 15 तक आदिम लकीर मंच (हैम्बर्गर हैमिल्टन चरण 5, HH5) 15 से शुरू, भ्रूण या तो उनके उदर या पृष्ठीय पक्ष के साथ संवर्धित किया जा सकता है। इस बार चूक भ्रूण के विकास के बारे में 30 मानव संसाधन को कवर फिल्मों के अधिग्रहण की अनुमति देता है। प्रतिनिधि समय चूक फ्रेम और फिल्में दिखाई जाती हैं। भ्रूण एक भ्रूण मानक चुनाव आयोग संस्कृति में संवर्धित करने के लिए आकृति विज्ञान तुलना कर रहे हैं।

जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच जल्दी पृष्ठीय और उदर morphogenetic प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक स्थिर वातावरण प्रदान करता है। यह भी ऐसी microsurgery, मनका छोटा सा भूत के रूप में, लाइव प्रतिदीप्ति इमेजिंग और micromanipulations के लिए अनुमति देता हैlantation, microinjection, जीन मुंह बंद करने, और electroporation, और एक मजबूत क्षमता है लेजर आधारित इमेजिंग (प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी सहित) के लिए विसर्जन उद्देश्यों के साथ जोड़ा जा सके।

Introduction

Embryogenesis इतिहास की शुरुआत के बाद से आदमी मोहित हो गया है। कैसे संरचना और एक भ्रूण की आकृति विज्ञान एक ऐसी अच्छी तरह से परिभाषित अस्थायी और स्थानिक ढंग से विकसित हो? लड़की भ्रूण कई कारणों के लिए embryogenesis के लिए शास्त्रीय कशेरुकी पशु मॉडलों में से एक बन गया है: यह आसानी से उपलब्ध, सस्ती, अपनी प्रारंभिक अवस्था में पारदर्शी, सुलभ और प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए है, के रूप में यह मां के बाहर विकसित करता है। इसके अलावा, यह इस तरह के दिल और दिमाग के गठन, gastrulation, neurulation, और somitogenesis 15 के रूप में जल्दी मॉर्फ़ोजेनेटिक घटनाओं के दौरान लगभग एक फ्लैट ज्यामिति है।

Morphogenetic प्रक्रियाओं सबसे अच्छा समझा जा सकता है, तो वे ऐसे समय चूक छवियों के अधिग्रहण के माध्यम के रूप में गतिशील रूप से अध्ययन कर रहे हैं। लड़की भ्रूण ओवो 16 में लेकिन प्रयोगात्मक जोड़तोड़ और पारेषण प्रकाश माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए सीमित दृश्यता के लिए गरीब पहुँच के साथ देखे जा सकते हैं। इसलिए, तोड़19 या explant संस्कृतियों 1,20 के रूप में - - 23 अल तकनीक संस्कृति लड़की भ्रूण पूर्व ओवो, या तो पूरी की जर्दी संस्कृति प्रणालियों 13,17 में करने का प्रस्ताव किया गया है। पूरे जर्दी संस्कृति प्रणालियों में, भ्रूण बरकरार जर्दी के शीर्ष पर बनी हुई है, और अंडे की सारी सामग्री ऊष्मायन के लिए एक और कंटेनर को सौंप दिया है। इस कंटेनर एक सरोगेट अंडे का खोल 17, एक पेट्री डिश 19, या एक झूला प्लास्टिक लपेटो चिपटना 13,18 से बना हो सकता है। पूरे जर्दी संस्कृतियों में भ्रूण आदर्श सेने तक सुसंस्कृत हो सकता है और micromanipulations के लिए सुलभ हो सकता है। इन तकनीकों में, रक्त परिसंचरण (जो विपरीत बढ़ जाती है) की दीक्षा के बाद भ्रूण के विकास का अध्ययन करते हुए युवा भ्रूण कल्पना करने के लिए कठिन रहने के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं। ये जल्दी भ्रूण सबसे अच्छा imaged किया जा सकता है, तो वे जर्दी से excised और इन विट्रो explants के रूप में सभ्य हैं। explants प्रयोग के लिए आसानी से सुलभ हैंअल जोड़तोड़ और संवर्धन के लिए कम जगह की आवश्यकता होती है। कई सालों के लिए, एक तकनीक Denis न्यू ने बीड़ा उठाया है 1955 और अपनी विविधताओं में लड़की भ्रूण के लिए explant संस्कृति तरीकों के स्वर्ण मानक थे, जिससे समय चूक माइक्रोस्कोपी और microsurgical हस्तक्षेप 20,21 के लिए भ्रूण सुलभ बना रही है। अपनी महान सफलता के बावजूद नई तकनीक अपेक्षाकृत मांग और समय लेने वाली है। Blastoderm अक्सर खिसकाते जब पीतक झिल्ली, blastoderm ले जाने, एक गिलास अंगूठी चारों ओर फैला है उचित तनाव 1 प्राप्त करने के लिए। इसके अलावा, भ्रूण केवल अपने उदर पक्ष के साथ संवर्धित किया जा सकता। चुनाव आयोग (प्रारंभिक चिकी) संस्कृति, एक और अधिक हाल तकनीक चैपमैन और COLLIGNON 1 द्वारा विकसित की है, एक केंद्रीय एपर्चर के साथ एक फिल्टर पेपर वाहक का उपयोग करके पीतक झिल्ली की खींच गतिरोध उत्पन्न। फिल्टर पेपर पीतक झिल्ली को देता है, जिससे इसकी प्राकृतिक तनाव को बनाए रखने, और एक तस्वीर के फ्रेम 1 जैसे भ्रूण के चारों ओर।भ्रूण तो, एक आगर-अंडे की सफ़ेदी तल पर सुसंस्कृत हैं आम तौर पर उनके उदर पक्ष के साथ। पृष्ठीय पक्ष संवर्धन HH8 15 और बड़ी उम्र में भ्रूण के लिए ही संभव लगता है। कई समूहों में इस तरह के सर्जिकल सिवनी फाइबर 24 या एक कोलेजन लेपित झिल्ली 25 से बनाया गया एक समर्थन के साथ आगर-अंडे की सफ़ेदी नीचे की जगह से उनकी जरूरतों के लिए फिल्टर पेपर वाहक ढाल लिया है। अक्सर, न्यू तकनीक के साथ या चुनाव आयोग संस्कृति के साथ सुसंस्कृत भ्रूण हवा के लिए उनके पृष्ठीय या उदर की सतह के साथ संपर्क में हैं, ऑक्सीजन प्रसार 1,20 सुविधा के लिए। ये explant संस्कृतियों माध्यम के वाष्पीकरण से बचने के लिए और बाहर सुखाने से भ्रूण को रोकने के लिए एक humidified वातावरण में रखा जाना है। इस सिक्त टिशू पेपर 1 से युक्त एक बड़ा पेट्री डिश में explant संस्कृति के साथ पकवान incubating द्वारा हासिल की है। इन भ्रूणों के समय चूक छवियों के अधिग्रहण के पूरे माइक्रोस्कोप या एक गुस्सा चारों ओर एक जलवायु नियंत्रित इनक्यूबेटर में से किसी के उपयोग की आवश्यकता हैature नियंत्रित एक गर्म ढक्कन के साथ कंटेनर प्रकाश पथ 14 में संक्षेपण को रोकने के लिए। हालांकि, लड़की भ्रूण भी पूर्व ओवो पूरी तरह से, के रूप में फिल्टर पेपर संस्कृतियों 25 मध्यम संस्कृति में डूबे हुए न्यू तकनीक 2,21 के adaptions में भारी खनिज तेल और अंडे की सफ़ेदी की एक परत के बीच sandwiched, या "कोर्निश पीले संस्कृति में मुड़ा blastoderm explants के रूप में विकसित कर सकते हैं "23,26, हवा के साथ सीधे संपर्क के बिना।

जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच फिल्टर पेपर वाहक तकनीक का एक नया संस्करण है। लड़की भ्रूण पूर्व ओवो संवर्धन पर पहले ज्ञान के संयोजन से, यह जलवायु नियंत्रित इनक्यूबेटर और गर्म ढक्कन नगण्य बनाता है। तापमान नियंत्रित होते हैं: भ्रूण दो समान (लेजर कट) फिल्टर पेपर वाहक 24 और सुसंस्कृत पूरी तरह से एक साधारण मध्यम संस्कृति (2 अनुपात Pannett-कॉम्पटन खारा 27,28 और एक 3 में पतली अंडे की सफ़ेदी) में डूबे हुए बीच sandwiched हैइंजी। प्रकाश खनिज तेल के माध्यम से शीर्ष पर चल की एक परत वाष्पीकरण 2,21 रोकता है और पर्यावरण के लिए गर्मी के नुकसान को कम करता है। कंटेनर के नीचे एक कांच की खिड़की है, और पूरे सेटअप एक ईमानदार लंबे समय तक काम दूरी जूम खुर्दबीन पर किया जाता है। इस सेटअप जल्दी आदिम लकीर मंच से 28-विखंड चरण से लेकर, भ्रूण के विकास के बारे में 30 घंटे की उच्च संकल्प brightfield और darkfield समय चूक फिल्मों के अधिग्रहण की अनुमति देता है (हैम्बर्गर हैमिल्टन के बराबर चरणों 5 ​​16, HH5-16 करने के लिए ) 15। भ्रूण को अपने उदर या पृष्ठीय पक्ष के साथ समान रूप से अच्छी तरह से संवर्धित किया जा सकता। (- 5, और जल्दी मस्तिष्क 9 - 13 जैसे, देर gastrulation 2, न्यूरल ट्यूब बंद होने के 3) विकास इसलिए, भ्रूण अवलोकन और उदर (जैसे, जल्दी दिल 7,8 और somitogenesis 6) और पृष्ठीय के हेरफेर करने के लिए पहुंच रहे हैं। जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच पीmicrosurgery, मनका आरोपण, microinjection, जीन मुंह बंद करने, और electroporation के अध्ययन के लिए एक सरल और स्थिर वातावरण rovides। इसके इमेजिंग संभावित लेजर आधारित इमेजिंग और विसर्जन उद्देश्यों (प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी सहित) का उपयोग करके बहुत आगे धक्का दिया जा सकता है।

Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पशु अधिनियम पर नीदरलैंड प्रयोगों के अनुसार आयोजित किया गया।

ध्यान दें: जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच विधि 1 से संशोधित किया गया है।

1. जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच तैयारी

  1. Pannett-कॉम्पटन (पीसी) -saline 27,28
    1. शेयर समाधान के लिए एक तैयार (ultrapure एच 1 एल 2 हे, सोडियम क्लोराइड की 121 जी, KCl की 15.5 जी, 2 CaCl · एच 2 ओ के 10.42 ग्राम, और 2 MgCl की 12.7 छ · 6H 2 ओ) और बी (की 1 एल ultrapure एच 2 ओ, ना की 2.365 जी 2 4 HPO · 2H 2 हे, और नः 2 4 पीओ की 0.188 जी · 2H 2 ओ स्वच्छ 1-एल की बोतलों में)। उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    2. (वर्षा से बचने के लिए इस क्रम में) शेयर समाधान बी के शेयर समाधान ए के 40 मिलीग्राम और 60 मिलीग्राम के साथ ultrapure एच 2 ओ के 900 मिलीलीटर के मिश्रण से पीसी-खारा के 1 एल तैयार करें। पीसी-खारा हौसले से मंगलवार को तैयारओम स्टॉक समाधान ए और बी हर हफ्ते।
      नोट: स्टॉक समाधान कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। Autoclaving और / या जोड़ने एंटीबायोटिक दवाओं या antimycotics आवश्यक नहीं हैं।
  2. निषेचित चिकन अंडे की गर्मी
    1. एक humidified इनक्यूबेटर में, उनके पक्ष में अंडे देते हैं और उन्हें 37.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक वे वांछित उम्र तक पहुँचते हैं।
      नोट: दो सप्ताह से अधिक स्टोर अंडे नहीं रह गया है (अधिमानतः 12 - 15 डिग्री सेल्सियस) प्रयोग करने से पहले, बच्चों में कमी काफी गिरावट आई है के रूप में
  3. फिल्टर पेपर वाहक (1 से अनुकूलित)
    1. यदि उपलब्ध है, एक लेजर काटने की मशीन का उपयोग मोटी निस्पंदन कागज (28 मिमी x 22 मिमी) से hourglass के आकार फिल्टर पेपर वाहक कटौती करने के लिए। 22 मिमी से 10.4 मिमी के लिए बीच में चौड़ाई शंकु। एक केंद्रीय अण्डाकार एपर्चर (10.6 मिमी x 5.5 मिमी) बाहर कट, फिल्टर पेपर वाहक का बड़ा पक्ष (चित्रा 1-एम के लिए अंडाकार केंद्रित समानांतर की लंबी अक्ष के साथ)।
      1. वैकल्पिक रूप से, सही आयामों के साथ एक गत्ता स्टैंसिल तैयार है और एक पेंसिल का उपयोग कर मोटी निस्पंदन कागज के लिए इसकी रूपरेखा और कहा कि केंद्रीय एपर्चर के हस्तांतरण। फिल्टर पेपर ठीक कैंची का उपयोग वाहक बाहर कट।
    2. दो समान फिल्टर पेपर वाहक कटौती के लिए प्रत्येक भ्रूण explanted किया जाना है। अतिरिक्त फिल्टर पेपर वाहक मामले में बैकअप के रूप में एक भ्रूण explanting दौरान खो जाता है तैयार करें।
  4. तापमान नियंत्रित तेल स्नान (प्रयोग के दिन पर)
    1. ईमानदार ज़ूम माइक्रोस्कोप की मोटर चालित XY-मंच के केंद्र में तापमान नियंत्रित बीकर रखें और इसके तापमान नियंत्रक करने के लिए बीकर कनेक्ट।
    2. वजन के रूप में कार्य और तापमान नियंत्रित बीकर के बीच में पकवान जगह के लिए एक 6 सेमी पेट्री डिश में चार बड़े स्टेनलेस स्टील के छल्ले (30 मिमी बाहरी व्यास, ऊंचाई में 4 मिमी, 1.5 मिमी की दीवार मोटाई) रखो।
      नोट: यह पेट्री डिश सिर्फ तेल छुट्टी समायोजित करने के लिए एक प्लेसहोल्डर के रूप में कार्य करता हैएल।
    3. प्रकाश खनिज तेल के 130 मिलीलीटर के साथ तापमान नियंत्रित बीकर भरें। यदि आवश्यक हो तो इतना है कि यह 6 सेमी पेट्री डिश के ऊपरी किनारे से नीचे के बारे में 3 मिमी समाप्त होता है तेल के स्तर को समायोजित करें।
    4. तापमान नियंत्रित बीकर से 6 सेमी पेट्री डिश निकालें और 40 डिग्री सेल्सियस के तापमान की स्थापना की।

2. जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच उत्पादन

  1. संस्कृति के माध्यम से (प्रयोग के दिन पर)
    1. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में (कदम 1.1.2 के लिए 1.1.1 में तैयार के रूप में) पीसी-खारा की 30 मिलीलीटर डालो। के लिए हर दो भ्रूण explanted जा करने के लिए पीसी-खारा के 30 मिलीलीटर से भरा एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयार करें।
    2. ध्यान से एक 10 सेमी पेट्री डिश में एक गैर-incubated अंडे दरार।
    3. पेट्री डिश की दीवारों के साथ एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट चलती है और पतली अंडे की सफ़ेदी में चूसने से पतली अंडे की सफ़ेदी हार्वेस्ट। एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 30 मिलीलीटर पतली अंडे की सफ़ेदी लीजिए के लिए प्रत्येक दो भ्रूण explanted किया जाना है। केवल टी प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करेंहिन अंडे की सफ़ेदी।
      नोट: आमतौर पर 3 - 4 अंडे की सफ़ेदी पतली के बारे में 30 मिलीलीटर की फसल अनुमति देते हैं।
    4. हर पीसी-खारा में पतली अंडे की सफ़ेदी के 20 मिलीलीटर डालो भरा 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब (कदम 2.1.1 में तैयार के रूप में)।
    5. धीरे ट्यूबों कई बार inverting द्वारा पतली अंडे की सफ़ेदी के साथ पीसी-खारा मिक्स। यह कई मिनट के लिए व्यवस्थित करने और जांच अगर मिश्रण है, यहाँ के बाद से संस्कृति के माध्यम से कहा जाता है, स्पष्ट है चलो। संस्कृति के माध्यम से स्पष्ट नहीं है, तो शेयर समाधान से ताजा पीसी-खारा तैयार करने और फसल ताजा पतली अंडे की सफ़ेदी।
  2. दो छोटे स्टेनलेस स्टील के छल्ले (20 मिमी बाहरी व्यास, ऊंचाई में 4 मिमी, 1.5 मिमी की दीवार मोटाई 6.5 मिमी रिंग में अंतर) के रूप में दूर संभव के रूप में एक नए सिरे से 6 सेमी प्लास्टिक पेट्री डिश में रखें और संस्कृति के 22 मिलीलीटर के साथ इसे भरने मध्यम एक 25 मिलीलीटर की प्लास्टिक पिपेट (चित्रा 1-एच) का उपयोग (कदम 1.4.4 के लिए 1.4.1 में तैयार के रूप में)। सुनिश्चित करें कि मध्यम के शीर्ष पर जमा मलबे अपकेंद्रित्र ट्यूब में रहता है।
  3. किसी भी मलबे ओ हटायेआर मध्यम एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करने से बुलबुले।
  4. पीसी-खारा के 75 मिलीलीटर के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश भरें (कदम 2.15 में इस्तेमाल किया जा सकता है)।
  5. इनक्यूबेटर से एक अंडे की जर्दी निकालें और यह भ्रूण के शीर्ष करने के लिए आने जाने के लिए 1 मिनट के लिए अपने पक्ष पर बेंच पर आराम करते हैं।
  6. ध्यान से एक पेट्री डिश में अंडे (चित्रा 1-ए) दरार। मोटी अंडे की सफ़ेदी में ठीक ऊतक कागज के एक टुकड़े के किनारे लेना और खींच रहा है, यदि आवश्यक हो तो द्वारा blastoderm केंद्र।
  7. एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट (टिप काट मोटी अंडे की सफ़ेदी के तेज की सुविधा के लिए के साथ) का उपयोग पेट्री डिश से पतले और मोटे अंडे की सफ़ेदी के सबसे निकालें।
  8. धीरे दूर, टिशू पेपर का एक टुकड़ा के साथ मोटी अंडे की सफ़ेदी पोंछते केंद्र (चित्रा 1-बी) से दूर ले जाकर भ्रूण के चारों ओर मोटी अंडे की सफ़ेदी में एक खिड़की बनाएँ। पीतक झिल्ली को संलग्न से टिशू पेपर रोकें।
  9. चिमटी का प्रयोग, ध्यान VITE पर एक फिल्टर पेपर वाहक जगहभ्रूण के चारों ओर lline झिल्ली, भ्रूण (चित्रा 1-सी) के पूर्वकाल पीछे धुरी के समानांतर अण्डाकार एपर्चर की लंबी अक्ष के साथ।
  10. फिल्टर पेपर वाहक के करीब है और जल्दी से पूरे फिल्टर पेपर वाहक (चित्रा 1-डी) के आसपास कटौती पीतक झिल्ली के माध्यम से नाखून काटने की कैंची से एक टिप चुटकी।
  11. चिमटी का प्रयोग, भ्रूण (चित्रा 1-ई) के पूर्वकाल पीछे धुरी के एक परोक्ष दिशा समानांतर में जर्दी से दूर फिल्टर पेपर वाहक उठा।
  12. चारों ओर फिल्टर पेपर वाहक बारी शीर्ष पर भ्रूण के उदर पक्ष है और पीसी खारा में यह डूब। एक परोक्ष दिशा में भ्रूण के पूर्वकाल पीछे अक्ष के साथ फिल्टर पेपर वाहक विसर्जित कर दिया।
  13. सभी जर्दी से छुटकारा पाने के लिए अभी भी पीतक झिल्ली और धीरे से एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट से पीसी-नमक के साथ यह निस्तब्धता द्वारा blastoderm संलग्न। फिल्टर पेपर वाहक एक पर जलमग्न की सम्पूर्णता रखेंडालूँगा बार (चित्रा 1-एफ)।
  14. एक परोक्ष दिशा में भ्रूण के पूर्वकाल पीछे अक्ष के साथ पीसी-खारा से फिल्टर पेपर वाहक निकालें और एक टिशू पेपर पर फिल्टर पेपर वाहक के किनारे dabbing द्वारा अतिरिक्त तरल से छुटकारा मिलेगा।
  15. फिल्टर पेपर क्षैतिज पकड़ो, भ्रूण का सामना करना पड़ के उदर पक्ष के साथ, और पहले एक के ऊपर एक और फिल्टर पेपर वाहक जगह है, चिमटी की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग कर। उनके छिद्र बिल्कुल मेल खाना चाहिए, जिससे फिल्टर पेपर की दो परतों (चित्रा 1-जी) के बीच भ्रूण sandwiching।
  16. इसके तत्काल बाद भ्रूण की पूर्वकाल पीछे अक्ष के साथ एक परोक्ष दिशा में संस्कृति के माध्यम में फिल्टर पेपर वाहक सैंडविच डूब। यह क्षेत्र दो स्टील के छल्ले (चित्रा 1-एच) के बीच अंतरिक्ष में फैले में रखें।
  17. अन्य दो के शीर्ष पर दो और इस्पात के छल्ले रखने, यकीन है कि बनाकर फिल्टर पेपर सैंडविच तय है कि ई के साथ एपर्चरMbryo पूरी तरह से (चित्रा 1-आई) खुला रहता है।
  18. मध्यम स्तर की जाँच करें और सुनिश्चित करें कि ऊपरी स्पेसर सिर्फ मध्यम में डूबे हुए है बनाते हैं। यदि आवश्यक हो, जोड़ने या मध्यम की छोटी मात्रा को हटा दें।
  19. ध्यान से तापमान नियंत्रित तेल स्नान के केंद्र में पेट्री डिश जगह है और तेल में तीन बड़े स्टेनलेस स्टील के छल्ले (30 मिमी बाहरी व्यास, ऊंचाई में 4 मिमी, 1.5 मिमी की दीवार मोटाई) पकवान के बगल में रखकर laterally पकवान स्थिर । सुनिश्चित करें कि स्टील के छल्ले पकवान (चित्रा 1-जे) के पक्ष स्पर्श करें।
  20. धीरे धीरे, एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ मध्यम के शीर्ष पर प्रकाश खनिज तेल का लगभग 6 एमएल पिपेट इतना है कि मध्यम खनिज तेल की एक सतत परत (चित्रा 1-के) के साथ कवर किया जाता है।
  21. समय चूक अधिग्रहण सेट करें।
    नोट: पांच ओवरलैपिंग उप छवियों (टाइल) की क्षैतिज पैनोरमा के रूप में भ्रूण इमेजिंग एक सामान्य overvi के साथ विस्तृत इमेजिंग (5X उद्देश्य) की अनुमति देता है,आकृति विज्ञान 29-30 की ईडब्ल्यू। 3 और 10 मिनट के बीच इमेजिंग अंतराल रूपात्मक की विस्तृत ट्रैकिंग के लिए अनुमति देने के 31, और छोटे जेड के ढेर के अधिग्रहण में परिवर्तन (30 माइक्रोन की दूरी के साथ पांच से सात विभिन्न विमानों) मोटा होना और भ्रूण 30 के मोड़ के अधिक के लिए क्षतिपूर्ति । उच्चतम विपरीत के साथ जेड विमानों (छवि अधिग्रहण के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें) समय चूक फिल्मों में एकल फ्रेम की आगे की प्रक्रिया 32 से पहले का चयन किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच की स्थापना। (ए) एक अंडे एक पेट्री डिश में टूट रहा है। (बी) मोटी और पतली अंडे की सफ़ेदी में से अधिकांश एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ पेट्री डिश से निकाल दिया जाता है (नहीं दिखाया गया है)। फिर, मोटी अंडे की सफ़ेदी में एक खिड़की बनाई गई है एकधीरे से एक टिशू पेपर के साथ मोटी अंडे की सफ़ेदी दूर पोंछते द्वारा भ्रूण दौर। (सी) एक फिल्टर पेपर वाहक जर्दी के शीर्ष पर blastoderm के आसपास रखा गया है। (डी) फिल्टर पेपर वाहक आसपास के पीतक झिल्ली और (ई) की जर्दी के शीर्ष से हटा से ढीले कट जाता है। (एफ) शेष जर्दी ध्यान से एक पीसी खारा स्नान में दूर धोया जाता है। (G) भ्रूण के लिए एक दूसरे के समान फिल्टर पेपर वाहक के साथ बैठा है। (एच) फिल्टर पेपर सैंडविच माध्यम में डूबे हुए है और (अप भ्रूण का सामना करना पड़ पृष्ठीय या उदर पक्ष) दो धातु स्टेनलेस स्टील के छल्ले पर तैनात हैं। (मैं) दो के छल्ले ऊपर से सैंडविच स्थिर। (जे) भ्रूण युक्त तापमान नियंत्रित तेल स्नान को सौंप दिया है पेट्री डिश। स्टेनलेस स्टील के छल्ले laterally पेट्री डिश को स्थिर। (कश्मीर) संस्कृति के माध्यम से खनिज तेल की एक परत के साथ कवर किया जाता है।(एल) जलमग्न फिल्टर सैंडविच के योजनाबद्ध। (एम) फिल्टर पेपर जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच के लिए इस्तेमाल किया वाहकों के आयाम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

चित्र 2
चित्रा 2: चुनाव आयोग संस्कृति 1 में और जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच संस्कृति में भ्रूण के बीच रूपात्मक तुलना करें। चयनित समय व्यतीत हो जाने के तख्ते 3 घंटा के अंतराल पर भ्रूण दिखा। फ्रेम्स पूर्ण भ्रूण आकृति विज्ञान के एक सिंहावलोकन दे करने के लिए आकार रहे हैं। भ्रूण 7-विखंड चरण (HH9) से 15 उम्र से मिलान किया गया। 0 घंटा प्रत्येक प्रयोग के शुरू इंगित करता है। पूर्वकाल बाईं ओर हमेशा होता है। छवियाँ darkfield रोशनी का उपयोग कर हासिल किया गया। (ए) के नीचे 1,33 एक आगर-अंडे की सफ़ेदी पर चुनाव आयोग संस्कृति 1, सुसंस्कृत उदर पक्ष में भ्रूण। उच्च गुणवत्ता के चित्र, हासिल किया जा सकता के रूप में भ्रूण जेड दिशा में ही सीमित है। (बी और सी) जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच में सुसंस्कृत दो भ्रूण: (बी) को उदर की ओर और (सी) पृष्ठीय पक्ष।फिल्टर पेपर सैंडविच में भ्रूण कम से कम 27 घंटे के लिए गुणात्मक मतभेद के बिना विकसित करना। वे कार्यात्मक रक्त परिसंचरण और कपाल और गर्भाशय ग्रीवा वंक विकास और सफलतापूर्वक बारी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समय चूक अधिग्रहण माइक्रोस्कोप उपलब्ध सिस्टम पर निर्भर करता है। इस अध्ययन के लिए, एक लंबे समय तक काम दूरी में, ईमानदार ज़ूम माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया गया था। जूम कारक 5X करने के लिए स्थापित किया गया था। आईपीस की 16X बढ़ाई साथ संयोजन में, इस 80X कुल बढ़ाई में हुई, 1.3 माइक्रोन / पिक्सेल का एक सैद्धांतिक संकल्प (के रूप में माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में कहा गया है) के साथ 30। क्षेत्र का दृश्य बढ़ाने के लिए, भ्रूण पांच उप छवियों (टाइल) की क्षैतिज पैनोरमा के रूप में imaged थे। इसलिए, एक टाइल क्षेत्र, पांच ओवरलैपिंग टाइल्स से मिलकर, 29 परिभाषित किया गया था। यह टाइल क्षेत्रतैनात किया गया था के रूप में तो पूरी तरह से अपने क्षैतिज विस्तार (चित्रा 2 बी - 0 एचआर) में फिल्टर पेपर वाहक के अण्डाकार एपर्चर कवर करने के लिए। प्रत्येक टाइल 2,048 x 2,048 पिक्सेल का एक आकार था, लगभग 2.7 मिमी की एक क्षेत्र का दृश्य कवर, और टाइल्स, जिसके परिणामस्वरूप में 10% की एक ओवरलैप के साथ हासिल किया गया, कुल क्षेत्र का दृश्य के लिए लगभग 12 मिमी x 2.7 मिमी चित्रमाला। मोटर XY-चरण लगभग 1.75 मिमी / अलग टाइल्स 29 के अधिग्रहण के बीच सेकंड की रफ्तार के साथ उद्देश्य के सापेक्ष ले जाया गया। लाइव छवि पूर्वकाल presomitic mesoderm और सबसे हाल ही में गठित somites (हमारे समूह का अनुसंधान ध्यान केंद्रित) पर ध्यान केंद्रित किया गया था। मोटा होना और जेड दिशा में भ्रूण की कर्लिंग के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, छोटे जेड ढेर (30 माइक्रोन की दूरी के साथ पांच से सात विभिन्न विमानों) हर समय बिंदु 30 में हासिल किया गया। ये presomitic mesoderm के पूर्वकाल टिप के फोकल हवाई जहाज़ के आसपास चयन किया गया था। समय चूक ACQ की अवधिuisition 50 घंटा के लिए स्थापित किया गया था, और 3, 4, या 10 मिनट के अंतराल इमेजिंग 31 चुने गए हैं। 10 घंटा और नए इष्टतम फोकल हवाई जहाज़ के आसपास Z ढेर पुनर्परिभाषित - समय व्यतीत हो जाने के अधिग्रहण की गुणवत्ता में हर 5 refocusing द्वारा सुधार किया जा सकता है। प्रयोग के अंत में, पूरे समय श्रृंखला मैन्युअल संपादित किया गया था, और सबसे अच्छा ध्यान देने के साथ z विमान युक्त छवियों के सबसेट बनाया है और एक अलग फ़ोल्डर 32 को बचा लिया गया था। छवियों की इन कैंपेन्स समय से सिले इष्टतम ध्यान देने के साथ छवियों का एक पूरा समय श्रृंखला बनाने के लिए थे। यह पूरा समय श्रृंखला के प्रत्येक छवि के टाइल्स सिले थे और छायांकन सुधार 30 बिना आपस में जुड़े हुए हैं, और समय चूक फ्रेम 100% आकार और 95% संपीड़न 32 के जेपीईजी छवियों के रूप में निर्यात किया गया। समय चूक फ्रेम पेशेवर वीडियो संपादन सॉफ्टवेयर में एक छवि अनुक्रम के रूप में आयात किया गया। विस्तृत 100% ज़ूम स्थिर हो गया है, और समग्र इसके विपरीत हमारे पसंद के हिसाब से समायोजित किया गया। अंतिम समय खामियों सांकेतिक शब्दों में बदलना थेसाथ 264 कोडेक डी और एमपीईजी -4 कंटेनरों में निर्यात किया। फिल्म 15 फ्रेम / सेक (एफपीएस) और 1920 x 1080 पिक्सल के एक संकल्प के एक फ्रेम दर पर प्रदर्शित कर रहे हैं।

चित्रा 2 चुनाव आयोग संस्कृति 1 (2A चित्रा) में एक भ्रूण और जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच संस्कृति में दो भ्रूण, एक होने के सुसंस्कृत उदर पक्ष (चित्रा 2 बी) और अन्य एक पृष्ठीय पक्ष (चित्रा 2 सी) के बीच एक तुलना से पता चलता। सभी भ्रूण उम्र से मिलान सात विखंड चरण (HH9) से 15 और 4 मिनट (चित्रा 2A और बी) या 10 मिनट (चित्रा -2) की एक अस्थायी समाधान के साथ imaged थे। 3 घंटा के अंतराल के चयनित फ्रेम चित्रित कर रहे हैं। चुनाव आयोग संस्कृति (2A चित्रा) भ्रूण नीचे 1,33 एक स्थिर आगर-अंडे की सफ़ेदी पर आराम करने के कारण बहुत ही स्थिर इमेजिंग की अनुमति दी। पूरे भ्रूण टी भर में एक फोकल हवाई जहाज़ में बने रहेवह पूरे समय चूक। इस छोटे प्रयोगों (कई घंटे) और बहुत जल्दी भ्रूण के लिए फायदेमंद हो सकता है, लेकिन यह जेड दिशा में भ्रूण, संभवतः लंबे समय में इसके सफल त्रि-आयामी विकास में बाधा उत्पन्न की एक मजबूत कारावास के साथ आता है। शुरुआत में, प्रसूति केवल एक भ्रूण को अपने उदर पक्ष (0 घंटा पर चित्रा 2A और 2 बी की तुलना) के साथ जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच में सुसंस्कृत की तुलना में भ्रूण के सिर के एक मामूली पार्श्व सपाट में हुई। बाद में, सिर के मोड़ बिगड़ा था (चित्रा 2A - 21 घंटा) और दिल की धड़कन धीमा। रक्त परिसंचरण लगभग बंद कर दिया। चुनाव आयोग संस्कृति में भ्रूण का पूरा समय चूक के लिए पूरक मूवी 1 देखें। जबकि कम बाईं तरफ के पैनल पूर्ण संकल्प में दिल विकास visualizes इस फिल्म में ऊपरी पैनल, भ्रूण की एक पूरी अवलोकन से पता चलता है। somites में presomitic mesoderm के विभाजन एसई हो सकता हैनिचले सही पर विस्तार से एन।

जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच में भ्रूण, दूसरे हाथ पर, केवल उन्हें आसपास झिल्ली की प्राकृतिक तनाव से उनकी तीन आयामी विस्तार में सीमित थे। वे अपने उदर (चित्रा 2 बी) या पृष्ठीय पक्ष (चित्रा 2 सी) के साथ सुसंस्कृत या तो हो सकता है। किसी भी तरह से, भ्रूण निरंतर somitogenesis दिखाया है, और उनके सिर बदल गया। वे कपाल और गर्भाशय ग्रीवा वंक और कार्यात्मक रक्त परिसंचरण विकसित की है। फिल्टर पेपर सैंडविच में दोनों भ्रूण, segmenting mesoderm पर ध्यान देने के साथ imaged किया गया तो यह है कि सिर के कुछ हिस्सों को धीरे-धीरे ध्यान से बाहर ले जाया गया के रूप में भ्रूण बढ़ी गाढ़ा, और बारी शुरू कर दिया है, जबकि mesoderm के विभाजन हिस्सा ध्यान में बने रहे (चित्रा 2 बी और -2 की तुलना में 21 घंटा के लिए 27 घंटा पर)। पूरक मूवी 2 भ्रूण की पूरी फिल्म समय चूक दर्शाया चलताचित्रा 2 बी में। इमेजिंग अंतराल 4 मिनट था। इस फिल्म के शीर्ष पैनल भ्रूण की एक पूरी अवलोकन से पता चलता है। भ्रूण के विकास के लगातार 46 से अधिक मानव संसाधन imaged किया गया था, लेकिन कुल मिलाकर मोटा होना और भ्रूण ऊतक के मोड़ के कारण लगभग 30 घंटे के बाद, segmenting mesoderm पर फोकस खो गया। निचले बाएँ पैनल का अधिग्रहण समय व्यतीत हो जाने के तख्ते से पूर्ण संकल्प में दिल के प्रारंभिक विकास से पता चलता है। midline के दोनों किनारों पर बनती हृदय primordia के विलय के माध्यम से, एक लगभग सीधे ट्यूबलर संरचना का गठन किया है, जो बाद में पिटाई और सही करने के लिए झुकने शुरू होता है। निचले सही पैनल सबसे हाल ही में गठित somites और पूर्ण संकल्प में presomitic mesoderm के पूर्वकाल टिप पता चलता है और समय के साथ नए somites के गठन पटरियों। पूरक मूवी 3 एक और भ्रूण सुसंस्कृत पता चलता है और जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच में उदर पक्ष imaged। इमेजिंग अंतराल 4 मिनट था। फिल्म वें शामिल किया गयामंच HH5-6 से लगभग करने के लिए भ्रूण के विकास के चरण ई HH14 15, संस्कृति समय की मोटे तौर पर 27 घंटा। सिर रूपों गुना और पीछे की प्रगति। अपने द्विपक्षीय primordia से दिल रूपों, धड़कन, और सही करने के लिए झुकता शुरू होता है। पहले तीन से चार somites एक साथ के रूप में। अतिरिक्त somites presomitic mesoderm के पूर्वकाल सिरे से क्रमिक रूप से बंद कली। कम पैनल सिर गुना और उच्च विस्तार के शुरू में दिल के गठन के अवलोकन के लिए अनुमति देता है, पूर्ण संकल्प में भ्रूण के सिर क्षेत्र से पता चलता है। भ्रूण की पारदर्शिता के कारण, न्यूरल ट्यूब के बंद होने से भविष्य सिर क्षेत्र में देखा जा सकता है। कम पैनल में पूर्ण इमेजिंग समय पर पूरा संकल्प में एक ही भ्रूण में पूरक मूवी 4 दिखाता विखंड गठन। पूरक मूवी 5 भ्रूण सुसंस्कृत पृष्ठीय पक्ष (चित्रा -2) का पूरा समय चूक से पता चलता है। इमेजिंग अंतराल 10 मिनट था। जबकि uppएर पैनल लगभग चरण HH16-17 करने के लिए सात विखंड चरण (HH9) से भ्रूण के विकास को दर्शाता है, कम पैनल पूर्ण संकल्प में उस स्तर पर जल्दी मस्तिष्क में morphological परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए फसली है। न्यूरल ट्यूब के स्थानीय सूजन मनाया जा सकता है, अग्रमस्तिष्क, मध्यमस्तिष्क, और पश्च मस्तिष्क की regionalization, जो बाद के चरणों में 13 भ्रूण के मस्तिष्क के पांच उपक्षेत्र में विभाजित होगा करने के लिए अग्रणी। इसके अलावा, ऑप्टिक पुटिकाओं के विकास को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। संस्कृति में लगभग 30 घंटे के बाद, भ्रूण मर रहा है।

microsurgical जोड़तोड़ के साथ जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच की अनुकूलता, कई polystyrene microbeads दिखाने के लिए (~ व्यास में 40 माइक्रोन) में या जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच संस्कृति में एक चिकन भ्रूण के presomitic mesoderm के आसपास के क्षेत्र में प्रत्यारोपित किया गया। microbeads पीबीएस में धोया गया भंडारण बफर और implan दूर करने के लिएटेड से पहले प्रकाश खनिज तेल की परत के साथ संस्कृति के माध्यम से कवर करने के लिए (प्रोटोकॉल खंड के 2.18 कदम की तुलना)। एक गिलास पाश्चर विंदुक मोती माइक्रोस्कोप के eyepieces के माध्यम से निगरानी में, भ्रूण सतह पर स्थानांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। पाँच छेद एण्डोडर्म में धीरे एक एक्यूपंक्चर सुई के साथ यह scraping द्वारा बनाया गया था। एक कस्टम बनाया जम्मू के आकार उपकरण, खींच और एक लौ में एक गिलास पाश्चर विंदुक झुकने के द्वारा बनाई गई, मोती में हेरफेर और उन्हें छेद में ध्यान से धक्का जब तक वे स्थिर हो गया करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। तीन छेद एक मनका प्रत्येक से भर गया (चित्रा 3 ए - 0 घंटा और 3 बी *) और दो मोती प्रत्येक (चित्रा 3 ए - 0 घंटा) के साथ दो छेद। चित्रा 3A शो, चयनित समय व्यतीत हो जाने के फ्रेम में, मोतियों की microsurgical आरोपण के बाद लड़की भ्रूण का विकास। तीन मोती सफलतापूर्वक इच्छित स्थान पर ऊतक में शामिल किया गया है, और उनके आंदोलन पर imaged किया गया थाउच्च विस्तार (चित्रा 3 बी) में प्रयोग के पाठ्यक्रम। भ्रूण के विकास में गड़बड़ी या मोतियों की उपस्थिति से प्रभावित होने लगते नहीं किया। पूर्ण समय चूक फिल्म के लिए पूरक मूवी 6 देखें। इमेजिंग अंतराल 4 मिनट था।

चित्र तीन
चित्रा 3: Microbead आरोपण के बाद समय चूक इमेजिंग। सबूत के सिद्धांत प्रयोग microbead आरोपण के साथ जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच की अनुकूलता दिखा। भ्रूण के सिर के बाईं ओर है, लेकिन यह इस प्रयोग के दौरान imaged नहीं किया गया था। छवियाँ darkfield रोशनी का उपयोग कर हासिल किया गया। (ए) चयनित समय व्यतीत हो जाने के सात microbeads के आरोपण के बाद 3 घंटा के अंतराल पर चालाकी से भ्रूण दिखा फ्रेम (~ 40 मीटर व्यास में)। भ्रूण लम्बी और लगातार अतिरिक्त Somit का गठनतों। तीन मोती ठीक से जुड़ी किया गया है और संस्कृति के 18 घंटा से अधिक ऊतक के प्रवाह के साथ मध्यवर्ती ले जाया गया लगते हैं। अन्य चार मोती उनके छेद से बाहर 6 और 9 के बीच popped संस्कृति के मानव संसाधन और पीछे चली गई। (बी) के तीन एकल मोती का विस्तृत दृश्य (बी 3 के लिए बी 1) प्रयोग की शुरुआत (0 घंटा, बी *) और ऊष्मायन के 12 घंटे के बाद (बी **) पर presomitic mesoderm में प्रत्यारोपित किया। सिर्फ बनाने somites की संख्या संकेत दिया है (** बी * में S9 और बी में S18)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1
पूरक मूवी 1: EC-संस्कृति उदर पक्ष। चुनाव आयोग संस्कृति में भ्रूण 1, सुसंस्कृत उदर पक्ष, सात विखंड चरण (HH9) 15 के बाद एक आगर-अंडे की सफ़ेदी Botto पर सेएम 1,33। इमेजिंग अंतराल 4 मिनट था। रिश्तेदार समय ऊपरी-बाएं कोने में प्रदर्शित किया जाता है। उच्च गुणवत्ता छवियों का अधिग्रहण किया जा सकता है के रूप में भ्रूण जेड दिशा में ही सीमित था। 21 घंटे के बाद, दिल की धड़कन और रक्त का प्रवाह लगभग गिरफ्तार किया गया था और भ्रूण बिखर शुरू कर दिया था। ऊपरी पैनल, भ्रूण का कोई आकार बदला अवलोकन से पता चलता है, जबकि कम पैनल दिल विकास (बाएं पैनल) और पूर्ण संकल्प (100% ज़ूम) में presomitic mesoderm (सही पैनल) के विभाजन कल्पना। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

फिल्म 2
पूरक मूवी 2: जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच उदर पक्ष। भ्रूण सात विखंड चरण (HH9) 15 के बाद, उदर सिड से जलमग्न कागज सैंडविच में संवर्धितई सामना करना पड़ रहा। इमेजिंग अंतराल 4 मिनट था। रिश्तेदार समय घंटा और मिनट में ऊपरी-बाएं कोने में प्रदर्शित किया जाता है, 24 घंटे के बाद शुरु। ऊपरी पैनल 46 घंटा से अधिक भ्रूण के विकास का कोई आकार बदला सिंहावलोकन, लगातार चलता। निचले बाएँ पैनल पहले 10 पूर्ण संकल्प (100% ज़ूम) में छवि अधिग्रहण के घंटे के दौरान जल्दी दिल विकास visualizes। निचले सही पैनल तक फोकस समग्र मोटा होना और भ्रूण ऊतक के मोड़ के कारण खो दिया है पूर्ण संकल्प (100% ज़ूम) में विकास के लगभग 30 घंटा से अधिक mesoderm segmenting दर्शाया गया है। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

मूवी 3
पूरक मूवी 3: सिर गुना गठन। से जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच में भ्रूण सुसंस्कृत उदर पक्ष वहविज्ञापन-प्रक्रिया / सिर गुना मंच (HH5-6) 15 लगभग 22-विखंड चरण (HH14) के लिए 15 से अधिक मोटे तौर पर 27 संस्कृति समय के मानव संसाधन। इमेजिंग अंतराल 4 मिनट था। रिश्तेदार समय ज और मिनट में ऊपरी-बाएं कोने में प्रदर्शित किया जाता है, 24 घंटे के बाद शुरु। ऊपरी पैनल भ्रूण के विकास का कोई आकार बदला अवलोकन से पता चलता है। कम पैनल पूर्ण संकल्प (100% ज़ूम) में भ्रूण के सिर क्षेत्र दर्शाया गया है। सिर गुना और जल्दी दिल और न्यूरल ट्यूब के बंद होने के गठन मनाया जा सकता है। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

मूवी 4
पूरक मूवी 4: Somitogenesis। सिर-प्रक्रिया / सिर गुना मंच (HH5-6) से जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच में भ्रूण सुसंस्कृत उदर पक्ष 15लगभग 22-विखंड चरण (HH14) 15 से अधिक मोटे तौर पर संस्कृति समय के 27 घंटा के लिए। इमेजिंग अंतराल 4 मिनट था। रिश्तेदार समय ज और मिनट में ऊपरी-बाएं कोने में प्रदर्शित किया जाता है, 24 घंटे के बाद शुरु। ऊपरी पैनल भ्रूण के विकास का कोई आकार बदला अवलोकन से पता चलता है। कम पैनल पूर्ण संकल्प (100% ज़ूम) में विभाजन paraxial mesoderm दर्शाया गया है। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

मूवी 5
पूरक मूवी 5: जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच पृष्ठीय पक्ष। लगभग HH16-17 चरण 15 को सात विखंड चरण (HH9) 15 से जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच में भ्रूण सुसंस्कृत पृष्ठीय पक्ष। इमेजिंग अंतराल 10 मिनट था। रिश्तेदार समय प्रदर्शित किया जाता हैमानव संसाधन और मिनट में ऊपरी-बाएं कोने में, 24 घंटे के बाद शुरु। ऊपरी पैनल भ्रूण के विकास का कोई आकार बदला अवलोकन से पता चलता है। कम पैनल पूर्ण संकल्प (100% ज़ूम) में जल्दी मस्तिष्क में morphological परिवर्तन को दर्शाया गया है। भ्रूण संस्कृति में लगभग 30 घंटे के बाद निधन हो गया। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

मूवी 6
पूरक मूवी 6: microbeads प्रत्यारोपित किया। लगभग 19 घंटे, नौ विखंड चरण (HH9-10) 15 से शुरू करने के लिए जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच में भ्रूण सुसंस्कृत उदर पक्ष। इमेजिंग अंतराल 4 मिनट था। रिश्तेदार समय ज और मिनट में ऊपरी-बाएं कोने में प्रदर्शित किया जाता है। साथ सात microbeads जनसंपर्क में प्रत्यारोपित ऊपरी पैनल पूंछ क्षेत्र का कोई आकार बदला अवलोकन से पता चलता हैesomitic mesoderm। कम पैनल पूर्ण संकल्प (100% ज़ूम) में प्रत्यारोपित microbeads के साथ इस क्षेत्र से पता चलता है। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

Discussion

अच्छी तरह से स्थापित चुनाव आयोग संस्कृति 1 का एक नया संस्करण के रूप में, जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच के चारों ओर एक तापमान और आर्द्रता नियंत्रित इनक्यूबेटर बनाकर ओवो जल्दी लड़की भ्रूण पूर्व की लंबी अवधि के brightfield और darkfield समय चूक फिल्मों के अधिग्रहण की सुविधा माइक्रोस्कोप नगण्य। बल्कि एक अर्द्ध ठोस आगर-अंडे की सफ़ेदी तल पर सुसंस्कृत होने की तुलना में, भ्रूण पूरी तरह से पीसी-खारा और पतली अंडे की सफ़ेदी से मिलकर एक साधारण मध्यम संस्कृति में डूबे रखा जाता है। वाष्पीकरण और गर्मी के नुकसान संस्कृति के माध्यम से शीर्ष पर चल खनिज तेल की एक परत से कम कर रहे हैं। भ्रूण गुणवत्ता में दिखाई मतभेद के बिना, आसानी से संवर्धित किया जा सकता है या तो पृष्ठीय या उदर पक्ष। यहाँ दिखाया गया है, जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच में भ्रूण, microsurgical हस्तक्षेप करने के लिए पहुंच रहे हैं morphogen लथपथ मोती के आवेदन की तरह। भविष्य अनुप्रयोगों को लाइव प्रतिदीप्ति इमेजिंग, microinjections और electroporation, और जीन एमए करने के लिए मुंह बंद में शामिलnipulate और उदर (जैसे, जल्दी दिल और somitogenesis) और पृष्ठीय (जैसे, देर gastrulation, न्यूरल ट्यूब बंद करने, और जल्दी मस्तिष्क) के विकास के दौरान मॉर्फ़ोजेनेटिक घटनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन। एक समय पर निर्भर करता है, तो दवा इलाज संभव फिल्टर पेपर सैंडविच युक्त पेट्री डिश एक छिड़काव चैम्बर साथ बदल दिया है, खनिज तेल की परत के नीचे मध्यम संस्कृति के आदान-प्रदान की अनुमति है। जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच लेजर आधारित इमेजिंग और विसर्जन उद्देश्यों (प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी सहित) के साथ संयोजन में अपनी पूरी इमेजिंग क्षमता का विकास होगा।

जलमग्न फिल्टर पेपर सैंडविच की तैयारी के साथ कुछ कठिनाइयों निम्नलिखित पैराग्राफ में संबोधित किया जाएगा। हालांकि यह फिल्टर पेपर सैंडविच में जर्दी से एक भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए केवल प्रशिक्षण के एक उदार राशि की आवश्यकता है, कई कदम अभी भी काफी संस्कृति में भ्रूण की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। इससे पहले फिल्टर पेपर वाहक हैजर्दी पर रखा, भ्रूण के चारों ओर पीतक झिल्ली किसी भी मोटी अंडे की सफ़ेदी से मुक्त किया जाना चाहिए। तभी फिल्टर पेपर और पीतक झिल्ली के बीच संबंध काफी मजबूत पीसी-खारा में कपड़े धोने का सामना करने के लिए किया जाएगा। फिल्टर भ्रूण ले जाने जितना संभव हो कम तरल / एयर इंटरफेस पार करना चाहिए कागज झिल्ली पर तनाव कम करने के लिए। एक बार धोने के लिए पीसी-खारा में लाया, पूरे फिल्टर पेपर वाहक पूरी तरह से हर समय जलमग्न रहना चाहिए। 60 सेकंड के रूप में पीतक झिल्ली फिल्टर पेपर से रिहा शुरू होगा - पीसी-खारा स्नान में समय के बारे में 30 तक सीमित किया जाना चाहिए। फिर भी, भ्रूण की सफाई, बहुत अच्छी तरह से निष्पादित किया जाना चाहिए जर्दी अवशेष बाद में भ्रूण के मद्देनजर अस्पष्ट होगा। धोने के दौरान, त्रिज्यात इससे दूर सीधे भ्रूण पर स्थानांतरित पिपेट से धारा बात है, लेकिन हमेशा कभी नहीं। पीसी-खारा से भ्रूण को हटाने के बाद, क्षैतिज फिल्टर पेपर धारण करने के लिए कम से कम करने के लिए सुनिश्चित करेंभ्रूण झिल्ली पर तनाव। फिर, दूसरी फिल्टर पेपर वाहक के साथ भ्रूण को स्थिर। एक बार दूसरे फिल्टर पेपर वाहक रखा गया है, किसी भी पार्श्व तनाव है, जो फिल्टर पेपर वाहक एक दूसरे के सापेक्ष पारी और भ्रूण झिल्ली फाड़ सकता बनाने से बचें। फिल्टर पेपर सैंडविच संस्कृति के माध्यम में लाया जाता है, यह भी हवा / तरल इंटरफेस पार करना चाहिए केवल एक बार झिल्ली पर तनाव कम करने के लिए। स्टेनलेस स्टील के ऊपर से फिल्टर पेपर सैंडविच को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल के छल्ले की दूसरी जोड़ी बहुत धीरे से रखा जाना चाहिए और भ्रूण झिल्ली के संपीड़न कम करने के लिए बिना किसी दबाव के। भ्रूण के क्षेत्र opaca के छोटे ruptures आमतौर पर संस्कृति के पहले घंटे के दौरान ठीक है, लेकिन एक क्षतिग्रस्त भ्रूण और हमेशा एक नया नमूना द्वारा प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए सकता से पहले तेल की परत संस्कृति के माध्यम से शीर्ष पर pipetted है।

छवि के लिए एक पूरे भ्रूण या उच्च संकल्प समय चूक फिल्मों के लिए कई नमूने, Microscope एक मोटर चालित XY-चरण, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए। यह एक न्यूनतम गति के साथ XY-मंच चाल भ्रूण और संस्कृति के माध्यम से और तेल में turbulences, जो छवि गुणवत्ता में कमी होगी करने के लिए क्षति से बचने के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है। यहाँ प्रस्तुत समय चूक फिल्मों के अधिग्रहण के लिए, मोटर XY-चरण लगभग 1.75 मिमी / सेकंड की गति के साथ ले जाया गया। भविष्य में, इमेजिंग आगे पहले इच्छित स्थान के लिए मंच चलती है और कंपन और turbulences दूर नहीं हो पाती जाने के लिए एक छोटी बाकी अवधि के बाद छवि प्राप्त करने से सुधार किया जा सकता है।

एक सीमा के रूप में, संभावित उपयोगकर्ताओं अपेक्षाकृत लंबे समय तक काम दूरी (लगभग 1 सेमी) इस संस्कृति विधि के लिए आवश्यक के बारे में पता है, तो विसर्जन उद्देश्यों के बिना एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जाता है होना चाहिए। भ्रूण के शीर्ष पर माध्यम की परत से और खनिज तेल की यह दूरी काम का परिणाम है। 6 सेमी पेट्री डिश में तेल की परत एक thicknes हैलगभग 1 के एस - 1.5 मिमी, और भ्रूण लगभग 4 मिमी संस्कृति माध्यम में गहरे डूबे हुए है। उद्देश्य के व्यास के आधार पर, 6 सेमी पेट्री डिश के ऊपरी छोर भी भ्रूण तक पहुँच को सीमित कर सकता है। यह एक बड़ा पकवान का उपयोग करके धोखा दिया जा सकता है।

ऊपर से काम दूरी थोड़ा तरल परतों की मोटाई को कम से कम किया जा सकता है। इसके अलावा, नीचे से काम दूरी भ्रूण आगे पेट्री डिश के नीचे करने के लिए नीचे लाने और गर्म बीकर की खिड़की के कांच की मोटाई कम से कम किया जा सकता है। प्रोटोकॉल एक ईमानदार लंबे समय तक काम दूरी ज़ूम माइक्रोस्कोप के साथ काम करने के लिए अनुकूलित किया गया था, जबकि यह एक औंधा माइक्रोस्कोप के रूप में अच्छी तरह से फिट किया जा सकता है। भविष्य के उपयोगकर्ताओं, मन में है कि संस्कृति के माध्यम में भी गहराई से भ्रूण जलमग्न ओ 2 -diffusion समस्याओं का नेतृत्व कर सकते में रखना चाहिए हालांकि प्रारंभिक प्रयोगों का सुझाव है कि सीमित प्रसार के लिए एक समस्या हो प्रतीत नहीं होताएलईएम, जब तक भ्रूण संस्कृति के माध्यम से और फिल्टर पेपर sandwiched की एक पर्याप्त-बड़े जलाशय से घिरा हुआ है पेट्री डिश की तह तक नहीं दबाया जाता है।

एक और सीमा तापमान नियंत्रण है। 40 डिग्री सेल्सियस तक गर्म बीकर के लिए नियंत्रक के तापमान को समायोजित करके, मध्यम तापमान में भ्रूण जब मध्यम खनिज तेल के साथ कवर किया जाता है चारों ओर 37.5 डिग्री सेल्सियस तक equilibrates। इससे पता चलता है कि कुछ ऊर्जा बीकर, जहां हीटिंग तत्वों और तापमान संवेदक स्थित हैं के नीचे, और भ्रूण के स्थान के बीच खो दिया है। तापमान नियंत्रण सेंसर स्थानांतरित करने और हीटिंग तत्वों पुनर्वितरण द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों को एक ZonMW-VICI अनुदान 918.11.635 (नीदरलैंड) से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं। लेखकों उनके व्यावहारिक सुझाव के लिए और माइक्रोस्कोपी पर उपयोगी सलाह के लिए सेटअप घटकों और कार्ल जीस नीदरलैंड के Jarno Voortman के निर्माण के लिए Vrije Universiteit एम्स्टर्डम के उपकरण की दुकान का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। Marjolein Blaauboer गंभीर रूप से पांडुलिपि के कई ड्राफ्ट पर टिप्पणी में एक महान समर्थन किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q Reference Water Purification System Millipore Z00QSV0WW 
Duran laboratory bottles, with caps, 1 L Sigma-Aldrich/Duran Z305200-10EA 
Name Company Catalog Number Comments
Solution A
NaCl Merck Millipore 1064041000
KCl Merck Millipore 1049361000
CaCl2·H2O Merck Millipore 1023821000
MgCl2·6H2O Merck/Sigma-Aldrich 13152-1KG-D 
Name Company Catalog Number Comments
Solution B
Na2HPO4·2H2O Merck 1065801000
NaH2PO4·2H2O Merck 1063420250
Name Company Catalog Number Comments
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 Sigma-Aldrich 10311611
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130 W, wavelength 10.6 µm Micro Lasersystems
Tork Extra Soft Facial Tissues Tork 140280
Latex gloves Sigma-Aldrich Z645613
EMDAMED EMDA 300.131
Transfer pipettes Sigma-Aldrich Z350613
VWR WITG5.480.003
Accu-jet pro Pipette Controller BrandTech Scientific 26332
Serological plastic pipettes, 25 ml Sigma-Aldrich CLS4251
Plastic document sleeves
Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40 Fiem
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 cm Tissue culture dishes Sigma-Aldrich P5731
Greiner Bio-one 664160
6 cm Petri dishes Sigma-Aldrich P5481
50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes Sigma-Aldrich T2318
greiner bio-one 227261
Name Company Catalog Number Comments
Stainless steel rings, custom-made
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring
Nail scissors
Forceps, Dumont #5, Inox Fine Science Tools , F.S.T. 11251-20
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper VWR 21-102
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil Sigma-Aldrich CAS Number 8042-47-5
Name Company Catalog Number Comments
Agar bottoms for EC culture
Agarose Sigma-Aldrich A9539 SIGMA
NaCl Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Name Company Catalog Number Comments
Microbead implantation
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) Polysciences, Inc. 16905-1
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30 mm SEIRIN  type J, No.02, 0.12x30mm
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 
Name Company Catalog Number Comments
Temperature controlled beaker
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M Omega RTD-850M
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M Omega HSRTD-3-100-A-1M
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 Omega EXTT-3CU-26S-50
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M Omega MTP-U-M
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P Omega KHLV-103/(10)-P
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC Omega CNi16D24-C4EIT-DC
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)
Name Company Catalog Number Comments
Microscope setup
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN Carl Zeiss AG 495010-0009-000
Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56 mm Carl Zeiss AG 435281-9100-000
Manual Rotary Control MARC Carl Zeiss AG 435604-0000-000
Transillumination top 450 mot Carl Zeiss AG 435500-9000-000
Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D) Carl Zeiss AG 435465-9020-000
Insert plate S, glass 237x157x3 mm (D) Carl Zeiss AG 435465-9053-000
Controller EMS 3 Carl Zeiss AG 435610-9010-000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss AG 435611-9010-000
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera Hamamatsu C11440-22CU
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual Carl Zeiss AG 490004-0025-000
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US Carl Zeiss AG 410373-0200-000
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" Carl Zeiss AG 410350-2403-000 not available anymore
ZEN pro 2012 Hardware License key Carl Zeiss AG 410135-1002-120 not available anymore
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key Carl Zeiss AG 410136-1045-110
ZEN module Z Stack Carl Zeiss AG 410136-0030-110
ZEN Module Tiles/ Positions Carl Zeiss AG 410136-1025-110
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss AG 410136-1031-110
ZEN Module Experiment Designer Carl Zeiss AG 410136-1022-110
ZEN Desk 2012 Hardware License Key Carl Zeiss AG 410135-1004-120 not available anymore

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References

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  32. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Importing and exporting images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf (2014).
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Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (118), e54636, doi:10.3791/54636 (2016).

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