Abstract
5、体節形成6、7を曲げ心、 - 、その可用性、低コスト、フラット形状、および透明性に、ニワトリ胚、卵の元には 、原腸陥入2、神経胚形成3のような形態形成のイベント、の研究のための主要な脊椎動物のモデルとなっています初期胚形成の間に13、 - 8、および脳の形成9。形態形成のプロセスを理解する鍵は、タイムラプスイメージングによって動的に従うことです。ひよこ胚発生の元と、卵のタイムラプスムービーの買収は、短い時間のウィンドウにまたは胚14の周囲の温度と湿度を制御するために、インキュベーターの必要性にも限定されています。ここで、我々は文化のひよこに新しい手法を提示すると、透過光顕微鏡を用いた高解像度タイムラプスイメージングのための元、卵を胚。水没ろ紙サンドイッチは、十分に確立されたフィルターペーパーキャリアのTECHNの変形でありますiQue（EC-文化）1と気候室を必要とせずにニワトリ胚の培養を可能にします。胚は、2つの同一のろ紙キャリアとの間に挟まれている、完全に軽質鉱油の層で覆われた単純な、温度制御媒体に浸漬維持されます。少なくとも28体節期（HH16）15まで原始線条段階（ハンバーガー・ハミルトンステージ5、HH5）15から出発し、胚はどちらか自分の腹や背側を上にして培養することができます。これは、胚発生の約30時間をカバーするタイムラプスムービーの取得を可能にします。代表タイムラプスフレームとムービーが示されています。胚は、標準のEC培養で培養した胚に形態学的に比較されます。
水没ろ紙サンドイッチは、早期背側と腹側の形態形成過程を研究するための安定した環境を提供します。それはまた、顕微手術、ビーズIMPとして、ライブ蛍光イメージングとmicromanipulationsを可能にしますlantation、マイクロインジェクション、遺伝子サイレンシング、およびエレクトロポレーション（光シート顕微鏡を含む）レーザーベースのイメージングのための液浸対物レンズと結合する強い可能性を有します。
Introduction
胚は、歴史の初めから人を魅了しています。どのように胚の構造および形態は、明確に定義された時間的、空間的な方法で開発するのですか？ニワトリ胚は、いくつかの理由のために、胚発生のための古典的な脊椎動物のモデルの一つとなっている：それは母親の外に展開するように、それは、簡単に、入手可能な安価な、その初期の段階では透明、および実験操作のためにアクセス可能です。また、それは、心臓や脳の形成、原腸形成、神経胚形成、および体節形成15早けれ形態形成のイベント、中にはほぼフラットな形状を有します。
彼らはそのようなタイムラプス画像の取得を通るように、動的に検討されている場合、形態形成のプロセスは、最もよく理解することができます。ニワトリ胚は、卵 16 ではなく、実験操作や透過光顕微鏡イメージングのための限られた視界の貧アクセシビリティ可視化することができます。したがって、切断19または外植片培養1,20として- - 23らの技術は13,17全体卵黄培養系のいずれかで、 元のOVO培養ニワトリ胚に提案されています。全卵黄培養系では、胚は、無傷の卵黄の上に残り、卵の全体の内容は、インキュベーションのために別の容器に移されます。このコンテナは、代理卵殻17、ペトリ皿19、またはプラスチック製のラップラップ13,18製ハンモックすることができます。全体卵黄培養中の胚は、理想的には孵化し、micromanipulationsにアクセス可能になるまで培養することができます。若い胚を視覚化するのは難しいままでこれらの技術は、（コントラストを増大させる）、血液循環の開始後の胚の発達を研究するために特に有用です。彼らは卵黄から切り出し、 インビトロ外植片として培養されている場合は、これらの初期胚は、最良の画像化することができます。外植片は、実験のために簡単にアクセスできますアル操作および培養のためのより少ないスペースを必要とします。長年にわたり、1955年にデニス新によって開拓された技術とそのバリエーションは、それによってタイムラプス顕微鏡および顕微介入20,21のための胚がアクセスできるよう、ニワトリ胚のための移植片培養法の黄金の基準でした。その偉大な成功にもかかわらず、新規の技術は、比較的厳しいと時間がかかります。胚盤葉を運ぶ卵黄膜は、適切なテンション1を達成するためにガラスリングに張架されたときに胚盤葉は頻繁に切り離します。さらに、胚は、その腹側を上にして培養することができます。 EC（初期チック）文化、チャップマンとコリニョン1によって開発されたより最近の技術は、中央の開口部とフィルターペーパーキャリアを使用して、卵黄膜の延伸を回避します。濾紙によりその自然の張力を維持し、卵黄膜に付着し、画像フレーム1のような胚を取り囲みます。胚では通常、腹側を上にして、寒天、卵白底に培養されます。背側を上に培養することはHH8 15歳以上で胚のためにのみ可能と思われます。多くのグループが、このような外科手術用縫合糸の繊維24またはコラーゲン被覆膜25からなる支持体と寒天卵白底を交換するなど、ニーズにろ紙キャリアを適応しています。多くの場合、新規の技術を持つまたはEC文化を用いて培養した胚は、酸素拡散1,20を容易にするために、空気中に自分の背や腹面で、露出しています。これらの外植片培養物は、培地の蒸発を回避し、乾燥から胚を防ぐために、加湿雰囲気中で維持されなければなりません。これは、湿ったティッシュペーパー1を含むより大きなペトリ皿に外植片培養物を皿をインキュベートすることによって達成されます。これらの胚のタイムラプス画像の取得は、全体顕微鏡や気性の周りの気候制御インキュベーターの使用のいずれかが必要ature-制御された光路14に結露を防止するために加熱された蓋付き容器。完全に、ろ紙培養25として培養液中に沈め新の技術2,21のadaptionsで重鉱物油と卵白の層の間に挟まれた、または「コーニッシュペースト状文化で折り畳まれた胚盤葉外植片としてOVOしかし、ニワトリ胚は、また元に開発することができます「23,26、空気との直接接触なし。
浸漬濾紙サンドイッチを濾紙キャリア技術の新たな変異体です。 元オボひよこの胚を培養することで、以前の知識を組み合わせることで、気候制御インキュベーターと加熱蓋不要になります。胚は、二つの同一の（レーザーカット）との間に挟まれている、完全に単純な培地（Pannett-コンプトン生理食塩水27,28および3の薄い卵白：2の比率）に沈めろ紙キャリア24と培養含まれて制御された温度でえー。媒体の上に浮遊軽質鉱油の層を蒸着2,21を防止し、環境への熱損失を最小限に抑えます。容器の底部は、ガラス窓を有し、全体のセットアップは、直立長作動距離のズーム顕微鏡で行われます。ハンバーガー・ハミルトンこの設定は28体節期に早期原始線条段階に至るまで、胚発生の約30時間の高解像度明と暗視野タイムラプスムービーの取得を可能にする（等価は16、HH5-16に5段）15。胚は、彼らの腹や背側を上にして同様に良好に培養することができます。 （ - 5、および初期の脳の9から13 例えば、後期原腸陥入2、神経管閉鎖3）開発したがって、胚を観察し、腹側（ 例えば、初期の心臓7,8および体節形成6）と背側の操作にアクセスできます。水没ろ紙サンドイッチPマイクロサージェリー、ビーズ移植、マイクロインジェクション、遺伝子サイレンシング、およびエレクトロポレーションの研究のためのシンプルで安定した環境をrovides。そのイメージング電位と液浸対物レンズ（光シート顕微鏡を含む）レーザーベースのイメージングを使用して、はるかにさらに押し込むことができます。
Protocol
全ての実験手順は、動物の法律上のオランダの実験に従って行いました。
注：浸漬濾紙サンドイッチ法は1から変更されています。
1.水中フィルターペーパーサンドイッチ準備
- Pannett-コンプトン（PC）-saline 27,28
- ストック溶液を（超純粋H 2 Oの1 L、塩化ナトリウム、塩化カリウム、 塩化カルシウムの10.42グラムの15.5グラムの121グラム・H 2 O、およびMgCl 2の12.7グラム・6H 2 O）を準備し、Bの（1 L超純H 2 O、2.365グラムのNa 2 HPO 4・2H 2 O、およびのNaH 2 PO 4の0.188グラム・2H 2 O）きれいな1-Lボトルインチ4℃で保管してください。
- （沈殿を避けるために、この順序で）のストック溶液Bの40原液Aのmlを、60 mlの超純粋H 2 O 900 mlと混合することによってPC-食塩水1リットルを調製。 PC-生理食塩水たてのFRを準備オム原液A及びB毎週。
注：ストック溶液は、数ヶ月間、4℃で保存することができます。オートクレーブ処理および/または抗生物質または抗真菌剤を添加することは必要ありません。
- ニワトリ受精卵のインキュベーション
- 加湿インキュベーターでは、彼らの側に卵を産むし、それらが所望の年齢に達するまで、37.5℃でそれらをインキュベートします。
注：もはや2週間以上ストアの卵（好ましくは12時 - 15°C）、実験前に、孵化率が大幅に低下するように
- 加湿インキュベーターでは、彼らの側に卵を産むし、それらが所望の年齢に達するまで、37.5℃でそれらをインキュベートします。
- 濾紙担体（1から適応）
- 可能な場合は、厚手の濾紙（28ミリメートル×22 mm）のからの砂時計状のろ紙キャリアを切断するためにレーザ切断機を使用しています。 10.4ミリメートルに22ミリメートルから中央に幅を先細り。フィルターペーパーキャリアの大きい側に楕円向いパラレル（ 図1-Mの長軸と、中央の楕円形の開口部（X 5.5ミリメートル10.6ミリメートル）を切り出します）。
- 必要に応じて、正しい寸法で段ボール原紙を準備し、鉛筆を使用して、厚手のろ過紙にその概要と中央開口部のそれを転送します。細かいハサミを使用して、ろ紙のキャリアを切り出します。
- 各胚を外植するための2つの同一のろ紙キャリアをカットします。胚が外植中に紛失した場合のバックアップとして余分なろ紙キャリアを準備します。
- 可能な場合は、厚手の濾紙（28ミリメートル×22 mm）のからの砂時計状のろ紙キャリアを切断するためにレーザ切断機を使用しています。 10.4ミリメートルに22ミリメートルから中央に幅を先細り。フィルターペーパーキャリアの大きい側に楕円向いパラレル（ 図1-Mの長軸と、中央の楕円形の開口部（X 5.5ミリメートル10.6ミリメートル）を切り出します）。
- （実験の日に）温度制御油浴
- 直立ズーム顕微鏡の電動式XYステージの中央に温度制御されたビーカーを置き、その温度コントローラにビーカーを接続します。
- 重みとして作用し、温度制御されたビーカーの中央に皿を置くを6 cmのペトリ皿に四大ステンレス鋼リング（30 mmの外径、高さ4mmの1.5ミリメートルの壁の厚さ）を置きます。
注：このペトリ皿は、ちょうどオイルLEVEを調整するためのプレースホルダとして機能しますリットル。 - 軽鉱物油の130ミリリットルと温度制御ビーカーを埋めます。必要であれば、それは約3ミリメートル6センチメートルペトリ皿の上縁の下に終了するようにオイルレベルを調整します。
- 温度制御されたビーカーから6センチメートルペトリ皿を取り外し、40℃に温度を設定。
2.水中フィルターペーパーサンドイッチ生産
- （実験の日に）培地
- 50mlの遠心分離チューブに（ステップ1.1.2に1.1.1で調製した）PC-の生理食塩水30ミリリットルを注ぎます。すべての2胚を外植するために、PC-の生理食塩水30ミリリットルを入れた1 50ml遠心チューブを準備します。
- 慎重に10センチメートルペトリ皿に非インキュベートした卵を割ます。
- ペトリ皿の壁に沿ってプラスチック製のトランスファーピペットを移動させ、薄い卵白に吸引して薄い卵白を収穫。各2胚を外植するために50ミリリットルの遠心管に30ミリリットルに薄い卵白を収集します。唯一のトンを取得することを確認します卵白ヒン。
注：通常3から4卵は薄い卵白の約30ミリリットルの収穫を可能にします。 - （ステップ2.1.1で調製した）すべてのPC-生理食塩水に薄い卵白の20ミリリットルを入れ、50 ml遠心チューブを満たしました。
- 静かにチューブを数回反転させて薄い卵白を搭載したPC-生理食塩水を混ぜます。それは数分のために解決し、ここ以降から培養液と呼ばれる混合物は、明確であるかどうかを確認してみましょう。培地は明確ではない場合は、原液と収穫新鮮な薄い卵白から新鮮なPC-生理食塩水を準備します。
- 新鮮に6cmのプラスチックシャーレにできるだけ離れ二つの小さなステンレス鋼リング（20ミリメートル外径、高さ4ミリメートル、1.5ミリメートルの壁の厚さ、リング内の6.5ミリメートルのギャップ）を配置し、文化の22ミリリットルでそれを埋めます培地25ミリリットルのプラスチックピペット（ 図1-H）を使用して（ステップ1.4.4に1.4.1で調製しました）。媒体上に蓄積された残骸は遠心管に残っていることを確認してください。
- 任意の破片Oを削除しますrはプラスチックトランスファーピペットを用いて培地から気泡。
- PC-生理食塩水75mlで10センチメートルペトリ皿を埋める（ステップ2.15で使用されます）。
- インキュベーターから卵を取り出して、それが胚は卵黄の一番上に来るようにする1分間の側のベンチに置いても。
- 慎重にペトリ皿（ 図1-A）に卵を割ます。濃厚卵白における微細組織の一枚の紙の端を浸し、必要に応じて、引っ張ることにより、胚盤葉を中央に配置します。
- （濃厚卵白の取り込みを容易にするために、カットオフチップを備えた）プラスチック製トランスファーピペットを用いて、ペトリ皿から薄いと濃厚卵白の大部分を削除してください。
- 静かに、ティッシュペーパーの切れ端で濃厚卵白を払拭センター（ 図1-B）から離れて移動することにより、胚の周りの濃厚卵白中のウィンドウを作成します。卵黄膜に付着するティッシュペーパーを防ぎます。
- ピンセットを使用して、慎重にヴィーテの濾紙担体を配置胚（ 図1-C）の前後軸に楕円開口平行の長軸と胚の周りLLINE膜、。
- フィルターペーパーキャリアに近く、すぐに全体のフィルターペーパーキャリア（ 図1-D）の周りにカット卵黄膜を介して爪はさみ1先端をつまんで。
- ピンセットを用いて、胚（ 図1-E）の前後軸に対して斜め平行な方向に離れて卵黄からフィルターペーパーキャリアを持ち上げます。
- 上胚の腹側を持っており、PC-生理食塩水でそれを沈めるために周りろ紙キャリアをオンにします。斜め方向の胚の前後軸に沿ったフィルターペーパーキャリアを浸し。
- すべての卵黄を取り除くにはまだ静かにプラスチック製トランスファーピペットからPC-生理食塩水でそれをフラッシュすることによって卵黄膜と胚盤葉を添付しました。で水没フィルターペーパーキャリアの全体を保ちますLL時間（ 図1-F）。
- 斜め方向に胚の前後軸に沿ってPC-生理食塩水からフィルターペーパーキャリアを外し、ティッシュペーパー上にフィルターペーパーキャリアの端を軽くたたくことにより、余分な液体を取り除きます。
- 上向き胚の腹側と、水平に濾紙を保持し、最初の上に別のフィルターペーパーキャリアを置き、ピンセットの第二の対を使用して。その開口部は、それによってろ紙の2層（ 図1-G）との間の胚を挟んで、正確に一致する必要があります。
- 直ちに胚の前後軸に沿って斜め方向に培地中に濾紙担体サンドイッチを水没。 2スチールリング（ 図1-H）との間のスペースにまたがる領域に配置します。
- 確認しながら、他の二つの上にさらに2つの鋼製リングを配置することにより、ろ紙サンドイッチを修正し、その電子を持つ開口mbryoは完全に覆われていない（ 図1-I）のまま。
- 中レベルをチェックし、上部スペーサはちょうど媒体中に沈められていることを確認してください。必要に応じて、培地の少量を追加または削除。
- 慎重に温度制御されたオイルバスの中央に、ペトリ皿に置き、油中皿に次の3つの大きいステンレス鋼リング（30 mmの外径、高さ4mmの1.5ミリメートルの壁の厚さ）を配置することにより皿を横方向に安定させます。 （ 図1-J）のスチールリングは皿の側面に触れていることを確認してください。
- 媒体は鉱油の連続的な層（ 図1-K）で覆われるようにゆっくりと、プラスチック製のトランスファーピペットで培地の上に光鉱油約6ミリリットルピペット。
- タイムラプス買収を設定します。
注：5重複サブ画像（タイル）の水平方向のパノラマのような胚のイメージングは、一般的なoverviで、詳細なイメージング（5X目標を）ことができます形態29から30のEW。 3と10分の間に撮像間隔は、形態学的変化31の詳細な追跡を可能にし、小のzスタック（30μmの距離で5〜7個の異なる面）の取得は、胚30の肥厚と旋回の多くを補償します。最も高いコントラストを有するZ-平面は（画像取得の詳細については、代表的な結果のセクションを参照してください）タイムラプスムービーに単一フレームをさらに処理32の前に選択することができます。
図1：水中フィルターペーパーサンドイッチを設定します。 （A）卵をペトリ皿中に割れています。 （B）の厚さと薄い卵白の大部分は、プラスチック製トランスファーピペット（図示せず）を有するペトリ皿から除去されます。その後、濃厚卵白中のウィンドウが作成されますそっとティッシュペーパーで濃厚卵白を拭き取ることによって胚のラウンド。 （C）濾紙担体は卵黄の上に胚盤葉の周りに配置されています。 （D）濾紙担体は卵黄の頂部から除去周囲の卵黄膜と、（E）から切り離されています。 （F）残りの卵黄は、慎重にPC-生理食塩浴で洗い流されます。 （G）胚は、第二の同一の濾紙担体とに挟まれています。 （H）濾紙サンドイッチを培地中に浸漬し、二つの金属ステンレス鋼リング（胚対向背又は腹側を上）に配置されています。 （I）二つのリングがトップからサンドイッチを安定させます。 （J）胚を含むペトリ皿を、温度制御されたオイルバスに転送されます。ステンレス製リングは、横方向にペトリ皿を安定させます。 （K）培地を鉱油の層で覆われています。（L）水没フィルターサンドイッチの概略図。 （M）浸漬濾紙サンドイッチに使用される濾紙担体の寸法。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Representative Results
図2：EC 文化 1 中 と水中フィルターペーパーサンドイッチ培養における 胚間の形態学的比較 。選択したタイムラプスフレームは、3時間間隔で胚を示しています。フレームは、完全な胚の形態の概要を与えるためにサイズ変更されます。胚は7体節期（HH9）15に年齢をマッチさせました。 0時間は、各実験の開始を示します。前部は、左に常にあります。画像は暗視野照明を用いて取得しました。 1,33ボトム寒天卵白上のEC文化1、培養腹側アップ中（A）胚。胚は、z方向に閉じ込められるように、高品質の画像を取得することができます。 （B及びC）浸漬濾紙サンドイッチで培養つ胚（B）までの腹側及び（C）背側まで。ろ紙サンドイッチ内の胚は、少なくとも27時間のための質的な差なしで開発しています。彼らは、機能的な血液循環と頭蓋と子宮頸たわみを開発し、正常に電源を入れます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
タイムラプス取得は、利用可能な顕微鏡システムに依存します。この研究では、長作動距離において、直立ズーム顕微鏡を使用しました。ズーム倍率が5倍に設定しました。接眼レンズの16X倍率との組み合わせで、これは1.3ミクロン/ピクセルの理論分解能（顕微鏡ソフトウェアに記載されているように）30と、80X総合倍率が得られました。視野を増大させるために、胚を5つのサブ画像（タイル）の水平方向のパノラマのように画像化しました。したがって、5重なり合うタイルから成るタイル領域は、29を定義しました。このタイル領域完全に水平延長（ - 0時間図2B）に濾紙担体の楕円形の開口部を覆うように配置しました。各タイルは、約2.7ミリの視野をカバーする2048のx 2048ピクセルの大きさを有し、タイルは、その結果、10％のオーバーラップを用いて取得した視野約12ミリメートル×2.7ミリメートルの合計パノラマ。電動XYステージは、別々のタイル29の取得の間に約1.75ミリメートル/秒の速度で目的に対して相対移動しました。ライブ画像は、前方前体節中胚葉、最も最近形成された体節（当社グループの研究の焦点）に焦点を当てました。 z方向の胚の肥厚やカールを補償するために、小規模のzスタック（30μmの距離で5〜7個の異なる平面）が毎回点30で取得しました。これらは、前体節中胚葉の前方先端の焦点面の周りに選択しました。タイムラプスACQの期間uisitionは50時間とし、3,4、または10分の撮影間隔31を選択しました。 10時間、新しい最適な焦点面の周りにzスタックを再定義する - タイムラプス買収の品質は、すべての5リフォーカスすることによって改善することができました。実験の最後に、全体の時系列は、手動で編集し、ベストフォーカスとz平面を含む画像のサブセットが作成され、別のフォルダ32に保存されました。画像のこれらのサブセットは、時間のステッチ最適焦点と画像の完全な時系列を作成することでした。この完全な時系列の各画像のタイルは、ステッチやシェーディング補正30せずに一緒に融合し、タイムラプスフレームは100％のサイズと95％圧縮32のJPEG-画像としてエクスポートされたされました。タイムラプスフレームは、プロのビデオ編集ソフトウェアに画像シーケンスとしてインポートされました。詳細な100％のズームを安定化し、全体的なコントラストは、私たちの好みに合わせて調整しました。最終的な時間経過は、エンコードしましたH.264コーデックとdおよびMPEG-4コンテナで輸出しました。作品は、15フレーム/秒（FPS）と1920×1,080ピクセルの解像度のフレームレートで表示されます。
図2は、EC文化1（ 図2A）での胚と水没ろ紙サンドイッチ培養2胚、一方が培養腹側まで（ 図2B）および他の1背側を上（ 図2C）との比較を示しています。すべての胚は、年齢をマッチさせた7体節期（HH9）15および4分（ 図2AおよびB）または10分（ 図2C）の時間分解能で画像化しました。 3時間間隔の選択されたフレームが示されています。 EC培養物（ 図2A）が原因で1,33底安定寒天、卵白に載っ胚に非常に安定した撮影を可能にしました。全体の胚はトン全体で1焦点面に残りました彼は全体の時間経過。これは、短い実験（数時間）と非常に初期胚のために有益であり得るが、それはおそらく長期的にはその成功の三次元発展を妨げるz方向の胚の強い閉じ込めが付属しています。初めに、閉じ込めは、その腹側を上に（0時間で、図2Aおよび2Bを比較）で水没ろ紙サンドイッチで培養した胚に比べ胚の頭のわずかな横方向の平坦化をもたらしました。その後、頭の回転が（ 図2A - 21時間）損なわれたと心拍が遅く。血液の循環がほぼ停止しました。 EC培養における胚の完全な時間の経過を補足ムービー1を参照してください。左下のパネルはフル解像度で心臓の開発を可視化しながら、この映画の中の上のパネルは、胚の完全な概要を示しています。体節へ前体節中胚葉のセグメンテーションがseすることができます右下の詳細にアン。
浸漬濾紙サンドイッチにおける胚は、一方のみそれらを囲む膜の自然な張力によってそれらの三次元膨張が制限されました。彼らは腹側（ 図2B）または背側を上（ 図2C）とのいずれかで培養することができました。いずれにしても、胚は連続体節形成を示し、彼らの頭を回しました。彼らは、頭蓋と子宮頸たわみと機能血液の循環を開発しました。頭の部分が徐々に胚を厚く、成長するにつれ、焦点の外に移動し、ターンを開始したように、中胚葉の分割部分にフォーカスがままろ紙サンドイッチの両方の胚は、セグメント化の中胚葉に焦点を当てて画像化しました（21時間〜27時間で図2Bおよび2Cを比較）。 補足ムービー2が描か胚の完全なタイムラプスムービーを示しています図2Bインチ撮像間隔は4分でした。この映画のトップパネルは、胚の完全な概要を示しています。胚の開発が原因で全体の肥厚および胚組織の旋回に連続してオーバー46時間を画像化したが、約30時間後に、セグメント化中胚葉にフォーカスが失われてしまいました。左下のパネルは、取得したタイムラプスフレームからフル解像度で心臓の早期開発を示しています。正中線の両側に対になった心臓原基の融合を介して、ほぼ直線状の管状構造は、後に拍動し、右に曲がり始める、形成されています。右下のパネルには、最近形成された体節とフル解像度での前体節中胚葉の前方先端を示しており、時間をかけて新しい体節の形成を追跡します。 補足ムービー3は、他の胚培養し、水没ろ紙サンドイッチに腹側を上に結像示しています。撮像間隔は4分でした。映画は目を覆いステージHH5-6から約への胚の電子開発は、HH14 15培養時間のオーバーおよそ27時間を上演します。ヘッドは、フォームを折ると後方に進行します。その両側性原基の心臓形は、鼓動を開始し、右に曲がります。最初の3〜4体節を同時に形成します。追加の体節は前体節中胚葉の前方先端から順に出芽しました。下のパネルは、高詳細にヘッド倍と早期の心臓形成の観察を可能にする、フル解像度での胚の頭部領域を示しています。胚の透明性、神経管の閉鎖は、将来の頭部領域で観察することができます。下のパネルでフル撮影時間にわたるフル解像度で同じ胚における補足ムービー4ディスプレイの体節形成。 補足ムービー5は、胚培養背側を上（ 図2C）の完全な時間の経過を示しています。撮像間隔は10分でした。 UPP一方、えーパネルは約ステージHH16-17に7体節期（HH9）からの胚の発育を示し、下のパネルは、フル解像度でその段階で早期の脳内の形態学的変化を表示するようにトリミングされています。神経管の局所の腫れは後の段階13で、胚の脳の5小領域に分割する前脳の地域化、中脳、および後脳、につながる、観察することができます。また、眼胞の成長は明らかに見ることができます。文化の中で約30時間後、胚は死にかけています。
顕微操作、いくつかのポリスチレンビーズ（直径〜40ミクロン）で水没ろ紙サンドイッチの互換性を示すためには、水没ろ紙サンドイッチ培養におけるニワトリ胚の前体節中胚葉の近傍に、または移植しました。マイクロビーズは、記憶バッファとimplanを除去するためにPBSで洗浄しました。テッドは前軽鉱物油の層を有する培地をカバーする（プロトコルセクションの2.18のステップに比較して）。ガラスパスツールピペットは、顕微鏡の接眼レンズを通じて観察下で、胚の表面にビーズを転送するために使用されました。 5つの穴を穏やかに鍼でそれをこすることによって内胚葉で作成されました。火炎中でガラスパスツールピペットを伸ばし、曲げによって作成されたカスタムメイドのJ字型のツールは、ビーズを操作し、彼らは不動になるまで穴に慎重にそれらをプッシュするために使用されました。三つの穴が1ビーズそれぞれを充填した（ 図3A - 0時間および3B *）および2つのビードそれぞれ（ 図3A - 0時間）と二つの穴。 図3Aが示すように 、選択されたタイムラプスフレームで、ビーズの顕微注入後のニワトリ胚の開発。三ビーズが正常所望の位置で組織に組み込まれ、それらの動きを画像化した上で高詳細（ 図3B）での実験の過程。胚の開発は、操作またはビーズの存在によって損なわれていないようでした。フルタイムラプスムービーの補足ムービー6を参照してください。撮像間隔は4分でした。
図3： マイクロビーズ移植後のタイムラプスイメージング。マイクロビーズの注入で水没ろ紙サンドイッチの互換性を示す証明の原理実験。胚の頭が左にあるが、それは、この実験中に画像化されていませんでした。画像は暗視野照明を用いて取得しました。 （A）選択したタイムラプス7マイクロビーズの移植後3時間の間隔で操作胚を示すフレーム（〜40μmの直径）。胚は細長く、継続的に追加somitを形成しますエス。スリービーズは、適切に取り付けられており、文化の18時間にわたる組織の流れと内側に移動されているように見えます。他の4つのビーズは、文化の6と9時間の間、その穴からポップされ、後方に漂流しました。実験開始（0時間、B *）とのインキュベーションの12時間後（B **）で前体節中胚葉に移植（B）3つの単一のビーズの詳細ビュー（B1〜B3の）。ちょうど形成体節の数は、（BのB *におけるS9とS18 **）が表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足ムービー1：EC- 文化腹側アップ。 7体節期以降寒天卵白だぼっ上（HH9）15から1、培養腹側までのEC培養中の胚、メートル1,33。撮像間隔は4分でした。相対時間は、左上隅に表示されます。胚は、z方向に閉じ込められたように、高品質の画像を取得することができます。 21時間後、ハートビートと血流がほとんど逮捕され、胚が崩壊し始めていました。下のパネルは、フル解像度（100％ズーム）で前体節中胚葉（右パネル）の心臓発生（左パネル）およびセグメンテーションを視覚化しながら、上のパネルは、胚のサイズ変更された概要を示します。 （右クリックしてダウンロード）。
補足ムービー2： 水中フィルターペーパーサンドイッチ腹側アップ。以降7体節期から水没紙サンドイッチ（HH9）15、腹側sidの培養胚eは上向きに。撮像間隔は4分でした。相対時間は、24時間後に再起動し、時間と分で左上隅に表示されます。上のパネルは連続して、46時間以上の胚の発育のサイズ変更された概要を示します。左下のパネルには、フル解像度（100％ズーム）での画像取得の最初の10時間の間、早期の心臓の開発を可視化します。右下のパネルは、フォーカスが原因で全体の肥厚および胚組織の旋回に失われるまで、フル解像度（100％ズーム）で、開発の約30時間かけて中胚葉をセグメント描いています。 （右クリックしてダウンロード）。
補足ムービー3： ヘッドフォールド形成。彼からの浸水ろ紙サンドイッチにおける胚培養腹側を上に広告・プロセス/ヘッド倍段階（HH5-6）15約22体節期（HH14）に培養時間の15以上のおよそ27時間。撮像間隔は4分でした。相対時間は、24時間後に再起動し、時間と分で左上隅に表示されます。上のパネルは、胚の発育のサイズ変更された概要を示します。下のパネルは、フル解像度（100％ズーム）で胚の頭部領域を示しています。ヘッド倍と早期の心臓や神経管の閉鎖の形成を観察することができます。 （右クリックしてダウンロード）。
補足ムービー4： 体節形成。ヘッド・プロセス/ヘッド倍段階から水没ろ紙サンドイッチ（HH5-6）15における胚培養腹側アップ培養時間の約27時間かけて約22体節期（HH14）15。撮像間隔は4分でした。相対時間は、24時間後に再起動し、時間と分で左上隅に表示されます。上のパネルは、胚の発育のサイズ変更された概要を示します。下のパネルは、フル解像度（100％ズーム）に分割近軸中胚葉を示しています。 （右クリックしてダウンロード）。
補足ムービー5： 水中フィルターペーパーサンドイッチ背サイドアップ。約HH16-17ステージ15に7体節期（HH9）15から水没ろ紙サンドイッチにおける胚培養背側アップ。撮像間隔は10分でした。相対時間が表示されます。時間と分で左上隅に、24時間後に再起動します。上のパネルは、胚の発育のサイズ変更された概要を示します。下のパネルは、フル解像度（100％ズーム）の初期の脳の形態変化を示しています。胚は、培養中の約30時間後に死亡しました。 （右クリックしてダウンロード）。
補足ムービー6： マイクロビーズ移植。 9体節期（HH9-10）15から出発し、約19時間、のための水没ろ紙サンドイッチにおける胚培養腹側アップ。撮像間隔は4分でした。相対時間は、時間と分で左上隅に表示されます。上のパネルは、PRに移植7マイクロビーズとテール領域のサイズ変更された概要を示しますesomitic中胚葉。下のパネルは、フル解像度（100％ズーム）で注入されたマイクロビーズを有する領域を示しています。 （右クリックしてダウンロード）。
Discussion
十分に確立されたEC文化1の新しい亜種としては、水没ろ紙サンドイッチは、周りの温度と湿度が管理されたインキュベータを行うことによってニワトリ初期胚の元、卵の長期明と暗視野タイムラプスムービーの取得を容易に不要顕微鏡。むしろ半固体寒天卵白底に培養されているよりも、胚は完全にPC-生理食塩水と薄い卵白からなる単純な培養液中に沈め保持されます。蒸発熱損失は、培養培地の上に浮遊ミネラルオイルの層によって最小化されます。胚は、品質に見える違いなしに、簡単に背や腹側を上にいずれかを培養することができます。ここに示されているように、水没ろ紙サンドイッチ中の胚はモルフォゲン浸したビーズのアプリケーションのように、顕微介入にアクセスできます。将来のアプリケーションは、ミリアンペアにライブ蛍光イメージング、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション、および遺伝子サイレンシングを含みますnipulateとは腹側（ 例えば、初期の心と体節形成）と背側（ 例えば、後期原腸形成、神経管閉鎖、及び早期の脳）開発中に形態形成のイベントの広い範囲を勉強しています。濾紙サンドイッチを含むペトリ皿を鉱油層の下の培地の交換を可能にする、灌流チャンバーで置換される場合、時間依存性の薬物治療が可能です。水没ろ紙サンドイッチは、レーザベース（光シート顕微鏡を含む）イメージングと液浸対物レンズとの組み合わせで、完全なイメージングの可能性を開発します。
水没ろ紙サンドイッチの準備といくつかの困難が、以下の段落で対処されることになります。それはろ紙サンドイッチに卵黄から胚を転送するために、トレーニングの唯一の適度な量を必要とするが、いくつかのステップは、依然として大幅に培養中の胚の品質に影響を与えることができます。濾紙担体である前卵黄の上に置き、胚の周りの卵黄膜は、任意の濃厚卵白から解放する必要があります。その場合にのみ、ろ紙と卵黄膜との間の接続は、PC-生理食塩水での洗浄に耐えるのに十分強力になります。できるだけ液体/空気界面を横切るべき胚を運ぶ濾紙、膜の張力を最小化します。洗浄のためのPC-生理食塩水に持ち込まれると、全体のろ紙キャリアは完全にすべての回で沈め滞在する必要があります。卵黄膜がろ紙から解放開始されますように、60秒 - PC - 生理食塩水浴中の時間は約30に制限しなければなりません。卵黄残党が後胚のビューを不明瞭になりますように、まだ、胚の洗浄は、非常に徹底的に実行する必要があります。洗濯時には、常に半径方向に離れてから胚に直接転送ピペットからのストリームを指していませんが、決して。 PC-生理食塩水から胚を除去した後、最小化するために水平にろ紙を保持するようにしてください胚性膜上の緊張。そして、第2濾紙担体と胚を安定化させます。第濾紙キャリアが配置されると、互いに対して濾紙キャリアをシフトし、胚の膜を引き裂く可能性のある横方向の張力を作成しません。濾紙サンドイッチを培地になると、それはまた、膜の張力を最小にするために、一度だけ、空気/液体界面を横切る必要があります。上部から濾紙サンドイッチを安定化するために使用されるステンレス鋼リングの第二の対は、非常にゆっくりと胚膜の圧縮を最小限にするために任意の圧力なしで配置されるべきです。胚の暗域の小さな破裂は通常、培養の最初の時間の間に治癒するが、油層を培地の上にピペットで添加される前に、損傷を受けた胚は、常に新しいサンプルに置き換えてくださいすることができます。
画像への全体胚または高解像度タイムラプスムービーのための複数のサンプル、マイクroscopeは、顕微鏡ソフトウェアによって制御、電動式XYステージを装備する必要があります。これは、画像品質を低下させる培地と油中の胚および乱流への損傷を回避するために最小限の速度でXYステージの動きを持っている非常に重要です。ここで提示タイムラプス動画の取得のために、電動XYステージは、約1.75ミリメートル/秒の速度で移動しました。将来的には、イメージングは、第一希望の位置にステージを移動し、振動や乱流が消えるようにする短い休止期間後の画像を取得することによって改善することができます。
液浸対物レンズのない正立顕微鏡を使用している場合の制限として、潜在的なユーザーは、この培養方法のために必要な比較的長い作動距離（約1cm）に注意する必要があります。胚の上に媒体の層から、ミネラルオイルのこの作動距離をもたらします。 6センチメートルシャーレでは、油層はthicknesを持っています約1秒 - 2.4 mmであり、胚培養培地中の深い約4mmに沈められます。目的の直径に応じて、6センチメートルペトリ皿の上縁も、胚へのアクセスを制限することができます。これは、より大きな皿を使用することによって回避することができました。
頂部から作動距離はわずかに液体層の厚さを最小化することによって減少させることができます。また、下から作動距離がさらに下ペトリ皿の底に胚をもたらし、加熱ビーカーのガラス窓の厚さを減少させることによって最小化することができます。プロトコルは直立長い作動距離のズーム顕微鏡で動作するように最適化されたが、それは同様に倒立顕微鏡に取り付けることができました。予備実験は、限られた拡散がPROBように見えるしないことを示唆しているものの、今後のユーザーは、培養液中にあまり深く胚を浸漬すると、O 2型拡散問題につながる可能性があるということを覚えておいてくださいLEMは、限り胚を培養培地とに挟まれた濾紙の十分に大きな貯水池に囲まれるようにペトリ皿の底に押されていません。
別の制限は、温度制御です。 40℃に加熱したビーカーのためのコントローラの温度を調整することで、媒体の温度は、媒体は、ミネラルオイルで被覆されている胚の周りに37.5℃に平衡化。これは、一部のエネルギーは、加熱要素と温度センサが配置されているビーカーの底部、及び胚の位置との間で失われていることを示しています。温度制御は、センサを再配置し、加熱要素を再分配することによって最適化することができます。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者はZonMW-VICIグラント918.11.635（オランダ）からの財政支援を認めます。著者は彼らの実用的な提案をし、顕微鏡上で有益な助言のためのセットアップコンポーネントとカールツァイスオランダのヤルノVoortmanを製造するためのVrijeはUniversiteitアムステルダムの工具店に感謝したいと思います。マリョレインBlaauboerは批判的に原稿のいくつかの草稿にコメントで大きなサポートでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Millipore | Z00QSV0WW | |
| Duran laboratory bottles, with caps, 1 L | Sigma-Aldrich/Duran | Z305200-10EA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution A | |||
| NaCl | Merck Millipore | 1064041000 | |
| KCl | Merck Millipore | 1049361000 | |
| CaCl2·H2O | Merck Millipore | 1023821000 | |
| MgCl2·6H2O | Merck/Sigma-Aldrich | 13152-1KG-D | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution B | |||
| Na2HPO4·2H2O | Merck | 1065801000 | |
| NaH2PO4·2H2O | Merck | 1063420250 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 595 | Sigma-Aldrich | 10311611 | |
| Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130 W, wavelength 10.6 µm | Micro Lasersystems | ||
| Tork Extra Soft Facial Tissues | Tork | 140280 | |
| Latex gloves | Sigma-Aldrich | Z645613 | |
| EMDAMED | EMDA 300.131 | ||
| Transfer pipettes | Sigma-Aldrich | Z350613 | |
| VWR | WITG5.480.003 | ||
| Accu-jet pro Pipette Controller | BrandTech Scientific | 26332 | |
| Serological plastic pipettes, 25 ml | Sigma-Aldrich | CLS4251 | |
| Plastic document sleeves | |||
| Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40 | Fiem | ||
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Drost BV (Loosdrecht, NL) | ||
| 10 cm Tissue culture dishes | Sigma-Aldrich | P5731 | |
| Greiner Bio-one | 664160 | ||
| 6 cm Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| 50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes | Sigma-Aldrich | T2318 | |
| greiner bio-one | 227261 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel rings, custom-made | |||
| Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness | |||
| Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring | |||
| Nail scissors | |||
| Forceps, Dumont #5, Inox | Fine Science Tools , F.S.T. | 11251-20 | |
| Fine, really sharp scissors for cutting filter paper | VWR | 21-102 | |
| M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil | Sigma-Aldrich | CAS Number 8042-47-5 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar bottoms for EC culture | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 SIGMA | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microbead implantation | |||
| Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) | Polysciences, Inc. | 16905-1 | |
| Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30 mm | SEIRIN | type J, No.02, 0.12x30mm | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Temperature controlled beaker | |||
| RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M | Omega | RTD-850M | |
| Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M | Omega | HSRTD-3-100-A-1M | |
| Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 | Omega | EXTT-3CU-26S-50 | |
| 3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M | Omega | MTP-U-M | |
| Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P | Omega | KHLV-103/(10)-P | |
| Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC | Omega | CNi16D24-C4EIT-DC | |
| Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope setup | |||
| Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN | Carl Zeiss AG | 495010-0009-000 | |
| Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56 mm | Carl Zeiss AG | 435281-9100-000 | |
| Manual Rotary Control MARC | Carl Zeiss AG | 435604-0000-000 | |
| Transillumination top 450 mot | Carl Zeiss AG | 435500-9000-000 | |
| Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9020-000 | |
| Insert plate S, glass 237x157x3 mm (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9053-000 | |
| Controller EMS 3 | Carl Zeiss AG | 435610-9010-000 | |
| System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss AG | 435611-9010-000 | |
| Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
| Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual | Carl Zeiss AG | 490004-0025-000 | |
| Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US | Carl Zeiss AG | 410373-0200-000 | |
| LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" | Carl Zeiss AG | 410350-2403-000 | not available anymore |
| ZEN pro 2012 Hardware License key | Carl Zeiss AG | 410135-1002-120 | not available anymore |
| ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410136-1045-110 | |
| ZEN module Z Stack | Carl Zeiss AG | 410136-0030-110 | |
| ZEN Module Tiles/ Positions | Carl Zeiss AG | 410136-1025-110 | |
| ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss AG | 410136-1031-110 | |
| ZEN Module Experiment Designer | Carl Zeiss AG | 410136-1022-110 | |
| ZEN Desk 2012 Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410135-1004-120 | not available anymore |
References
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