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Developmental Biology

Un filtre Sandwich de papier Submergé Long terme Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54636
Automatic Translation
*1, *1, 2
1Department of Orthopaedic Surgery, VU University Medical Center Amsterdam, MOVE Research Institute Amsterdam, 2Department of Anatomy, Embryology & Physiology, Academic Medical Center Amsterdam
* These authors contributed equally

Abstract

En raison de sa disponibilité, à faible coût, la géométrie plane, et la transparence, l'ex ovo embryon de poulet est devenu un modèle majeur des animaux vertébrés pour l'étude des événements morphogénétiques, tels que gastrulation 2, neurulation 3-5, somitogenèse 6, coeur de pliage 7, 8, et le cerveau formation 9-13, au cours de l' embryogenèse précoce. La clé de la compréhension des processus morphogénétiques est de les suivre dynamiquement par imagerie time-lapse. L'acquisition de films time-lapse de poussin embryogenèse ex ovo a été limitée soit à court fenêtres de temps ou à la nécessité d'un incubateur pour contrôler la température et l' humidité autour de l'embryon 14. Ici, nous présentons une nouvelle technique pour la culture embryons de poulet ex ovo pour imagerie à haute résolution time-lapse en utilisant la microscopie lumière transmise. Le sandwich de papier filtre immergé est une variante du filtre support papier techn bien établieique (EC-culture) 1 et permet la mise en culture des embryons de poulet sans la nécessité d'une chambre climatique. L'embryon est prise en sandwich entre deux supports en papier filtre identique et est maintenu totalement immergé dans un milieu simple, à température contrôlée recouverte par une couche d'huile minérale légère. A partir de la scène primitive de série (stade Hamburger-Hamilton 5, HH5) 15 jusqu'à au moins le stade 28 somites (HH16) 15, les embryons peuvent être cultivées avec soit leur ventrale ou dorsale vers le haut. Cela permet à l'acquisition de films time-lapse couvrant environ 30 h du développement embryonnaire. Représentant des cadres et des films time-lapse sont présentés. Embryons sont comparés morphologiquement à un embryon cultivé dans les CE-culture standard.

Le sandwich de papier filtre immergé fournit un environnement stable à l'étude dorsale précoce et les processus morphogénétiques ventrales. Il permet également d'imagerie et micromanipulations de fluorescence en direct, tels que la microchirurgie, perle implantation, microinjection, silençage génique, et l'électroporation, et a un fort potentiel pour être combinés avec des objectifs d'immersion pour l'imagerie à base de laser (y compris la lumière de la fiche microscopie).

Introduction

Embryogenèse a fasciné l'homme depuis le début de l'histoire. Comment la structure et la morphologie de l'embryon se développent de manière spatiale et temporelle bien définie? L'embryon de poulet est devenu l'un des modèles animaux vertébrés classiques pour embryogenèse pour plusieurs raisons: Il est facilement disponible, peu coûteux, transparent à ses débuts, et accessible pour des manipulations expérimentales, comme elle se développe en dehors de la mère. De plus, il a une géométrie presque plat lors d' événements morphogénétiques début, comme le cœur et la formation du cerveau, gastrulation, neurulation et somitogenèse 15.

processus morphogénétiques peuvent être comprises mieux si elles sont étudiées de manière dynamique, par exemple par l'acquisition d'images en accéléré. L'embryon de poulet peut être visualisé in ovo 16 mais avec une faible accessibilité pour les manipulations expérimentales et la visibilité limitée pour l' imagerie par microscopie optique de transmission. Par conséquent, several techniques ont été proposées pour la culture d' embryons de poulet ex ovo, que ce soit dans des systèmes de culture de 13,17 jaune d' oeuf entier - 19 ou sous forme de cultures d'explants 1,20 - 23. Dans les systèmes de culture de jaune d'oeuf entier, l'embryon reste au-dessus du jaune d'oeuf intact, et la totalité du contenu de l'œuf est transféré dans un autre récipient pour l'incubation. Ce conteneur peut être une coquille d'oeuf de substitution 17, une boîte de Pétri 19, ou un hamac en plastique étirable wrap 13,18. Embryons dans les cultures de jaune entières peuvent idéalement être cultivées jusqu'à l'éclosion et sont accessibles à micromanipulations. Ces techniques sont particulièrement utiles pour étudier le développement d'embryons après le début de la circulation sanguine (ce qui augmente le contraste), tandis que les jeunes embryons restent difficiles à visualiser. Ces embryons précoces peuvent être imagées mieux si elles sont excisées du jaune et cultivés comme explants in vitro. Les explants sont facilement accessibles pour l'expériencemanipulations al et nécessitent moins d'espace pour la culture. Pendant de nombreuses années, une technique mise au point par Denis Nouvelle en 1955 et ses variations ont été les normes d' or des explants méthodes de culture pour les embryons de poulet, ce qui rend l'embryon accessible pour la microscopie time-lapse et les interventions de microchirurgie 20,21. Malgré son grand succès, la technique de la Nouvelle est relativement exigeante et prend du temps. Le blastoderm détache souvent lorsque la membrane vitelline, portant le blastoderme, est tendue autour d' un anneau de verre pour obtenir la bonne tension 1. En outre, l'embryon ne peut être mis en culture avec sa face ventrale vers le haut. La culture CE (Chick précoce), une technique plus récente développée par Chapman et Collignon 1, évite l'étirage de la membrane vitelline à l'aide d' un filtre papier support avec une ouverture centrale. Le papier filtre attache à la membrane vitelline, maintenant ainsi sa tension naturelle, et entoure l'embryon comme un cadre photo 1.Embryons sont ensuite cultivées sur un fond agar-albumen, généralement avec leur face ventrale. La culture dorsale vers le haut ne semble possible que pour les embryons à HH8 15 ans et plus. De nombreux groupes ont adapté le filtre papier support à leurs besoins, par exemple en remplaçant le fond d' agar-albumen avec un support en fibres de suture chirurgicale 24 ou un collagène enduit membrane 25. Souvent, les embryons cultivés avec la technique de nouvelles ou avec la culture CE sont exposés, avec leur dorsale ou surface ventrale à l' air pour faciliter la diffusion de l' oxygène 1,20. Ces cultures explants doivent être conservés dans une atmosphère humidifiée pour éviter l'évaporation du milieu et pour empêcher l'embryon de se dessécher. Ceci est réalisé en incubant le plat avec la culture d'expiant dans un plat plus grand de Pétri contenant du papier de soie humide 1. L'acquisition d'images en accéléré de ces embryons nécessite soit l'utilisation d'un incubateur à température contrôlée autour de l'ensemble microscope ou un tempéramentature contrôlé récipient avec un couvercle chauffé pour empêcher la condensation dans le trajet de la lumière 14. Cependant, les embryons de poulet peuvent également développer ex ovo complètement immergé dans un milieu de culture en tant que cultures de papier filtre 25, pris en sandwich entre une couche d'huile et de l' albumine de minéraux lourds dans adaptions de la technique de New 2,21, ou comme explants de blastoderme pliées dans le "Cornish Pasty Culture "23,26, sans contact direct avec l'air.

Le sandwich de papier filtre immergé est une nouvelle variante de la technique du papier filtre de support. En combinant la connaissance antérieure sur la culture des embryons de poulet ex ovo, il fait l'incubateur à température contrôlée et le couvercle chauffant dispensable. L'embryon est pris en sandwich entre deux supports de papier identique (découpé au laser) filtre 24 et cultivé entièrement immergé dans un milieu de culture simple (Pannett-Compton saline 27,28 et albumen minces dans un rapport de 3: 2) dans une température contrôlée contiennenter. Une couche de lumière de l' huile minérale flottant au - dessus du milieu empêche l' évaporation 2,21 et minimise la perte de chaleur dans l'environnement. Le fond du récipient a une fenêtre de verre, et l'ensemble du programme d'installation est effectuée sur une longue distance de travail zoom microscope droit. Cette configuration permet l'acquisition de haute résolution clair et darkfield time-lapse films d'environ 30 h du développement embryonnaire, allant du stade de la ligne primitive précoce au stade 28 somites (équivalent à Hamburger Hamilton stades 5 à 16, HH5-16 ) 15. Les embryons peuvent être cultivées aussi bien avec leur ventrale ou dorsale vers le haut. Par conséquent, les embryons sont accessibles à l' observation et la manipulation de ventral (par exemple, cardiaque précoce 7,8 et somitogenèse 6) et dorsale (par exemple, la fin de la gastrulation 2, le tube neural fermeture 3-5, et au début de cerveau 9-13) développement. Le filtre immergé papier sandwich à provides un environnement simple et stable pour la microchirurgie, perle implantation, microinjection, silençage génique, et les études d'électroporation. Son potentiel d'imagerie peut être poussé beaucoup plus loin en utilisant l'imagerie à base de laser (y compris la microscopie optique-feuille) et les objectifs d'immersion.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été menées en conformité avec les expériences néerlandaises sur Animals Act.

REMARQUE: Le filtre méthode papier sandwich immergée est modifiée à partir de 1.

1. Filtre Submergé Papier Sandwich Préparation

  1. Pannett-Compton (PC) -saline 27,28
    1. Préparer des solutions mères (1 L de ultrapure H 2 O, 121 g de NaCl, 15,5 g de KCl, 10,42 g de CaCl 2 · H 2 O et 12,7 g de MgCl 2 .6H 2 O) et B (1 L d' ultrapure H 2 O, 2,365 g de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,188 g de NaH 2 PO 4 · 2H 2 O) à nettoyer les bouteilles de 1 L. Conservez-les à 4 ° C.
    2. Préparer 1 L de PC-saline en mélangeant 900 ml de ultrapure H 2 O avec 40 ml de solution mère A et 60 ml de solution mère B (dans cet ordre pour éviter la précipitation). Préparer PC-saline fraîchement from solutions mères A et B chaque semaine.
      NOTE: Les solutions mères peuvent être conservées à 4 ° C pendant plusieurs mois. Autoclavage et / ou en ajoutant des antibiotiques ou des antimycosiques ne sont pas nécessaires.
  2. L'incubation des œufs de poule fécondés
    1. Dans un incubateur humidifié, jeter les oeufs de leur côté et les incuber à 37,5 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent l'âge désiré.
      NOTE: oeufs Stocker pas plus de deux semaines (de préférence à 12-15 ° C) avant l'expérience, que le taux d'éclosion diminuera considérablement
  3. Des supports de papier filtre (adapté de 1)
    1. Si possible, utilisez une machine de découpe laser pour découper des supports en papier filtre en forme de sablier à partir de papier de filtration d'épaisseur (28 mm x 22 mm). Taper la largeur au milieu de 22 mm à 10,4 mm. Découper une ouverture elliptique centrale (10,6 mm x 5,5 mm), avec l'axe plus long de l'ellipse orientée parallèlement au grand côté du support de papier filtre (Figure 1-M).
      1. Le cas échéant, de préparer un gabarit en carton avec les dimensions correctes et à transférer son contour et celui de l'ouverture centrale du papier de filtration d'épaisseur à l'aide d'un crayon. Découpez le support de papier filtre à l'aide de ciseaux fins.
    2. Coupez deux supports de papier filtre identiques pour chaque embryon à explantées. Préparer des supports de papier filtre supplémentaires comme la sauvegarde en cas d'un embryon se perd lors de l'explantation.
  4. température contrôlée du bain d'huile (le jour de l'expérience)
    1. Placer le bécher à température contrôlée dans le centre de la xy-platine motorisée du zoom microscope droit et connecter le bécher à son contrôleur de température.
    2. Mettez quatre grands anneaux en acier inoxydable (de diamètre extérieur de 30 mm, 4 mm de hauteur, 1,5 épaisseur de paroi mm) dans un plat de 6 cm de Pétri pour agir en tant que poids et placez le plat dans le milieu du bécher à température contrôlée.
      NOTE: Cette boîte de Pétri sert juste comme un espace réservé pour ajuster le leve d'huilel.
    3. Remplir le récipient à température contrôlée avec 130 ml d'huile minérale légère. Ajustez le niveau d'huile si nécessaire pour qu'il se termine environ 3 mm en dessous du bord supérieur du plat 6 cm de Pétri.
    4. Retirez le 6 cm boîte de Pétri du bêcher à température contrôlée et régler la température à 40 ° C.

2. Filtre Submergé Paper Sandwich production

  1. Le milieu de culture (le jour de l'expérience)
    1. Verser 30 ml de PC-solution saline (telle que préparée dans les étapes 1.1.1 à 1.1.2) dans un tube centrifuge de 50 ml. Préparer une tube de centrifugation de 50 ml remplie de 30 ml d'une solution saline pour PC tous les deux embryons à explantées.
    2. casser délicatement un œuf non-incubée dans un plat de 10 cm de Pétri.
    3. Récolter albumen minces en déplaçant une pipette de transfert en plastique le long des parois de la boîte de Pétri et sucer dans l'albumen minces. Recueillir 30 ml d'albumine mince dans un tube de centrifugeuse de 50 ml pour chaque groupe de deux embryons à explantées. Assurez-vous d'obtenir seulement le thin albumen.
      NOTE: Habituellement 3 - 4 oeufs permettent la récolte d'environ 30 ml d'albumen minces.
    4. Verser 20 ml d'albumen minces dans tous les PC-remplis de solution saline 50 ml tube de centrifugeuse (tel que préparé à l'étape 2.1.1).
    5. Mélanger le PC-saline avec l'albumen minces en retournant doucement les tubes à plusieurs reprises. Laisser reposer pendant quelques minutes et vérifier si le mélange, appelé milieu de culture à partir d'ici, est clair. Si le milieu de culture est pas clair, préparer fraîche PC-saline de la solution de stock et la récolte albumen minces frais.
  2. Placez deux petits anneaux en acier inoxydable (diamètre extérieur de 20 mm, 4 mm en hauteur, épaisseur de paroi de 1,5 mm, 6,5 écart mm dans le ring) aussi éloignés que possible dans un 6 cm en plastique boîte de Petri frais et le remplir avec 22 ml de la culture moyen (tel que préparé dans les étapes 1.4.1 à 1.4.4) à l' aide d' une pipette en matière plastique de 25 ml (figure 1-H). Faire en sorte que les débris accumulés sur le dessus du milieu reste dans le tube de centrifugation.
  3. Enlevez les débris or bulles dans le milieu à l'aide d'une pipette de transfert en plastique.
  4. Remplir une boîte de Petri de 10 cm avec 75 ml de sérum physiologique PC (à utiliser à l'étape 2.15).
  5. Retirer un œuf de l'incubateur et laisser reposer sur le banc de son côté pendant 1 min pour laisser l'embryon venir au sommet du jaune.
  6. Casser délicatement l'oeuf dans une boîte de Pétri (Figure 1-A). Faire tremper le bord d'un morceau de papier de soie très bien dans l'albumen épais et centrer le blastoderme en tirant, si nécessaire.
  7. Retirer la plupart des albumen minces et épaisses de la boîte de Pétri à l'aide d'une pipette de transfert en plastique (avec la pointe coupée pour faciliter l'absorption de l'albumen épais).
  8. Créer une fenêtre dans l'albumen épais autour de l'embryon en essuyant doucement l'albumen épais avec un morceau de papier de soie, se déplaçant du centre (Figure 1-B). Empêcher le papier de soie de se fixer sur la membrane vitelline.
  9. En utilisant des pinces, placer soigneusement un support de papier filtre sur le vitelline membrane autour de l'embryon, avec l'axe plus long de l'ouverture elliptique parallèlement à l'axe antéro-postérieur de l'embryon (Figure 1-C).
  10. Pincez une pointe des ciseaux à ongles à travers la membrane vitelline à proximité du support de papier filtre et rapidement couper autour ensemble du support de papier filtre (Figure 1-D).
  11. En utilisant des pinces, soulever le support de papier filtre à une distance à partir du jaune d' oeuf dans une direction oblique parallèle à l'axe antéro-postérieur de l'embryon (Figure 1-E).
  12. Tournez le filtre papier support autour d'avoir la face ventrale de l'embryon sur le dessus et le plonger dans le PC-saline. Immerger le support de papier filtre le long de l'axe antéro-postérieur de l'embryon dans une direction oblique.
  13. Débarrassez-vous de tout le jaune encore attaché la membrane vitelline et blastoderme en rinçant doucement avec PC-saline d'une pipette de transfert en plastique. Conserver l'intégralité du support de papier filtre immergé à unefois ll (Figure 1-F).
  14. Retirer le support de papier filtre à partir du PC saline selon l'axe antéro-postérieur de l'embryon dans une direction oblique et se débarrasser de l'excès de liquide en tamponnant le bord du papier filtre sur un support papier de soie.
  15. Maintenir le papier filtre à l'horizontale, avec la face ventrale de l'embryon vers le haut et placer un autre support de papier filtre au-dessus de la première, en utilisant une deuxième paire de pinces à épiler. Leurs ouvertures doivent correspondre exactement, prenant ainsi en sandwich l'embryon entre les deux couches de papier filtre (figure 1-G).
  16. immerger immédiatement le papier filtre support en sandwich dans le milieu de culture dans une direction oblique le long de l'axe postéro-antérieure de l'embryon. Placer dans la zone couvrant l'espace entre les deux bagues en acier (figure 1-H).
  17. Fixer le sandwich de papier filtre en plaçant deux anneaux en acier au-dessus des deux autres, en veillant à ce que l'ouverture de l'embryo reste complètement découvert (Figure 1-I).
  18. Vérifiez le niveau moyen et faire en sorte que l'entretoise supérieure est tout simplement immergé dans le milieu. Si nécessaire, ajouter ou supprimer de petites quantités de milieu.
  19. Placez délicatement la boîte de Pétri dans le centre du bain d'huile à température contrôlée et à stabiliser le plat latéralement en plaçant trois grands anneaux en acier inoxydable (diamètre 30 mm extérieur, 4 mm de hauteur, 1,5 épaisseur de paroi mm) à côté de l'antenne dans l'huile . Assurez - vous que les anneaux en acier en contact avec les côtés de la cuvette (figure 1-J).
  20. Pipeter lentement environ 6 ml d'huile minérale légère au - dessus du milieu avec une pipette de transfert en plastique, de sorte que le support est recouvert d'une couche continue d'huile minérale (figure 1-K).
  21. Mettre en place l'acquisition time-lapse.
    NOTE: L'imagerie des embryons comme des panoramas horizontaux de cinq sous-images qui se chevauchent (tuiles) permet l'imagerie détaillée (objectif 5X), avec un overvi généralew de la morphologie 29-30. Intervalles d'imagerie entre 3 et 10 min permettent le suivi détaillé des changements morphologiques 31, et l'acquisition de petites z-piles (cinq à sept avions différents avec une distance de 30 um) compense une grande partie de l'épaississement et la rotation de l'embryon 30 . Z-plans avec le contraste le plus élevé peuvent être sélectionnés avant le traitement ultérieur 32 d'images uniques en films time-lapse (voir la section Résultats représentant pour des informations détaillées sur l' acquisition de l' image).

Figure 1
Figure 1: Configuration du sandwich Filtre en papier Submergé. (A) Un œuf est fissuré dans une boîte de Pétri. (B) La plupart des albumen épaisses et minces est retiré de la boîte de Pétri avec une pipette de transfert en matière plastique (non représenté). Ensuite, une fenêtre dans l'albumen d'épaisseur est créé unautour de l'embryon en essuyant doucement l'albumen épais avec un papier de soie. Papier (C) un filtre transporteur est placé autour du blastoderme au - dessus du jaune d' oeuf. (D) Le filtre de papier support est découpé en vrac à partir de la membrane vitelline environnante et (E) sont retirés de la partie supérieure du jaune d' oeuf. (F) Le jaune restante a été soigneusement lavé dans un bain de PC-solution saline. (G) L'embryon est pris en sandwich avec un second support identique papier filtre. (H) Le filtre en papier sandwich est immergé dans le milieu et positionné sur des bagues en acier inoxydable à deux métalliques (face dorsale embryonnaire ou face ventrale). (I) deux anneaux stabilisent le sandwich à partir du haut. (J) La boîte de Pétri contenant l'embryon est transféré dans le bain d'huile à température contrôlée. anneaux en acier inoxydable stabilisent la boîte de Pétri latéralement. (K) Le milieu de culture est recouvert d'une couche d'huile minérale.(L) Schéma du sandwich filtrant immergé. (M) Les dimensions des supports en papier filtre utilisé pour le sandwich de papier filtrant immergé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Representative Results

Figure 2
Figure 2: Comparaison entre Morphologique Embryons CE Culture 1 et Submergé papier filtre Sandwich Culture. cadres time-lapse sélectionnés montrent les embryons à des intervalles de 3 h. Les cadres sont redimensionnées pour donner une vue d'ensemble complète la morphologie de l'embryon. Les embryons ont été appariés selon l' âge à l'étape 7-somite (HH9) 15. 0 h indique le début de chaque expérience. Antérieur est toujours à gauche. Les images ont été acquises à l'aide d'éclairage à fond noir. (A) Embryon dans la culture CE 1, face ventrale cultivée sur un agar-albumen bas 1,33. Des images de haute qualité peuvent être acquises, que l'embryon est confiné dans la direction z. (B et C) Deux embryons cultivés dans le sandwich de papier filtre immergé: (B) côté ventral et (C) dorsale vers le haut.Embryons dans le sandwich de papier filtre développent sans différences qualitatives pendant au moins 27 h. Ils développent la circulation sanguine fonctionnelle et à la flexion crânienne et cervicale et tournent avec succès. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

acquisition time-lapse dépend du système de microscope disponibles. Dans cette étude, une longue distance de travail, verticale zoom microscope a été utilisé. Le facteur de zoom a été fixé à 5X. En combinaison avec le grossissement de 16X de l'oculaire, ce qui a entraîné 80X grossissement total, avec une résolution théorique de 1,3 um / pixel (comme indiqué dans le logiciel de microscope) 30. Pour augmenter le champ de vision, les embryons ont été imagées comme panoramas horizontaux de cinq sous-images (tuiles). Par conséquent, une région de mosaïque, composée de cinq tuiles se chevauchent, a été défini 29. Cette région de tuilesa été placée de manière à recouvrir complètement l'ouverture elliptique du papier filtre support dans son extension horizontale (Figure 2B - 0 h). Chaque tuile a une taille de 2048 x 2048 pixels, couvrant un champ de vision-d'environ 2,7 mm, et les tuiles ont été acquises avec un recouvrement de 10%, résultant en champ total de vision d'environ 12 mm x 2,7 mm pour le panorama. Le xy-platine motorisée déplacé par rapport à l'objectif avec une vitesse d'environ 1,75 mm / sec entre l' acquisition des carreaux séparés 29. L'image en direct a été porté sur le mésoderme présomitique antérieur et les somites les plus récemment formées (la mise au point de recherche de notre groupe). Pour compenser l'épaississement et le curling des embryons dans la direction z, z petits-piles (cinq à sept des avions différents avec une distance de 30 um) ont été acquises à chaque point 30 de temps. Ceux-ci ont été sélectionnés dans le plan focal de l'extrémité antérieure du mésoderme présomitique. La durée de l'acq time-lapseuisition a été fixée à 50 heures, et les intervalles de formation d'image de 3, 4, ou 10 min 31 ont été choisis. La qualité de l'acquisition time-lapse pourrait être améliorée en recentrant tous les 5-10 h et la redéfinition de la z-stack autour du nouveau plan focal optimal. A la fin de l'expérience, tout le temps de la série a été modifié manuellement, et des sous - ensembles d'images contenant le z-plan avec la meilleure mise au point ont été créé et enregistré dans un dossier séparé 32. Ces sous-ensembles d'images ont le temps cousu pour créer une série chronologique complète des images avec mise au point optimale. Les tuiles de chaque image de ce temps-série complète ont été cousues et fusionnées ensemble sans correction d'ombrage 30 et cadres time-lapse ont été exportées au format JPEG-images de taille 100% et 95% de compression 32. Les cadres time-lapse ont été importées comme une séquence d'images dans un logiciel professionnel de montage vidéo. Les détails 100% zooms ont été stabilisés, et le contraste global a été ajusté à notre goût. Les délais écarts finaux étaient encoded avec le codec H.264 et exportés en MPEG-4 conteneurs. Les films sont affichés à un taux de 15 images / sec (fps) et une résolution de 1.920 x 1.080 pixels cadre.

La figure 2 montre une comparaison entre un embryon in CE culture 1 (figure 2A) et deux embryons dans le papier filtre en sandwich culture submergée, l' un étant côté culture ventrale (figure 2B) et l'autre côté d' une dorsale vers le haut (figure 2C). Tous les embryons ont été appariés selon l' âge au stade de somite sept (HH9) 15 et imagées avec une résolution temporelle de 4 minutes (figure 2A et B) ou 10 minutes (figure 2C). cadres sélectionnés de 3 intervalles de h sont représentés. La culture CE (figure 2A) a permis d' imagerie très stable en raison de l'embryon reposant sur une écurie d' agar-albumen bas 1,33. L'embryon entier est resté dans un plan focal à travers til tout le temps-lapse. Cela pourrait être bénéfique pour des expériences plus courtes (plusieurs heures) et embryons très précoces, mais il est livré avec un fort confinement de l'embryon dans la direction z, peut entraver son développement en trois dimensions de succès à long terme. Au début, le confinement n'a abouti qu'à un léger aplatissement latéral de la tête de l'embryon par rapport à un embryon en culture en immersion sandwich papier filtre avec sa face ventrale (comparer Figure 2A et 2B à 0 h). Plus tard, la rotation de la tête a été altérée (Figure 2A - 21 h) et le rythme cardiaque ralenti. La circulation sanguine presque arrêté. Voir supplémentaire Film 1 pour le time-lapse complète de l'embryon dans la culture CE. Le panneau supérieur dans ce film montre un aperçu complet de l'embryon, tandis que le panneau en bas à gauche permet de visualiser le développement du cœur en pleine résolution. La segmentation du mésoderme présomitique en somites peut être soien en détail sur la partie inférieure droite.

Embryons dans le sandwich papier-filtre immergé, d'autre part, ont été limités dans leur extension en trois dimensions que par la tension naturelle des membranes qui les entourent. Ils pourraient être cultivées soit avec leur ventrale (figure 2B) ou du côté dorsal vers le haut (figure 2C). De toute façon, les embryons ont montré somitogenèse continu, et leurs têtes se tournèrent. Ils ont développé une flexion crânienne et cervicale et fonctionnelle circulation sanguine. Les deux embryons dans le sandwich de papier filtre ont été imagées avec l'accent mis sur le mésoderme de segmentation, de sorte que les parties de la tête déplacé progressivement hors du foyer que les embryons ont augmenté, épaissies, et a commencé à tourner, tandis que la partie segmentant du mésoderme est restée au foyer (comparer la figure 2B et 2C à 21 h à 27 h). Film supplémentaire 2 montre le film time-lapse complète de l'embryon représentéla figure 2B. L'intervalle de formation d'image est de 4 min. Le panneau supérieur de ce film montre un aperçu complet de l'embryon. Le développement de l'embryon a été imagée consécutivement plus de 46 heures, mais au bout d'environ 30 heures, l'accent mis sur le mésoderme de segmentation a été perdu en raison de l'épaississement général et tournant du tissu embryonnaire. Le panneau inférieur gauche montre le développement précoce du cœur en pleine résolution des images time-lapse acquises. Par fusion du primordiums cardiaque couplé sur les deux côtés de la ligne médiane, une structure tubulaire est formée à peu près rectiligne, qui commence plus tard battant et le pliage vers la droite. Le panneau en bas à droite montre le plus somites récemment formées et la pointe antérieure du mésoderme présomitique en pleine résolution et le suivi de la formation de nouveaux somites au fil du temps. Film supplémentaire 3 montre un autre embryon cultivé et imagée face ventrale dans le sandwich de papier filtrant immergé. L'intervalle de formation d'image est de 4 min. Le film couvre thle développement de e de l'embryon du stade HH5-6 à environ stade HH14 15, sur environ 27 heures de temps de culture. La tête plier les formes et progresse en arrière. Les formes de coeur de sa primordia bilatérale, commence à battre, et se penche vers la droite. Les trois à quatre premiers somites forment simultanément. somites supplémentaires bourgeonner séquentiellement à partir de l'extrémité antérieure du mésoderme présomitique. Le panneau inférieur montre la région de la tête de l'embryon en pleine résolution, permettant l'observation du pli de la tête et de la formation cardiaque précoce dans le détail élevé. Grâce à la transparence de l'embryon, la fermeture du tube neural peut être observé dans la future région de la tête. Film supplémentaire 4 affiche la formation de somites dans le même embryon en pleine résolution sur l'imagerie en temps plein dans le panneau inférieur. Film supplémentaire 5 montre le time-lapse complète de l'embryon dorsale de culture vers le haut (figure 2C). L'intervalle de formation d'image est de 10 min. Alors que le upper panneau montre le développement de l'embryon des sept étapes somites (HH9) à environ stade HH16-17, le panneau inférieur est recadrée pour afficher les changements morphologiques au début du cerveau à ce stade en pleine résolution. Le gonflement local du tube neural peut être observée, conduisant à la régionalisation du prosencéphale, mésencéphale et rhombencéphale, qui divisera dans les cinq sous - régions du cerveau embryonnaire à des stades ultérieurs 13. En outre, la croissance des vésicules optiques peut être vu clairement. Après environ 30 heures dans la culture, l'embryon est en train de mourir.

Pour montrer la compatibilité du filtre immergé papier sandwich avec des manipulations de microchirurgie, plusieurs microbilles en polystyrène (~ 40 um de diamètre) ont été implantés dans ou à proximité du mésoderme présomitique d'un embryon de poulet dans le filtre immergé papier sandwich à la culture. Les microbilles ont été lavées dans du PBS pour éliminer le tampon de stockage et IMPLANted avant de recouvrir le milieu de culture avec la couche d'huile minérale légère (comparer à l'étape 2.18 de la section de protocole). Une pipette Pasteur en verre a été utilisé pour transférer les billes à la surface de l'embryon, sous observation à travers les oculaires du microscope. Cinq trous ont été créés dans l'endoderme en grattant doucement avec une aiguille d'acupuncture. Un outil en forme de J sur mesure, créé par étirement et pliage d'une pipette Pasteur en verre dans une flamme, a été utilisé pour manipuler les perles et les pousser avec précaution dans les trous jusqu'à ce qu'ils deviennent immobiles. Trois trous ont été remplis avec un bourrelet chaque (figure 3A - 0 h et 3B *) et deux trous avec deux perles chacun (Figure 3A - 0 h). La figure 3A montre, dans une sélection de cadres time-lapse, le développement de l'embryon de poulet après l'implantation microchirurgicale des perles. Trois perles ont été incorporées avec succès dans le tissu à l'endroit désiré, et leur mouvement a été imagés au cours de lacours de l'expérience dans le détail élevé (figure 3B). Le développement de l'embryon ne semble pas être affectée par la manipulation ou à la présence des billes. Voir supplémentaire Film 6 pour le film complet time-lapse. L'intervalle de formation d'image est de 4 min.

Figure 3
Figure 3: Time-lapse Imaging après Microbead Implantation. Preuve de principe expérience montrant la compatibilité du filtre immergé papier sandwich avec microbille implantation. La tête de l'embryon se trouve à gauche, mais il n'a pas été reproduite au cours de cette expérience. Les images ont été acquises à l'aide d'éclairage à fond noir. (A) Sélectionné time-lapse cadres montrant l'embryon manipulé à intervalles de 3 h après l'implantation de sept microbilles (~ 40 m de diamètre). L'embryon allongé et formé en continu somit supplémentairees. Trois perles semblent avoir été correctement fixé et déplacé médialement avec le flux de tissu de plus de 18 h de culture. Les quatre autres perles sauté hors de leurs trous entre 6 et 9 h de la culture et a dérivé en arrière. (B) Vue détaillée des trois perles simples (B1 à B3) implantée dans le mésoderme présomitique au début de l'expérience (0 h, B *) et après 12 heures d'incubation (B **). Le nombre des somites juste formant est indiquée (S9 en B * et S18 en B **). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Film 1
Supplemental Film 1: EC-culture ventral Side Up. Embryon dans la culture CE 1, face ventrale cultivée jusqu'à, à partir de la septième étape de somites (HH9) 15 partir sur un botto agar-albumenm 1,33. L'intervalle de formation d'image est de 4 min. Le temps relatif est affiché dans le coin supérieur gauche. Des images de haute qualité peuvent être acquises, comme l'embryon a été confiné dans la direction z. Après 21 h, le rythme cardiaque et la circulation sanguine ont été presque arrêtés et l'embryon avaient commencé à se désintégrer. Le panneau supérieur montre une vue d'ensemble redimensionnée de l'embryon, tandis que les panneaux inférieurs de visualiser le développement du cœur (panneau de gauche) et la segmentation du mésoderme présomitique (panneau de droite) en pleine résolution (zoom 100%). (Clic pour télécharger).

Movie 2
Film supplémentaire 2: Filtre Submergé Sandwich papier face ventrale. Embryo cultivé dans le sandwich de papier immergé de la septième étape de somites (HH9) 15 partir, sid ventralee vers le haut. L'intervalle de formation d'image est de 4 min. Le temps relatif est affiché dans le coin supérieur gauche h et min, redémarrer après 24 h. Le panneau supérieur montre une vue d'ensemble redimensionnée du développement de l'embryon plus de 46 heures, consécutivement. Le panneau inférieur gauche permet de visualiser le développement cardiaque précoce pendant les 10 premières heures d'acquisition d'image en résolution maximale (100% zoom). Le panneau en bas à droite dépeint segmentant mésoderme sur environ 30 h de développement en pleine résolution (zoom 100%) jusqu'à ce que l'accent est perdu en raison de l'épaississement global et tournage du tissu embryonnaire. (Clic pour télécharger).

Film 3
Film supplémentaire 3: Head Fold Formation. Embryon cultivé face ventrale immergée dans le sandwich papier-filtre à partir de la luiad-process / stade tête double (HH5-6) 15 approximativement au stade 22 somites (HH14) 15 sur environ 27 heures de temps de culture. L'intervalle de formation d'image est de 4 min. Le temps relatif est affiché dans le coin supérieur gauche h et min, redémarrer après 24 h. Le panneau supérieur montre une vue d'ensemble redimensionnée du développement de l'embryon. Le panneau inférieur représente la région de la tête de l'embryon en résolution maximale (100% zoom). La formation du pli de la tête et le cœur au début et à la fermeture du tube neural peut être observée. (Clic pour télécharger).

Film 4
Film supplémentaire 4: somitogenèse. Embryon de culture face ventrale dans le submergée sandwich papier filtre du / stade de la tête double tête-process (HH5-6) 15à peu près au stade 22 somites (HH14) 15 sur environ 27 heures de temps de culture. L'intervalle de formation d'image est de 4 min. Le temps relatif est affiché dans le coin supérieur gauche h et min, redémarrer après 24 h. Le panneau supérieur montre une vue d'ensemble redimensionnée du développement de l'embryon. Le panneau inférieur représente le mésoderme paraxial segmentant en résolution maximale (100% zoom). (Clic pour télécharger).

Film 5
Film supplémentaire 5: Filtre Submergé Sandwich papier Side Dorsale Up. Embryon face dorsale de culture submergée dans le sandwich papier-filtre à partir de la phase sept somites (HH9) 15 à environ 15 HH16-17 l'étape. L'intervalle de formation d'image est de 10 min. Le temps relatif est affichédans le coin supérieur gauche dans h et min, redémarrer après 24 h. Le panneau supérieur montre une vue d'ensemble redimensionnée du développement de l'embryon. Le panneau inférieur représente des changements morphologiques dans le cerveau au début de la pleine résolution (zoom 100%). L'embryon est mort après environ 30 heures dans la culture. (Clic pour télécharger).

Film 6
Film supplémentaire 6: microbilles Implantés. Embryon de culture face ventrale dans le submergée sandwich papier filtre pendant environ 19 heures, à partir du stade somite neuf (HH9-10) 15. L'intervalle de formation d'image est de 4 min. Le temps relatif est affiché dans le coin supérieur gauche dans h et min. Le panneau supérieur montre une vue d'ensemble redimensionnée de la région de queue avec sept microbilles implantées dans le prmésoderme esomitic. Le panneau inférieur montre la région avec des microbilles implantées en pleine résolution (zoom 100%). (Clic pour télécharger).

Discussion

Comme une nouvelle variante de la culture CE bien établie 1, le sandwich de papier filtre immergé facilite l'acquisition de fond clair et darkfield time-lapse films à long terme du début d' embryon de poulet ex ovo en faisant un température et humidité contrôlée incubateur autour le microscope dispensable. Plutôt que d'être cultivées sur un fond agar-albumen semi-solide, les embryons sont maintenus complètement immergés dans un milieu de culture simple constitué de PC-solution saline et albumen minces. L'évaporation et la perte de chaleur sont réduits au minimum par une couche d'huile minérale flottant au-dessus du milieu de culture. Les embryons peuvent être cultivées facilement, soit dorsale ou ventrale vers le haut, sans différences visibles dans la qualité. Comme le montre ici, les embryons dans le papier filtre en sandwich submergée sont accessibles à des interventions de microchirurgie, comme l'application de perles de morphogènes imbibés. Les applications futures comprennent la fluorescence en direct imagerie, microinjections et électroporation, et Gene Silencing à manipulate et étudier un large éventail d'événements morphogénétiques pendant ventral (par exemple, le cœur précoce et somitogenèse) et dorsale (par exemple, la fin de la gastrulation, la fermeture du tube neural, et au début du cerveau) développement. Un traitement médicamenteux en fonction du temps est possible si la boîte de Pétri contenant le sandwich papier-filtre est remplacée par une chambre de perfusion, permettant l'échange du milieu de culture en dessous de la couche d'huile minérale. Le papier filtre en sandwich submergé va développer son potentiel d'imagerie complète en combinaison avec l'imagerie à base de laser (y compris la lumière de la fiche microscopie) et les objectifs d'immersion.

Quelques difficultés avec la préparation du papier filtre en sandwich submergé seront abordés dans les paragraphes suivants. Bien qu'il ne nécessite qu'une quantité modérée de formation pour transférer un embryon à partir du jaune dans le papier filtre en sandwich, plusieurs étapes peuvent encore influencer de manière significative la qualité de l'embryon dans la culture. Avant que le support de papier filtre estplacé sur le jaune d'œuf, la membrane vitelline autour de l'embryon doit être libéré de toute albumen épais. Alors seulement, la connexion entre le papier filtre et la membrane vitelline être suffisamment solide pour résister à la laver dans PC-saline. Le papier filtre portant l'embryon doit traverser l'interface liquide / air aussi peu que possible pour réduire au minimum la tension sur les membranes. Une fois introduit dans le PC-solution saline pour le lavage, le filtre entier papier support doit rester complètement immergé en tout temps. Le temps dans le bain de PC-solution saline doit être limitée à environ 30 - 60 s, comme la membrane vitelline va commencer à libérer du papier filtre. Pourtant, le nettoyage de l'embryon doit être exécuté très soigneusement, comme les restes de jaune seront plus tard obscurcir la vue de l'embryon. Pendant le lavage, ne jamais pointer le courant de la pipette de transfert directement sur l'embryon, mais toujours radialement loin de lui. Après avoir retiré l'embryon à partir du PC-saline, assurez-vous de tenir le papier filtre horizontalement pour minimisertension sur les membranes embryonnaires. Ensuite, stabiliser l'embryon avec le second support de papier filtre. Une fois que le second support de papier filtre est placé, éviter de créer une tension latérale, ce qui peut décaler les supports de papier filtre par rapport à l'autre et déchirer les membranes embryonnaires. Lorsque le sandwich papier-filtre est introduit dans le milieu de culture, il faut aussi traverser l'interface air / liquide, une seule fois pour réduire la tension sur les membranes. La deuxième paire d'anneaux en acier inoxydable utilisés pour stabiliser le sandwich papier-filtre à partir de la partie supérieure doit être placé très lentement et sans aucune pression pour minimiser la compression des membranes embryonnaires. Les petites ruptures de la zone opaca de l'embryon guérissent habituellement pendant la première heure de la culture, mais un embryon endommagé peuvent et doivent toujours être remplacés par un nouvel échantillon avant que la couche d'huile est pipeté au-dessus du milieu de culture.

Pour l'image d'un embryon entier ou plusieurs échantillons pour haute résolution des films time-lapse, le microroscope doit être équipé d'un étage XY motorisé, commandé par le logiciel du microscope. Il est d'une importance cruciale pour que le mouvement xy-scène avec une vitesse minimale pour éviter d'endommager les embryons et les turbulences dans le milieu de la culture et de l'huile, ce qui va diminuer la qualité d'image. Pour l'acquisition des films time-lapse présentés ici, le xy-platine motorisée déplacé avec une vitesse d'environ 1,75 mm / sec. Dans l'avenir, l'imagerie pourrait être encore améliorée en premier déplacement de la platine à la position désirée et l'acquisition de l'image après une courte période de repos pour laisser les vibrations et les turbulences disparaissent.

Comme une limitation, les utilisateurs potentiels doivent être conscients de la distance relativement longue de travail (environ 1 cm) nécessaire pour cette méthode de culture si un microscope droit sans objectifs d'immersion est utilisé. Cette distance de travail résulte de la couche de support et d'huile minérale au-dessus de l'embryon. Dans la boîte de Petri de 6 cm, la couche d'huile a une epaisseurs d'environ 1 à 1,5 mm, et l'embryon est submergée d'environ 4 mm de profondeur dans le milieu de culture. En fonction du diamètre de l'objectif, le bord supérieur de la boîte de Petri de 6 cm pourrait également limiter l'accès à l'embryon. Cela pourrait être contourné en utilisant un plat plus grand.

La distance de travail du haut pourrait être légèrement réduite en minimisant les épaisseurs des couches liquides. En outre, la distance de travail du bas peut être réduite au minimum en mettant l'embryon plus bas au fond de la boîte de Petri et en réduisant l'épaisseur de la fenêtre en verre du récipient chauffé. Alors que le protocole a été optimisé pour fonctionner avec une longue travail zoom à distance microscope droit, il pourrait être monté sur un microscope inversé ainsi. Les futurs utilisateurs doivent garder à l' esprit que submergeant l'embryon trop profondément dans le milieu de culture pourrait conduire à O 2 -Diffusion problèmes, bien que des expériences préliminaires suggèrent que la diffusion limitée ne semble pas être un problem, aussi longtemps que l'embryon est entouré d'un nombre suffisamment grand-réservoir de milieu de culture et le papier filtre pris en sandwich n'a pas été pressée sur le fond de la boîte de Petri.

Une autre limitation est le contrôle de la température. En réglant la température du dispositif de commande pour le récipient chauffé à 40 ° C, la température dans le milieu équilibrant à 37,5 ° C autour des embryons lorsque le support est recouvert d'une huile minérale. Cela montre qu'une certaine perte d'énergie entre le fond du récipient, dans lequel se trouvent les éléments de chauffage et le capteur de température, et l'emplacement des embryons. Le contrôle de la température pourrait être optimisée en déplaçant le capteur et redistribuant les éléments chauffants.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent le soutien financier d'une subvention ZonMW-VICI 918.11.635 (Pays-Bas). Les auteurs tiennent à remercier le magasin d'outils de la Vrije Universiteit Amsterdam pour leurs suggestions pratiques et pour la fabrication des composants d'installation et Jarno Voortman de Carl Zeiss Pays-Bas pour des conseils utiles sur la microscopie. Marjolein Blaauboer était d'un grand soutien en commentant de façon critique sur plusieurs versions du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q Reference Water Purification System Millipore Z00QSV0WW 
Duran laboratory bottles, with caps, 1 L Sigma-Aldrich/Duran Z305200-10EA 
Name Company Catalog Number Comments
Solution A
NaCl Merck Millipore 1064041000
KCl Merck Millipore 1049361000
CaCl2·H2O Merck Millipore 1023821000
MgCl2·6H2O Merck/Sigma-Aldrich 13152-1KG-D 
Name Company Catalog Number Comments
Solution B
Na2HPO4·2H2O Merck 1065801000
NaH2PO4·2H2O Merck 1063420250
Name Company Catalog Number Comments
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 Sigma-Aldrich 10311611
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130 W, wavelength 10.6 µm Micro Lasersystems
Tork Extra Soft Facial Tissues Tork 140280
Latex gloves Sigma-Aldrich Z645613
EMDAMED EMDA 300.131
Transfer pipettes Sigma-Aldrich Z350613
VWR WITG5.480.003
Accu-jet pro Pipette Controller BrandTech Scientific 26332
Serological plastic pipettes, 25 ml Sigma-Aldrich CLS4251
Plastic document sleeves
Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40 Fiem
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 cm Tissue culture dishes Sigma-Aldrich P5731
Greiner Bio-one 664160
6 cm Petri dishes Sigma-Aldrich P5481
50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes Sigma-Aldrich T2318
greiner bio-one 227261
Name Company Catalog Number Comments
Stainless steel rings, custom-made
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring
Nail scissors
Forceps, Dumont #5, Inox Fine Science Tools , F.S.T. 11251-20
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper VWR 21-102
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil Sigma-Aldrich CAS Number 8042-47-5
Name Company Catalog Number Comments
Agar bottoms for EC culture
Agarose Sigma-Aldrich A9539 SIGMA
NaCl Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Name Company Catalog Number Comments
Microbead implantation
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) Polysciences, Inc. 16905-1
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30 mm SEIRIN  type J, No.02, 0.12x30mm
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 
Name Company Catalog Number Comments
Temperature controlled beaker
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M Omega RTD-850M
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M Omega HSRTD-3-100-A-1M
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 Omega EXTT-3CU-26S-50
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M Omega MTP-U-M
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P Omega KHLV-103/(10)-P
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC Omega CNi16D24-C4EIT-DC
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)
Name Company Catalog Number Comments
Microscope setup
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN Carl Zeiss AG 495010-0009-000
Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56 mm Carl Zeiss AG 435281-9100-000
Manual Rotary Control MARC Carl Zeiss AG 435604-0000-000
Transillumination top 450 mot Carl Zeiss AG 435500-9000-000
Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D) Carl Zeiss AG 435465-9020-000
Insert plate S, glass 237x157x3 mm (D) Carl Zeiss AG 435465-9053-000
Controller EMS 3 Carl Zeiss AG 435610-9010-000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss AG 435611-9010-000
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera Hamamatsu C11440-22CU
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual Carl Zeiss AG 490004-0025-000
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US Carl Zeiss AG 410373-0200-000
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" Carl Zeiss AG 410350-2403-000 not available anymore
ZEN pro 2012 Hardware License key Carl Zeiss AG 410135-1002-120 not available anymore
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key Carl Zeiss AG 410136-1045-110
ZEN module Z Stack Carl Zeiss AG 410136-0030-110
ZEN Module Tiles/ Positions Carl Zeiss AG 410136-1025-110
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss AG 410136-1031-110
ZEN Module Experiment Designer Carl Zeiss AG 410136-1022-110
ZEN Desk 2012 Hardware License Key Carl Zeiss AG 410135-1004-120 not available anymore

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References

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Developmental Biology numéro 118 imagerie time-lapse papier filtre sandwich embryon de poulet culture CE, Micromanipulation somitogenèse neurulation le développement du cœur la formation du cerveau
Un filtre Sandwich de papier Submergé Long terme<em&gt; Ovo Ex</em&gt; Time-lapse Imaging of Early Chick Embryons
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Schmitz, M., Nelemans, B. K. A.,… More

Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (118), e54636, doi:10.3791/54636 (2016).

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