Abstract
Благодаря своей доступности, низкой стоимости, плоская геометрия, и прозрачность, экс ово куриного эмбриона стала одной из основных модели позвоночных животных для изучения морфогенетических событий, таких как гаструляцией 2, нейруляция 3 - 5, сомитогенез 6, сердце изгиб 7, 8, и мозг образование 9 - 13, во время раннего эмбриогенеза. Ключ к пониманию морфогенетических процессов должен следовать их динамически покадровой обработки изображений. Приобретение покадровой фильмов цыпленка эмбриогенез экс ово было ограничено либо коротких временных окон или необходимости инкубатор для контроля температуры и влажности воздуха вокруг эмбриона 14. Здесь мы представляем новую технику к культуре куриных эмбрионов экс ово для высокого разрешения покадровой визуализации с помощью микроскопии в проходящем свете. Погружной сэндвич бумажный фильтр представляет собой вариант хорошо налаженной фильтра технич бумажный носительIQUE (ИС-культура) 1 и позволяет культивировании эмбрионов кур без потребности в климатической камере. Эмбрион зажатой между двумя идентичными бумажных носителей фильтра и хранится полностью погружен в простой, контролируемой температурой среды, покрытой слоем светлых нефтепродуктов. Начиная с примитивной стадии полоски (Hamburger-Hamilton стадии 5, HH5) 15 до по крайней мере 28-сомитов (HH16) 15, эмбрионы могут быть выращены либо с их вентральной или спинной стороной вверх. Это позволяет приобретение покадровой фильмов, охватывающих около 30 ч эмбрионального развития. Представительные время покадровой кадров и фильмы показаны. Эмбрионы сравнивают морфологически эмбриону культивировали в стандартной EC-культуры.
Погружной сэндвич фильтровальной бумаги обеспечивает стабильную среду для изучения ранней спинной и брюшной морфогенетические процессы. Он также позволяет живой флуоресцентной визуализации и микроманипуляций, такие как микрохирургия, шарик импlantation, микроинъекции, ген глушителей, и электропорации, и имеет сильный потенциал, который будет сочетаться с целями погружения для лазерной основе изображений (в том числе световой микроскопии листа).
Introduction
Эмбриогенез очаровал человек с самого начала истории. Как структура и морфология эмбриона развиваются в таком хорошо определенной временной и пространственной форме? Куриного эмбриона стал одним из классических позвоночных животных моделей для эмбриогенеза по нескольким причинам: Он легко доступен, недорог, прозрачная на ранних стадиях, и доступны для экспериментальных манипуляций, так как она развивается вне матери. Кроме того, он имеет почти плоскую геометрию во время ранних морфогенетических событий, таких как сердце и формирование мозга, гаструляции, нейруляции и сомитогенеза 15.
Морфогенетические процессы могут быть поняты лучше, если они изучаются динамически, например, за счет приобретения покадровой изображений. Куриного эмбриона могут быть визуализированы в яйце 16 , но с низкой доступностью для экспериментальных манипуляций и ограниченной видимости для работы с изображениями светопропускание микроскопии. Поэтому разрыватьAl методы были предложены к культуре куриных эмбрионов бывших ово, либо в целых систем желток культуры 13,17 - 19 или в качестве эксплантов культур 1,20 - 23. В целом системы желток культуры, зародыш остается в верхней части неповрежденной желток, и все содержимое яйца переносят в другой контейнер для инкубации. Этот контейнер может быть суррогатной скорлупа 17, чашку Петри 19 или гамак из пластмассы цепляются обертка 13,18. Эмбрионы в целом желтка культур может идеально быть выращены до вылупления и доступны для микроманипуляций. Эти методы особенно полезны для изучения развития эмбрионов после начала кровообращения (что повышает контраст), в то время как более молодые эмбрионы остаются трудно представить. Эти ранние эмбрионы могут быть отображены лучше всего, если они вырезают из желтка и культивируют в качестве эксплантов в пробирке. Эксплантаты легко доступны для экспериментааль манипуляциями и требуют меньше места для культивирования. В течение многих лет методика впервые Денис Новое в 1955 году и его вариации были золотые стандарты методов культивирования эксплантов для куриных эмбрионов, таким образом делая эмбрион доступным для покадровой микроскопии и микрохирургических вмешательств 20,21. Несмотря на большой успех, техника новой является относительно сложным и требует много времени. Бластодерма часто отрывается , когда желточной оболочки, неся бластодерму, растягивается вокруг стеклянного кольца для достижения необходимого натяжения 1. К тому же, эмбрион можно культивировать только с его вентральной стороной вверх. EC (Early Chick) культура, более новый метод , разработанный Chapman и Collignon 1, обходит растяжению желточной оболочки с помощью фильтра бумажный носитель с центральным отверстием. Бумажный фильтр крепится к желточной оболочки, тем самым сохраняя его естественную напряженность, и окружает эмбрион как изображение кадра 1.Эмбрионы затем культивировали на агаровой-белково дно, как правило, с их вентральной стороной вверх. Культивирование спинной стороной вверх представляется возможным только для эмбрионов на HH8 15 лет и старше. Многие группы адаптировали фильтра бумажный носитель с их потребностями, например, путем замены агар-белковый дно с поддержкой сделанной из хирургических шовных волокон 24 или коллагена с покрытием мембраны 25. Часто, эмбрионы , культивированные с техникой новой или с культурой ЕС подвергаются с их спинном или вентральной воздуха для облегчения диффузии кислорода 1,20. Эти эксплантов культуры должны быть сохранены в увлажненной атмосфере, чтобы избежать испарения среды и предотвратить эмбрион от высыхания. Это достигается путем инкубирования блюдо с культурой эксплантов в большую чашку Петри , содержащую увлажненную папиросной бумаги 1. Приобретение покадровой изображений этих эмбрионов требует либо использование климат-контроля инкубатора вокруг всего микроскопа или сгорячаратура контролируемой емкости с нагретой крышкой для предотвращения образования конденсата на пути прохождения света 14. Тем не менее, куриные эмбрионы могут также развиться экс ово полностью погружен в культуральной среде в качестве фильтровальной бумаги культур 25, зажатой между слоем тяжелого минерального масла и белке в Адаптации техники New'S 2,21, или как сложенными бластодерму эксплантов в "Корниш пастообразных культуры "23,26, без непосредственного контакта с воздухом.
Погружной сэндвич фильтровальная бумага представляет собой новый вариант методики фильтровальной бумаги-носителя. Объединив ранее знания о культивировании эмбрионов кур ех ово, он делает климат-контролем инкубатор и нагретый крышку необязательным. Эмбрион зажатой между двумя идентичными (лазерной резкой) фильтровальной бумаги носителей 24 и культивировали полностью погруженных в простой питательной среде (Pannett-Комптона физиологический раствор 27,28 и тонких белке в соотношении 3: 2) в контролируемой температурой содержатьэ. Слой светлых нефтепродуктов , плавающей на поверхности среды предотвращает испарение 2,21 и сводит к минимуму потери тепла в окружающую среду. В нижней части контейнера имеет стеклянное окно, и вся установка выполняется на вертикальном большое рабочее расстояние трансфокатора микроскопа. Эта установка позволяет приобретение высокого разрешения Светлое и темнопольным покадровой фильмов около 30 часов эмбрионального развития, начиная от ранней стадии первичной полоски к 28-сомитов (эквивалентно Hamburger Гамильтон ступени от 5 до 16, HH5-16 ) 15. Эмбрионы можно культивировать одинаково хорошо с их вентральной или спинной стороной вверх. Таким образом, эмбрионы являются доступными для наблюдения и манипулирования вентральной (например, в начале сердца 7,8 и сомитогенез 6) и спинные (например, в конце гаструляция 2, закрытия нервной трубки 3 - 5, и в начале мозга 9 - 13) развития. Погружной бумажный фильтр сандвича рrovides простой и стабильной среды для микрохирургии, кромочная имплантации, микроинъекции, молчанием генов и исследований электропорации. Его потенциал формирования изображения может быть выдвинут гораздо дальше с помощью лазера на основе изображений (в том числе световой микроскопии листа) и целей погружения.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с экспериментами Нидерландов по Закону животных.
Примечание: Глубинный фильтр Метод бумажный сэндвич изменяется от 1.
1. Погружной фильтр сэндвич бумаги Подготовка
- Pannett-Комптон (PC) -saline 27,28
- Подготовить исходные растворы А (1 л сверхчистой H 2 O, 121 г NaCl, 15,5 г хлористого калия, 10,42 г CaCl 2 · H 2 O и 12,7 г MgCl 2 · 6H 2 O) и В (1 л сверхчистых H 2 O, 2,365 г Na 2 HPO 4 · 2H 2 O и 0,188 г NaH 2 PO 4 · 2H 2 O) в чистых 1-L бутылок. Хранить их при температуре 4 ° С.
- Готовят 1 л PC-солевого раствора путем смешивания 900 мл сверхчистой H 2 O с 40 мл маточного раствора и 60 мл исходного раствора В (в этом для того , чтобы избежать осаждения). Подготовка PC-солевой раствор свежемолотый фрО.М. маточные растворы А и В каждую неделю.
Примечание: Маточные растворы можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев. Обработку в автоклаве и / или добавление антибиотиков или противогрибковые не нужны.
- Инкубация оплодотворенных куриных яиц
- В увлажненном инкубаторе, кладут яйца на их стороне и инкубировать их при температуре 37,5 ° С, пока они не достигают желаемого возраста.
Обратите внимание: больше яиц Хранить не более двух недель (предпочтительно при 12 - 15 ° C) до эксперимента, так как выводимость значительно снизится
- В увлажненном инкубаторе, кладут яйца на их стороне и инкубировать их при температуре 37,5 ° С, пока они не достигают желаемого возраста.
- Фильтр бумажных носителей (адаптировано из 1)
- Если есть возможность, используйте для лазерной резки, чтобы вырезать в форме песочных часов фильтровальную бумагу носители из толстой фильтровальной бумаги (28 мм х 22 мм). Конус ширина в середине от 22 мм до 10,4 мм. Вырез центральную эллиптическую апертуру (10,6 мм х 5,5 мм), с более длинной оси эллипса ориентированы параллельно к большей стороне фильтра бумажного носителя (Рисунок 1-М).
- Необязательно, подготовить картонную трафарет с правильными размерами и передать его очертания и что из центрального отверстия в толстой фильтровальной бумаги с помощью карандаша. Вырежьте держатель фильтра бумаги с помощью тонких ножниц.
- Вырежьте два одинаковых несущих фильтровальной бумаги для каждого эмбриона быть эксплантировали. Подготовка дополнительных фильтров бумажных носителях в качестве резервного в случае теряется эмбрион во время культивирующий в искусственной среде.
- Если есть возможность, используйте для лазерной резки, чтобы вырезать в форме песочных часов фильтровальную бумагу носители из толстой фильтровальной бумаги (28 мм х 22 мм). Конус ширина в середине от 22 мм до 10,4 мм. Вырез центральную эллиптическую апертуру (10,6 мм х 5,5 мм), с более длинной оси эллипса ориентированы параллельно к большей стороне фильтра бумажного носителя (Рисунок 1-М).
- Терморегулируемая масляная баня (на день эксперимента)
- Поместите химический стакан емкостью с регулируемой температурой в центре моторизованных ху ступени вертикального масштабирования микроскопа и соединить мензурку с его контроллером температуры.
- Поместите четыре больших кольца из нержавеющей стали (30 мм внешний диаметр, 4 мм в высоту, 1,5 мм толщина стенки) в 6 см чашку Петри, чтобы действовать в качестве весов и поместите блюдо в середине стакане с контролируемой температурой.
Примечание: Это блюдо Петри просто служит в качестве заполнителя для регулировки масла lèveл. - Наполните контролируемой температурой стаканчика 130 мл светлого минерального масла. Отрегулировать уровень масла, при необходимости таким образом, чтобы он заканчивался около 3 мм ниже верхней кромки 6 см чашки Петри.
- Удалите 6 см чашку Петри из стакане с регулируемой температурой и установить температуру до 40 ° С.
2. Погружной фильтр сандвича бумажного производства
- Питательная среда (в день эксперимента)
- Налейте 30 мл PC-солевого раствора (приготовленного с шагом 1.1.1 к 1.1.2) в центрифужную пробирку на 50 мл. Подготовьте один 50 мл центрифужную пробирку, заполненную 30 мл PC-солевого раствора на каждые два эмбриона, чтобы быть эксплантировали.
- Тщательно треснуть не инкубированных яйцо в 10 см чашку Петри.
- Урожай тонкие в белке путем перемещения пластиковой пипетки передачи вдоль стенок чашки Петри и сосать в тонких белке. Соберите 30 мл тонких в центрифуге в белке пробирку емкостью 50 мл на каждые два эмбрионы эксплантировали. Убедитесь в том, чтобы получить только тхин альбуминная.
Примечание: Как правило, 3 - 4 яйца позволяют урожай около 30 мл тонких белке. - Налейте 20 мл тонких белке в каждый PC-солевой раствор заполнены 50 мл центрифужную пробирку (полученной на этапе 2.1.1).
- Смешайте PC-солевой раствор с тонкими белке, аккуратно переворачивая трубок несколько раз. Пусть ему отстояться в течение нескольких минут и проверьте, если смесь, называемая питательная среда здесь и далее, ясно. Если питательная среда не ясно, готовить свежий PC-солевой раствор из раствора и собрать свежие тонкие в белке.
- Поместите два маленьких из нержавеющей стали кольца (20 мм внешний диаметр 4 мм в высоту, 1,5 мм Толщина стенки 6,5 мм зазор в кольце), как далеко друг от друга, насколько это возможно в свежем 6 см пластиковой чашке Петри и залейте его 22 мл культуры средний (подготовленный с шагом 1.4.1 к 1.4.4) с использованием пластиковой пипетки 25 мл (рисунок 1-Н). Убедитесь, что мусор скапливается на верхней части среды остается в центрифуге трубки.
- Удалите мусор OR пузырьков из среды с помощью пластиковой пипетки передачи.
- Заполните 10 см чашку Петри с 75 мл PC-солевой раствор (для использования на этапе 2.15).
- Удалить яйца из инкубатора и дайте ему отдохнуть на скамейке на его стороне в течение 1 мин, чтобы позволить эмбрион прийти к верхней части желтка.
- Осторожно расколоть яйцо в чашку Петри (Рисунок 1-A). Замочите край листке бумаги тонкой ткани в толстых белке и центрирования бластодерму, потянув, если это необходимо.
- Удалить большинство тонких и толстых белке из чашки Петри с помощью пластиковой пипетки передачи (с наконечником отрезан, чтобы облегчить поглощение толстых альбумином).
- Создание окна в толстых белке вокруг эмбриона, осторожно вытирая толщиной в белке с папиросную бумагу, удаляясь от центра (рисунок 1-B). Предотвратить папиросную бумагу от прикрепляться к желточной оболочки.
- С помощью пинцета аккуратно поместите фильтр бумажный носитель на Витеlline мембрана вокруг эмбриона, с более длинной оси эллиптического отверстия , параллельной передне-задней оси эмбриона (рисунок 1-C).
- Зажмите один кончика ногтя ножниц через желточной оболочки ближе к фильтру бумажного носителя и быстро обвести весь фильтр бумажного носителя (Рисунок 1-D).
- С помощью пинцета поднимите держатель фильтра бумаги от желтка в косом направлении , параллельном передне-задней оси зародыша (рис 1-Е).
- Включите фильтр бумажный носитель вокруг, чтобы иметь вентральной стороне эмбриона на вершине и погрузить его в PC-солевой раствор. Погрузите фильтр бумажный носитель вдоль передне-задней оси эмбриона в косом направлении.
- Избавьтесь от всех желтке еще прилагается желточной мембраны и бластодерму осторожно смыв с PC-солевой раствор из пластиковой пипетки передачи. Держите полноту носителя фильтровальной бумаги под флюсом точке араз LL (Рисунок 1-F).
- Извлеките носитель фильтровальную бумагу из PC-солевого раствора вдоль передне-задней оси эмбриона в косом направлении и избавиться от избытка жидкости вытирать края фильтра бумажного носителя на папиросную бумагу.
- Удерживая фильтровальную бумагу в горизонтальном направлении, с вентральной стороне эмбриона, обращенной вверх, и поместить другой фильтр бумажный носитель поверх первого, используя вторую пару пинцетов. Их отверстия должны точно совпадать, тем самым прослаивая зародыш между двумя слоями фильтровальной бумаги (Рисунок 1-G).
- Немедленно погрузить сэндвич-носитель фильтровальную бумагу в культуральную среду в косом направлении вдоль передне-задней оси зародыша. Поместите его в области , охватывающей пространство между двумя стальными кольцами (рис 1-Н).
- Закрепить бутерброд фильтровальную бумагу путем размещения еще два стальных кольца на верхней части двух других, убедившись в том, что отверстие с еmbryo остается полностью непокрытый (Рисунок 1-I).
- Проверьте средний уровень и убедитесь, что верхняя распорка просто погружен в среду. При необходимости, добавлять или удалять небольшие количества среды.
- Аккуратно поместите чашку Петри в центре масляной бане с контролируемой температурой и стабилизации антенны в боковом направлении, помещая три больших нержавеющей стали кольца (30 мм внешний диаметр, 4 мм в высоту, 1,5 мм толщины стенки) рядом с блюдом в масле , Убедитесь , что стальные кольца касаются краев блюда (рис 1-J).
- Медленно пипеткой приблизительно 6 мл светлого минерального масла на поверхности среды с пластиковой пипетки передачи, так что среда покрыта сплошным слоем минерального масла (рис 1-K).
- Настройка приобретения покадровой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация эмбрионов в виде горизонтальных панорам пяти пересекающихся суб-изображений (плитка) позволяет детальное изображения (объективом 5х), с общим overviРЭБ морфологии 29-30. Интервалы обработки изображений от 3 до 10 мин позволяют для детального отслеживания морфологических изменений 31 и приобретение малых Z-стеки ( от пяти до семи различных плоскостей с расстоянием 30 мкм) компенсирует большую часть утолщения и поворота эмбриона 30 , Z-плоскости с высочайшей контрастностью можно выбрать перед дальнейшей обработкой 32 отдельных кадров в покадровой фильмов (см раздел Результаты репрезентативными для получения подробной информации о приобретении изображений).
Рисунок 1: Настройка погруженной Сэндвич бумажный фильтр. (A) Яйцо треснул в чашку Петри. (В) Большинство толстых и тонких белке удаляется из чашки Петри с пластиковой пипетки передачи (не показан). Затем окно в толстых белке создаетсявокруг эмбриона, осторожно вытирая толщиной в белке с папиросной бумагой. (С) Фильтр бумажный носитель помещают вокруг бластодерму на верхней части желтка. (D) , бумажный носитель фильтр отделиться от окружающей желточной оболочки , и (Е) удаляется из верхней части желтка. (F) Оставшийся желток тщательно смыты в PC-солевой ванной. (G) Эмбрион зажат со вторым идентичным фильтром бумажном носителе. (Н) Сэндвич бумажный фильтр погружают в среду и расположены на двух металлических колец из нержавеющей стали (эмбриона , обращенной дорсальной или вентральной стороной вверх). (I) Два кольца стабилизации сандвич с вершины. (J) Чашку Петри , содержащую эмбрион переносят в масляную баню с контролируемой температурой. Кольца из нержавеющей стали стабилизировать чашку Петри в боковом направлении. (К) , культуральная среда покрыта слоем минерального масла.(L) Схема погружного сэндвича фильтра. (М) Размеры бумаги носителей , используемых для фильтров погруженной сэндвича из фильтровальной бумаги. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Representative Results
Рисунок 2: Морфологические Сравнение между Эмбрионы в ЕС культуры 1 и в погружной фильтровальная бумага Sandwich культуры. Выбранные покадровой кадры показывают эмбрионов с интервалами в 3 ч. Кадры изменен, чтобы дать общее представление о полной морфологии эмбриона. Эмбрионы соответствующего возраста с 7-сомитов (HH9) 15. 0 ч указывает на начало каждого эксперимента. Передней всегда слева. Изображения были получены с использованием темнопольные освещения. (A) Эмбрион в культуре EC 1, культивируют вентральной стороной вверх на агар-белке донных 1,33. Высококачественные изображения могут быть получены, как эмбрион заключен в г-направлении. (В и С) Два эмбрионы культивировали в затопленной бутерброда фильтровальной бумаги: (B) брюшная сторона и (C) спинной стороной вверх.Эмбрионы в сэндвиче фильтровальной бумаги развиваться без качественных различий, по крайней мере, 27 ч. Они развивают функциональное кровообращение и черепной и цервикальный сгибание и повернуть успешно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Приобретение Покадровый зависит от системы микроскопа доступной. В этом исследовании, длительное рабочее расстояние, был использован в вертикальном положении зум микроскоп. Коэффициент масштабирования был установлен в 5X. В сочетании с 16 - кратным увеличением окуляра, это привело к 80X общее увеличение, с теоретическим разрешением 1,3 мкм / пиксель (как указано в программном обеспечении микроскопа) 30. Для увеличения поля-обзора, эмбрионы были обследованы в виде горизонтальных панорам пяти суб-изображений (плитка). Таким образом, область плитка, состоящая из пяти перекрывающихся плиток, был определен 29. Этот регион плиткибыл расположен таким образом , чтобы полностью покрыть эллиптическую апертуру фильтра бумажного носителя в горизонтальном расширении (Фигура 2В - 0 ч). Каждая плитка имела размер 2,048 х 2,048 пикселей, покрывая поля обзора которого составляет приблизительно 2,7 мм, и плитки были приобретены с перекрытием 10%, в результате чего общее поле-обзора около 12 мм х 2,7 мм для панорама. Моторизованная XY-ступень перемещается относительно цели со скоростью приблизительно 1,75 мм / с между приобретением отдельных плиток 29. Живое изображение было сосредоточено на передней пресомитной мезодермы и наиболее недавно сформированных сомитов (исследование фокус нашей группы). Для того, чтобы компенсировать утолщением и свертывании эмбрионов в направлении г, малых г-стеки ( от пяти до семи различных плоскостях с расстоянием 30 мкм) были приобретены в каждый момент времени 30. Они были выбраны вокруг фокальной плоскости переднего конца пресомитной мезодермы. Продолжительность покадровой ACQuisition был установлен на 50 ч, а интервалы между формированием изображения 3, 4, или 10 мин были выбраны 31. Качество приобретения покадровой может быть улучшена за счет переориентации каждые 5 - 10 ч и переосмысление Z-стек вокруг новой оптимальной фокальной плоскости. В конце эксперимента все время серии была отредактирована вручную, а также были созданы и сохранены в отдельную папку 32 подмножества изображений , содержащих плоскость г с лучшим фокусом. Эти подмножества изображений были сшиты времени, чтобы создать полный временной ряд изображений с оптимальной фокусировки. Плитки каждого изображения этого полных рядов были сшиты и сплавлены вместе без коррекции затенения 30, и время покадровой кадры были экспортированы в виде JPEG-изображений 100% размера и 95% сжатия 32. Время: покадровой кадры были импортированы в виде последовательности изображений в профессиональное программное обеспечение для редактирования видео. Подробные 100% наезды были стабилизированы, а общий контраст была скорректирована по душе. Окончательные временные промахи были закодироватьd с кодеком H.264 и экспортируются в MPEG-4 контейнеров. Фильмы отображаются с частотой кадров 15 кадров / сек (кадров в секунду) и разрешением 1920 х 1080 пикселей.
На рисунке 2 показано сравнение между эмбрионом в ЕС культуре 1 (фиг.2А) и двух эмбрионов в подводном фильтровальную бумагу сандвича культуры, один из которых культивируют вентральной стороной вверх (Фигура 2В) , а другой один спинной стороной вверх (фиг.2с). Все эмбрионы соответствующего возраста к семи сомитов (HH9) 15 и изображается с временным разрешением 4 мин (рис 2А и В) или 10 мин (рис 2С). Отдельные кадры интервалами в 3 ч изображены. Культура EC (рис 2A) позволило очень стабильное изображение из - за эмбриона на прочной агар-белке донных 1,33. Весь эмбрион остался в одной фокальной плоскости на протяжении тон все время замедленной. Это может быть полезно для более коротких экспериментов (несколько часов) и очень ранних эмбрионов, но он приходит с сильным удержанием эмбриона в направлении г, возможно, препятствия на пути его успешного трехмерного развития в долгосрочной перспективе. В начале, конфайнмент привело лишь к незначительному латерального уплощения головы зародыша по сравнению с эмбрионом , культивированных в погруженном фильтровальной бумаги бутерброда с его вентральной стороной вверх (сравните рисунок 2А и 2В при 0 ч). Позже, поворот головы была нарушена (рис 2A - 21 ч) , а сердцебиение замедляется. Кровообращение почти прекратилось. См Дополнительный ролик 1 для полного покадровой эмбриона в культуре ЕС. Верхняя панель в этом фильме показан полный обзор эмбриона, в то время как панели на нижнем левом углу визуализирует развитие сердца в полном разрешении. Сегментация пресомитной мезодермы в сомитов может быть таковойан подробно в нижнем правом углу.
Эмбрионы в подводном сэндвича из фильтровальной бумаги, с другой стороны, были ограничены в трехмерном разложении только естественным натяжения мембран, окружающих их. Они могут быть выращены либо с их вентральной (рис 2B) или спинной стороной вверх (рис 2С). В любом случае, эмбрионы показали непрерывное сомитогенеза, и их головы повернулись. Они разработали черепную и шейки матки сгибание и функциональное кровообращение. Оба эмбрионов в сэндвиче из фильтровальной бумаги, визуализировали с акцентом на сегментирование мезодермы, так что части головы постепенно перемещается из фокуса, как зародыши выросли, утолщенный, и начал поворачиваться, в то время как сегментировать часть мезодермы оставалась в фокусе (сравните рис 2В и 2С в 21 ч до 27 ч). Справочная Фильм 2 показывает полное замедленную фильм эмбриона , изображеннуюна фигуре 2В. Интервал формирования изображения 4 мин. Верхняя панель этого фильма показывает полный обзор эмбриона. Развитие эмбриона изображался последовательно в течение 46 ч, но после того, как приблизительно 30 ч, в центре внимания на сегментирования мезодермы заблудился в связи с общим утолщением и обточки эмбриональной ткани. Нижняя левая панель показывает раннее развитие сердца в полном разрешении с приобретенным покадровой кадров. Через слияние парного сердца зачатков по обе стороны от средней линии, почти по прямой трубчатой конструкции образуется, которая позже начинает биться и изгиб вправо. Нижняя правая панель показывает наиболее недавно сформированных сомитов и передний конец пресомитной мезодермы в полном разрешении и отслеживает появление новых сомитов в течение долгого времени. Справочная Movie 3 показывает другой эмбрион культивируют и изображается вентральной стороной вверх в погруженном бутерброда фильтровальную бумагу. Интервал формирования изображения 4 мин. Фильм охватывает тысРазвитие электронной эмбриона от стадии HH5-6 до приблизительно стадии HH14 15, в течение примерно 27 ч времени культивирования. Голова сложите формы и прогрессирует кзади. Формы сердца от своего двустороннего зачатков, начинает биться, и наклоняется вправо. Первые три-четыре сомиты образуют одновременно. Дополнительные сомиты бутон от последовательно от переднего конца пресомитной мезодермы. Нижняя панель показывает головной области эмбриона в полном разрешении, что позволяет наблюдать головной складки и раннего формирования сердца в высокой детализации. Благодаря прозрачности эмбриона, закрытие нервной трубки можно наблюдать в будущей области головы. Справочная Movie 4 отображает образование сомитов в том же эмбриона в полном разрешении в течение полного времени формирования изображения в нижней панели. Справочная Movie 5 показывает полную покадровой эмбриона культивировали спинной стороной вверх (рис 2С). Интервал Визуализацию 10 мин. В то время как УППэр панель показывает развитие зародыша из семи сомитов (HH9) до приблизительно стадии HH16-17, нижняя панель обрезается, чтобы отобразить морфологические изменения в раннем мозге на этой стадии в полном разрешении. Локальный отек нервной трубки можно наблюдать, что приводит к регионализации переднего мозга и среднего мозга, заднего мозга, которая будет делить на пять субрегионов эмбрионального мозга на поздних стадиях 13. Кроме того, рост зрительных везикул можно ясно видеть. Примерно через 30 часов в культуре, зародыш умирает.
Для того, чтобы показать совместимость погружного фильтровальной бумаги бутерброда с микрохирургических манипуляций, несколько полистирольных микрошариков (~ 40 мкм в диаметре) были имплантированы в или в непосредственной близости от пресомитной мезодермы куриного эмбриона в погружают фильтровальную бумагу сандвича культуры. Эти микросферы промывали в PBS для удаления буфера для хранения и implanTed до покрытия культуральной среды со слоем светлого минерального масла (сравните к этапу 2.18 раздела протокола). Стакан пипетки Пастера был использован для переноса бусинок на поверхность эмбриона, под наблюдением через окуляры микроскопа. Пять отверстий были созданы в эндодермы, аккуратно очищая его с акупунктурной иглой. J-образный инструмент на заказ, созданный растяжение и изгиб стеклянной пипетки Пастера в пламени, была использована для манипулирования бусинки и подтолкнуть их осторожно в отверстия, пока они не стали неподвижными. Три отверстия были заполнены одной бусинки каждый (Фигура 3А - 0 ч и 3B *) и два отверстия с двумя бортами друг (Фигура 3А - 0 ч). Фигура 3A показывает, в выбранных покадровой кадров, развитие куриного эмбриона после микрохирургического имплантации гранул. Три гранулы успешно включены в ткань в нужном месте, и их движение изображался надХод эксперимента в высокой детализации (рис 3B). Развитие эмбриона, похоже, не обесцененные манипуляциями или наличие шариков. См Дополнительный ролик 6 для полного покадровой фильма. Интервал формирования изображения 4 мин.
Рисунок 3: Время покадровой обработки изображений после Microbead имплантацией. Проверка и подтверждение принципа действия эксперимента, показывающий совместимость погружного фильтра бумаги бутерброд с микрогранулами имплантации. Голова зародыша находится слева, но она не была отображена в ходе этого эксперимента. Изображения были получены с использованием темнопольные освещения. (А) , выбираемый покадровой кадры показывая манипулируют эмбриона с интервалами в 3 часа после имплантации семи микрошариков (~ 40 мкм в диаметре). Эмбрион удлинены и непрерывно образуется дополнительный Сомитэс. Три бусины, кажется, были правильно установлены и перемещается медиально с потоком ткани в течение 18 ч культуры. Остальные четыре бусины вылезли из своих нор от 6 до 9 ч культуры и дрейфовал кзади. (В) , детальный вид трех одиночных шариков (В1-В3) имплантировали в пресомитной мезодермы в начале эксперимента (0 ч, В *) и через 12 ч инкубации (B **). Число точно образующих сомитов указывается (S9 в B * и S18 в B **). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Справочная Фильм 1: EC-культура Брюшной Side Up. Эмбрион в культуре EC 1, культивируют вентральной стороной вверх, от стадии семи сомитов (HH9) 15 и далее на агар-белковины Bottoм 1,33. Интервал формирования изображения 4 мин. Относительное время отображается в верхнем левом углу. Высококачественные изображения могут быть приобретены, поскольку эмбрион был заключен в г-направлении. После 21 ч, сердцебиение и кровоток были почти арестованы и эмбрион начал распадаться. Верхняя панель показывает уменьшенное обзор эмбриона, в то время как нижние панели визуализации развития сердца (левая панель) и сегментацию пресомитной мезодермы (правая панель) в полном разрешении (100% увеличение). (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Справочная Фильм 2: Погружной фильтровальной бумаги Сэндвич Брюшной Side Up. Эмбрион культивировали в затопленной сэндвич бумаги со сцены семи сомитов (HH9) 15 года, вентральный с.и.д.е вверх. Интервал формирования изображения 4 мин. Относительное время отображается в верхнем левом углу в час и мин, перезапуск после 24 часов. Верхняя панель показывает уменьшенное обзор развития эмбриона в течение 46 ч, последовательно. Нижняя левая панель визуализирует раннее развитие сердца в течение первых 10 часов получения изображения в полном разрешении (100% увеличение). Нижняя правая панель не изображает сегментирование мезодермы в течение примерно 30 часов развития в полном разрешении (100% увеличение), пока фокус теряется из-за общего утолщения и поворота эмбриональной ткани. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Справочная Фильм 3: Голова Fold свита. Эмбрион культивировали вентральной стороной вверх в погруженном бутерброда фильтровальную бумагу из негоад-процесс / стадия головки раза (HH5-6) от 15 до приблизительно 22 сомитов (HH14) 15 в течение примерно 27 ч времени культивирования. Интервал формирования изображения 4 мин. Относительное время отображается в верхнем левом углу в час и мин, перезапуск после 24 часов. Верхняя панель показывает уменьшенное обзор развития эмбриона. Нижняя панель изображает головной области эмбриона в полном разрешении (100% увеличение). Формирование головной складки и раннего сердца и закрытия нервной трубки можно наблюдать. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Справочная Фильм 4: сомитогенеза. Эмбрион культивировали вентральной стороной вверх в погруженном бутерброда фильтровальную бумагу из головы процесса / головки раза стадии (HH5-6) 15примерно на 22 сомитов (HH14) 15 в течение примерно 27 ч времени культивирования. Интервал формирования изображения 4 мин. Относительное время отображается в верхнем левом углу в час и мин, перезапуск после 24 часов. Верхняя панель показывает уменьшенное обзор развития эмбриона. Нижняя панель изображает сегментирование параксиальную мезодермы в полном разрешении (100% увеличение). (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Справочная Фильм 5: Погружной фильтровальной бумаги Сэндвич спинной стороной вверх. Эмбрион культивируют спинной стороной вверх в погруженном бутерброда фильтровальную бумагу из семи сомитов (HH9) 15 до приблизительно HH16-17 15 ступени. Интервал Визуализацию 10 мин. Отображается относительное времяв верхнем левом углу в час и мин, перезапуск после 24 часов. Верхняя панель показывает уменьшенное обзор развития эмбриона. Нижняя панель изображает морфологические изменения в раннем мозге в полном разрешении (100% увеличение). Эмбрион умер после того, как около 30 часов в культуре. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Справочная Фильм 6: Microbeads Имплантированных. Эмбрион культивировали вентральной стороной вверх в погруженном бутерброда фильтровальной бумаги в течение примерно 19 часов, начиная с девяти сомитов (HH9-10) 15. Интервал формирования изображения 4 мин. Относительное время отображается в верхнем левом углу в час и мин. Верхняя панель показывает уменьшенное обзор хвостовой области с семью микросферы имплантируют в прesomitic мезодерма. Нижняя панель показывает область с имплантированными микрогранул в полном разрешении (100% увеличение). (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Discussion
В новом варианте хорошо налаженной культуры EC 1, погружной сэндвич фильтровальной бумаги облегчает приобретение долгосрочных Светлое и темнопольный покадровой фильмов раннего эмбриона цыпленка экс ово, делая температурно-влажностный управляемый инкубатор вокруг микроскоп необязательной. Вместо того, чтобы культивировать на полутвердой агар-белковины дно, эмбрионы всегда полностью погружена в простой питательной среде, состоящей из PC-солевого раствора и тонких белке. Испарение и потери тепла сведены к минимуму с помощью слоя минерального масла плавающим на поверхности питательной среды. Эмбрионы можно культивировать легко, либо спинной или вентральной стороной вверх, без видимых различий в качестве. Как показано здесь, эмбрионы в подводном бумаги сэндвича фильтра доступны для микрохирургических вмешательств, как применение морфогенов пропитанной бисера. Будущие приложения включают в себя живой флуоресцентных изображений, микроинъекции и электропорации и молчанием генов в маnipulate и изучить широкий спектр морфогенетических событий во время развития вентральной (например, раннее сердце и сомитогенез) и спинные (например, в конце гаструляции, закрытие нервной трубки, и ранний мозг). Зависимое от времени медикаментозное лечение является возможным, если чашку Петри, содержащую сандвич фильтровальную бумагу заменяют перфузионной камеры, что позволяет обмен культуральной среды под слоем минерального масла. Погружной сэндвич бумажный фильтр будет развивать свой потенциал формирования изображения в сочетании с лазером на основе изображений (в том числе световой микроскопии листа) и целей погружения.
Некоторые трудности с подготовкой погруженной бумажного фильтра бутерброда будут рассмотрены в следующих параграфах. Несмотря на то, что требуется только умеренное количество тренировок для передачи эмбриона из желтка в бумажный сэндвич фильтра, несколько шагов, которые могут по-прежнему существенно влияют на качество эмбриона в культуре. Перед тем как носитель фильтровальная бумагапомещается на желтке, желточной оболочки вокруг зародыша должны быть освобождены от любых толстых белке. Только тогда связь между фильтровальной бумагой и желточной мембраны быть достаточно прочным, чтобы выдерживать стирку в PC-солевой раствор. Фильтровальная бумага, несущий эмбрион пересекает границу раздела / воздуха жидкость как можно меньше, чтобы свести к минимуму напряжение на мембранах. После того, как приведено в РС-солевой раствор для промывания, весь фильтр бумажный носитель должен оставаться полностью погружен во все времена. Время в PC-солевой ванне должна быть ограничена примерно до 30 - 60 секунд, в качестве желточной оболочки начнет выпускать из фильтровальной бумаги. Тем не менее, чистка эмбриона должна быть выполнена очень тщательно, поскольку остатки желтка позже заслонять вид эмбриона. Во время стирки, никогда не направляйте поток из пипетки передачи непосредственно на эмбрион, но всегда в радиальном направлении от него. После удаления эмбриона из PC-солевого раствора, убедитесь, чтобы удерживать фильтровальную бумагу по горизонтали, чтобы свести к минимумунатяжение на зародышевых оболочек. Затем, стабилизировать зародыш со вторым фильтром бумажном носителе. После того, как второй носитель из фильтровальной бумаги помещают, не создавать каких-либо боковое натяжение, которое может сместить фильтровальной бумаги носителей относительно друг друга и разрывают эмбриональные мембраны. Когда сэндвич из фильтровальной бумаги приводится в культуральную среду, она должна также пересекает границу раздела воздух / жидкость только один раз, чтобы свести к минимуму напряжение на мембранах. Вторая пара колец из нержавеющей стали, используемых для стабилизации сэндвич фильтровальной бумаги сверху должны быть размещены очень медленно и без какого-либо давления, чтобы минимизировать сжатие эмбриональных мембран. Небольшие разрывы площади opaca эмбриона обычно заживают в течение первого часа культуры, но поврежденный эмбрион может и должен всегда быть заменен новым образцом до того, как слой масла пипеткой на верхней части культуральной среды.
Для изображения весь эмбрион или несколько образцов для фильмов покадровой высокого разрешения, микрофонroscope должен быть оснащен моторизованным ХУ стадии, управляемый программным обеспечением микроскопа. Это имеет решающее значение, чтобы иметь ху-ступенчатый ход с минимальной скоростью, чтобы избежать повреждения эмбрионов и волнении в культуральной среде и масла, что приведет к снижению качества изображения. Для приобретения покадровой фильмов, представленных здесь, моторизованный ху ступени двигался с скоростью приблизительно 1,75 мм / сек. В будущем, визуализация может быть дополнительно улучшена за счет первого этапа перемещения в нужное положение и приобретает изображение после короткого периода покоя, чтобы колебания и завихрения исчезают.
В качестве ограничения, потенциальные пользователи должны быть осведомлены относительно большим рабочим расстоянием (около 1 см), необходимых для этого способа культивирования, если прямой микроскоп без целей погружения используется. Это рабочее расстояние является результатом слоя среды и минерального масла в верхней части эмбриона. В 6 см чашку Петри, слой масла имеет Thicknesс приблизительно 1 - 1,5 мм, и эмбрион погружают приблизительно 4 мм в глубину в культуральной среде. В зависимости от диаметра объектива, верхний край 6 см чашки Петри может также ограничить доступ к эмбриону. Это можно было бы обойти, используя большее блюдо.
Рабочее расстояние от вершины может быть несколько снижена за счет минимизации толщины слоев жидкости. Кроме того, рабочее расстояние снизу может быть сведено к минимуму путем приведения эмбриона дальше вниз на дно чашки Петри и уменьшая толщину стеклянного окна стакана с подогревом. В то время как протокол был оптимизирован для работы с вертикально длиннее расстояние трансфокатора микроскопа, он может быть установлен на инвертированный микроскоп, а также. Будущие пользователи должны иметь в виду , что погружая зародыш слишком глубоко в культуральной среде может привести к O 2 проблемы - диффузии, хотя предварительные эксперименты позволяют предположить , что ограниченная диффузия не кажутся ProbЛем, до тех пор, как зародыш окружен достаточно большим резервуаром-культуральной среды и фильтровальную бумагу, зажатой не прижата к нижней части чашки Петри.
Другим ограничением является регулирование температуры. Регулируя температуру контроллера для стакана нагретой до 40 ° С, температура в среде уравновешивается до 37,5 ° C вокруг эмбрионов, когда среда покрыта минеральным маслом. Это показывает, что некоторое количество энергии теряется между дном стакана, где нагревательные элементы и датчик температуры расположены, и расположение эмбрионов. Регулирование температуры может быть оптимизировано путем перемещения датчика и перераспределении нагревательных элементов.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают финансовую поддержку от гранта ZonMw-VICI 918.11.635 (Нидерланды). Авторы хотели бы поблагодарить инструментальный цех Врийе Universiteit Амстердам за свои практические предложения и для изготовления компонентов установки и Ярно Voortman от Carl Zeiss Нидерландов за полезные советы по микроскопии. Marjolein Blaauboer была большая поддержка в критически комментируя несколько вариантов рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Millipore | Z00QSV0WW | |
| Duran laboratory bottles, with caps, 1 L | Sigma-Aldrich/Duran | Z305200-10EA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution A | |||
| NaCl | Merck Millipore | 1064041000 | |
| KCl | Merck Millipore | 1049361000 | |
| CaCl2·H2O | Merck Millipore | 1023821000 | |
| MgCl2·6H2O | Merck/Sigma-Aldrich | 13152-1KG-D | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution B | |||
| Na2HPO4·2H2O | Merck | 1065801000 | |
| NaH2PO4·2H2O | Merck | 1063420250 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 595 | Sigma-Aldrich | 10311611 | |
| Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130 W, wavelength 10.6 µm | Micro Lasersystems | ||
| Tork Extra Soft Facial Tissues | Tork | 140280 | |
| Latex gloves | Sigma-Aldrich | Z645613 | |
| EMDAMED | EMDA 300.131 | ||
| Transfer pipettes | Sigma-Aldrich | Z350613 | |
| VWR | WITG5.480.003 | ||
| Accu-jet pro Pipette Controller | BrandTech Scientific | 26332 | |
| Serological plastic pipettes, 25 ml | Sigma-Aldrich | CLS4251 | |
| Plastic document sleeves | |||
| Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40 | Fiem | ||
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Drost BV (Loosdrecht, NL) | ||
| 10 cm Tissue culture dishes | Sigma-Aldrich | P5731 | |
| Greiner Bio-one | 664160 | ||
| 6 cm Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| 50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes | Sigma-Aldrich | T2318 | |
| greiner bio-one | 227261 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel rings, custom-made | |||
| Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness | |||
| Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring | |||
| Nail scissors | |||
| Forceps, Dumont #5, Inox | Fine Science Tools , F.S.T. | 11251-20 | |
| Fine, really sharp scissors for cutting filter paper | VWR | 21-102 | |
| M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil | Sigma-Aldrich | CAS Number 8042-47-5 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar bottoms for EC culture | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 SIGMA | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microbead implantation | |||
| Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) | Polysciences, Inc. | 16905-1 | |
| Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30 mm | SEIRIN | type J, No.02, 0.12x30mm | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Temperature controlled beaker | |||
| RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M | Omega | RTD-850M | |
| Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M | Omega | HSRTD-3-100-A-1M | |
| Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 | Omega | EXTT-3CU-26S-50 | |
| 3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M | Omega | MTP-U-M | |
| Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P | Omega | KHLV-103/(10)-P | |
| Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC | Omega | CNi16D24-C4EIT-DC | |
| Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope setup | |||
| Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN | Carl Zeiss AG | 495010-0009-000 | |
| Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56 mm | Carl Zeiss AG | 435281-9100-000 | |
| Manual Rotary Control MARC | Carl Zeiss AG | 435604-0000-000 | |
| Transillumination top 450 mot | Carl Zeiss AG | 435500-9000-000 | |
| Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9020-000 | |
| Insert plate S, glass 237x157x3 mm (D) | Carl Zeiss AG | 435465-9053-000 | |
| Controller EMS 3 | Carl Zeiss AG | 435610-9010-000 | |
| System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss AG | 435611-9010-000 | |
| Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
| Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual | Carl Zeiss AG | 490004-0025-000 | |
| Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US | Carl Zeiss AG | 410373-0200-000 | |
| LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" | Carl Zeiss AG | 410350-2403-000 | not available anymore |
| ZEN pro 2012 Hardware License key | Carl Zeiss AG | 410135-1002-120 | not available anymore |
| ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410136-1045-110 | |
| ZEN module Z Stack | Carl Zeiss AG | 410136-0030-110 | |
| ZEN Module Tiles/ Positions | Carl Zeiss AG | 410136-1025-110 | |
| ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss AG | 410136-1031-110 | |
| ZEN Module Experiment Designer | Carl Zeiss AG | 410136-1022-110 | |
| ZEN Desk 2012 Hardware License Key | Carl Zeiss AG | 410135-1004-120 | not available anymore |
References
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).
- Rozbicki, E., et al. Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation. Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).
- Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. Neurulation: Coming to closure. Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).
- Schoenwolf, G. C., Sheard, P. Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker. Development. 105 (1), 17-25 (1989).
- Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. Towards a cellular and molecular understanding of neurulation. Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).
- Pourquié, O. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).
- Maenner, J. Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process. Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).
- Wittig, J. G., Münsterberg, A. The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).
- Layer, P. G., Alber, R. Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases. Development. 109 (3), 613-624 (1990).
- Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras. Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).
- Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
- Andermatt, I., Stoeckli, E. T. RNAi-based gene silencing in chicken brain development. Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).
- Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
- Endo, Y. Chick embryo culture and electroporation. Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
- Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In Ovo Live Imaging of Avian Embryos. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).
- Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells. Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).
- Auerbach, R., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).
- New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).
- Stern, C. D., Bachvarova, R. Early chick embryos in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).
- Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo. Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).
- Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture. Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).
- Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. Culturing of avian embryos for time-lapse imaging. Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).
- Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).
- Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods. Methods. 66 (3), 441-446 (2014).
- Pannett, C., Compton, A. The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice. Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).
- Carl Zeiss Microscopy. GmbH Software Guide ZEN 2 - The Tiles & Positions Module. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/9943124DA6FFBA5DC1257E9300412F8B/$FILE/ZEN2_Tiles_and_Positions_Module_Software_Guide.pdf (2015).
- Carl Zeiss Microscopy. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide. , V1.0 en, Available from: https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf (2014).
- Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Acquiring multidimensional images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/5D9162DBD5AF85DDC1257E35005A68A6/$FILE/ZEN_2-Acquiring_multidimensional_images.pdf (2014).
- Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Importing and exporting images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf (2014).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. Culture of Avian Embryos. Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).
