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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54636
Automatic Translation
*1, *1, 2
1Department of Orthopaedic Surgery, VU University Medical Center Amsterdam, MOVE Research Institute Amsterdam, 2Department of Anatomy, Embryology & Physiology, Academic Medical Center Amsterdam
* These authors contributed equally

Abstract

Aufgrund seiner Verfügbarkeit, niedrige Kosten, flache Geometrie und Transparenz hat die ex ovo Hühnerembryo ein großer Wirbeltiermodell für die Untersuchung von morphogenetischen Ereignisse geworden, wie gastrulation 2, Neurulation 3 bis 5, Somitogenese 6, Herz 7 Biegen, 8 und Gehirnbildung 9 bis 13, während der frühen Embryonalentwicklung. Schlüssel zum morphogenetischen Prozesse zu verstehen, ist sie durch Zeitraffer-Bildgebung dynamisch zu folgen. Der Erwerb von Zeitrafferfilme von Küken Embryonalentwicklung ex ovo hat für einen Inkubator entweder zu kurze Zeitfenster oder auf die Notwendigkeit begrenzt worden zu steuern Temperatur und Feuchtigkeit rund um den Embryo 14. Hier präsentieren wir eine neue Technik zur Kultur Hühnerembryonen ex ovo für hochauflösende Zeitraffer-Bildgebung Durchlichtmikroskopie verwendet wird . Das Tauchfilterpapier Sandwich ist eine Variante des gut etablierten Filterpapierträger technique (EC-Kultur) 1 und ermöglicht die Kultivierung von Hühnerembryonen , ohne die Notwendigkeit für eine Klimakammer. Der Embryo wird zwischen zwei identischen Filterpapierträgern eingeklemmt und gehalten wird vollständig in einer einfachen, temperaturgesteuerten Mediums durch eine Schicht aus leichtem Mineralöl bedeckt getaucht. Ausgehend von der Primitivstreifen Stufe (Hamburger-Hamilton Stufe 5, HH5) 15 bis mindestens 28-somite Stufe (HH16) 15, Embryonen können entweder mit ihren ventralen oder dorsalen Seite nach oben kultiviert werden. Dies ermöglicht die Erfassung von Zeitraffer-Filmen über 30 h der Embryonalentwicklung abdeckt. Repräsentative Zeitraffer-Frames und Filme werden gezeigt. Embryos werden verglichen morphologisch zu einem Embryo kultiviert in der Standard-EC-Kultur.

Das Tauchfilterpapier Sandwich bietet eine stabile Umgebung frühen dorsalen und ventralen morphogenetischen Prozesse zu untersuchen. Es ermöglicht auch die Live-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikromanipulationen, wie Mikrochirurgie, Perl- implantation, Mikroinjektion, Gen-Silencing, und Elektroporation und verfügt über ein großes Potenzial für laserbasierte Bildgebung mit Tauchziele kombiniert werden (einschließlich Lichtbogen-Mikroskopie).

Introduction

Embryonalentwicklung hat der Mensch seit Anbeginn der Geschichte fasziniert. Wie entwickeln sich die Struktur und Morphologie eines Embryos in einem solchen wohldefinierten räumlichen und zeitlichen Art und Weise? Der Hühnerembryo hat aus mehreren Gründen eine der klassischen Wirbeltiermodelle für Embryonalentwicklung werden: Es ist leicht verfügbar, kostengünstig, transparent in einem frühen Stadium, und zugänglich für experimentelle Manipulationen, da es außerhalb der Mutter entwickelt. Darüber hinaus hat es eine fast flache Geometrie während der frühen morphogenetischen Ereignisse, wie Herz und Gehirn Bildung, Gastrulation, Neurulation und Somitogenese 15.

Morphogenetische Prozesse kann am besten verstanden werden, wenn sie dynamisch, wie durch den Erwerb von Zeitraffer-Bilder untersucht werden. Der Hühnerembryo kann 16 in ovo sichtbar gemacht werden , aber mit schlechten Zugänglichkeit für experimentelle Manipulationen und eingeschränkte Sicht für die Übertragung der Lichtmikroskopie Bildgebung. Daher trennen19 oder als Explantatkulturen 1,20 - - 23 Al - Techniken wurden zur Kultur Hühnerembryonen ex ovo entweder ganz yolk Kultursysteme 13,17 vorgeschlagen. Ganz yolk Kultursystemen bleibt der Embryo auf der Oberseite des intakten Eidotter, und der gesamte Inhalt des Ei wird in einen anderen Behälter zur Inkubation überführt. Dieser Behälter kann ein Surrogat Eierschale 17, eine Petrischale 19, oder eine Hängematte aus Kunststoff Haftverpackungs 13,18 gemacht. Die Embryonen in ganzen Dotter Kulturen lassen sich ideal kultiviert werden bis zum Schlüpfen und zugänglich sind Mikromanipulationen. Diese Techniken sind besonders nützlich für die Untersuchung der Entwicklung von Embryonen nach der Initiierung der Blutzirkulation (was den Kontrast erhöht), während jüngere Embryos hart bleiben sichtbar zu machen. Diese frühen Embryonen können am besten abgebildet werden , wenn sie aus dem Eigelb ausgeschnitten werden und kultiviert , wie in vitro - Explantate. Die Explantate sind leicht zugänglich für Experimental-Manipulationen und benötigen weniger Platz für die Kultivierung. Seit vielen Jahren von Denis Neue Technik im Jahr 1955 Pionierarbeit geleistet und seine Variationen waren die goldenen Standards der Explantation Kultur Methoden für die Hühnerembryonen, wodurch der Embryo bei Zeitraffermikroskopie und mikro Interventionen 20,21 zugänglich zu machen. Trotz des großen Erfolges ist neu Technik relativ aufwendig und zeitraubend. Die blastoderm löst oft , wenn die Dotterhaut, die Durchführung der blastoderm, um einen Glasring gestreckt wird , um die richtige Spannung 1 zu erzielen. Darüber hinaus kann der Embryo nur mit seiner Bauchseite nach oben kultiviert werden. Der EC (Early - Küken) Kultur, eine neuere Technik , entwickelt von Chapman und Collignon 1, umgeht die Dehnung der Vitellinmembran durch einen Filterpapierträger mit einer zentralen Öffnung verwendet wird . Das Filterpapier wird an der Dotterhaut, wodurch seine natürliche Spannung gehalten wird , und umgibt den Embryo wie ein Bilderrahmen 1.Die Embryonen werden dann kultiviert auf einem Agar-Eiweiss Boden, in der Regel mit ihrer Bauchseite nach oben. Rückenseite nach oben Kultivierung scheint nur möglich , Embryonen bei HH8 15 und älter. Viele Gruppen haben die Filterpapierträger auf ihre Bedürfnisse, beispielsweise durch Ersetzen des Agar-Eiweiss Boden mit einem Träger aus chirurgischem Nahtfasern 24 oder einer Membran 25 beschichtet Kollagen angepasst. Oft Embryonen kultiviert mit Neue Technik oder mit dem EG - Kultur ausgesetzt sind, mit ihren dorsalen oder ventralen Boden - Luft - Sauerstoffdiffusion 1,20 zu erleichtern. Diese Explantatkulturen haben in einer befeuchteten Atmosphäre gehalten werden, die Verdampfung des Mediums zu vermeiden und den Embryo vor dem Austrocknen zu verhindern. Dies wird durch Inkubieren der Schale mit dem Explantat - Kultur in einem größeren Petrischale mit angefeuchtetem Tissue - Papier 1 gelöst. Der Erwerb von Zeitraffer-Bilder dieser Embryonen erfordert entweder die Verwendung eines klimakontrollierten Inkubator um das ganze Mikroskop oder ein TemperamentAture gesteuerten Behälter mit einem beheizten Deckel Kondensation in dem Lichtweg 14 zu verhindern. Hühnerembryonen können jedoch auch ex ovo entwickeln vollständig in Kulturmedium als Filterpapierkulturen 25, die zwischen einer Schicht aus schwerem Mineralöl und Eiweiss in Adaptionen von New sprühte 2,21 oder als gefaltete blastoderm Explantate in der "Cornish Pasty Kultur untergetaucht "23,26, ohne direkten Kontakt mit der Luft.

Das Tauchfilterpapier Sandwich ist eine neue Variante des Filterpapiers Trägertechnik. Durch frühere Wissen kombiniert Hühnerembryonen ex ovo auf das Züchten, macht es das Klima gesteuerten Inkubator und den beheizten Deckel entbehrlich. Der Embryo wird 24 zwischen zwei identischen (Laser-cut) Filterpapierträger sandwichartig angeordnet und kultiviert vollständig in einem einfachen Kulturmedium (Pannett Compton-saline 27,28 und dünnes Albumen in einem Verhältnis 3: 2) unter Wasser in einem Temperatur enthalten gesteuerter. Eine Schicht aus leichtem Mineralöl auf der Oberseite des Mediums Floating verhindert die Verdunstung 2,21 und minimiert den Wärmeverlust an die Umgebung. Der Boden des Behälters hat ein Glasfenster, und die ganze Einrichtung ist an einem aufrechten Arbeitsabstand Zoom-Mikroskop durchgeführt. Dieser Aufbau ermöglicht die Erfassung von hochauflösenden Hell- und Dunkelfeld Zeitrafferfilme von etwa 30 Stunden der embryonalen Entwicklung, die von der frühen Primitive Streak Stufe in die 28-somite Stufe (entspricht Hamburger Hamilton Stufen 5 bis 16, HH5-16 ) 15. Die Embryonen können genauso gut mit ihren ventralen oder dorsalen Seite nach oben kultiviert werden. Daher sind Embryonen zugänglich Beobachtung und Manipulation von ventralen (zB frühen Herz 7,8 und Somitogenese 6) und dorsalen (zB spät gastrulation 2, Neuralrohrschlusses 3. - 5. und frühen Gehirn 9 bis 13) Entwicklung. Der Tauchfilterpapier Sandwich provides eine einfache und stabile Umgebung für die Mikrochirurgie, Perl- Implantation, Mikroinjektion, Gen-Silencing und Elektroporation Studien. Seine Abbildungs ​​Potential kann durch die Verwendung laserbasierten Bildgebung (einschließlich Lichtbogen-Mikroskopie) und Tauchziele viel weiter vorangetrieben werden.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Niederlanden Tierversuche Act durchgeführt.

HINWEIS: Die untergetauchten Filterpapier Sandwich - Verfahren wird aus 1 geändert.

1. Abgetaucht Filterpapier Sandwich Vorbereitung

  1. Pannett-Compton (PC) -saline 27,28
    1. Vorbereitung Stammlösungen A (1 l ultrareines H 2 O, 121 g NaCl, 15,5 g KCl, 10,42 g CaCl 2 · H 2 O und 12,7 g MgCl 2 · 6H 2 O) und B (1 l ultrareines H 2 O, 2,365 g Na 2 HPO 4 · 2H 2 O und 0,188 g von NaH 2 PO 4 · 2H 2 O) in sauberen 1 l - Flaschen. Lagern Sie sie bei 4 ° C.
    2. Bereiten Sie 1 l PC-Salzlösung durch Mischen von 900 ml ultrareinem H 2 O mit 40 ml Stammlösung A und 60 ml der Stammlösung B (in dieser Reihenfolge Fällung zu vermeiden). Bereiten Sie PC-saline frisch from Stammlösungen A und B jede Woche.
      HINWEIS: Die Stammlösungen können bei 4 ° C mehrere Monate gelagert werden. Autoklavieren und / oder das Hinzufügen von Antibiotika oder Antimykotika sind nicht erforderlich.
  2. Die Inkubation von befruchteten Hühnereiern
    1. In einem befeuchteten Inkubator, die Eier legen auf ihrer Seite und brüten sie bei 37,5 ° C, bis sie das gewünschte Alter erreichen.
      Hinweis: Bewahren Eier nicht mehr als zwei Wochen (vorzugsweise bei 12 bis 15 ° C) vor dem Experiment, da die Schlüpffähigkeit deutlich sinken
  3. Filterpapier Träger (angepasst von 1)
    1. Falls vorhanden, verwenden Sie eine Laser-Schneidemaschine sanduhrförmigen Filterpapierträger aus dicken Filterpapier (28 mm x 22 mm) zu schneiden. Verjüngen sich die Breite in der Mitte von 22 mm auf 10,4 mm. Schnitten eine zentrale elliptische Öffnung (10,6 mm x 5,5 mm), mit der längeren Achse der Ellipse ausgerichtet parallel zu der größeren Seite des Filterpapierträger (1-M).
      1. Optional können Sie eine Kartonschablone mit den richtigen Dimensionen vorzubereiten und ihre Umrisse und der zentralen Öffnung zu dick Filterpapier mit einem Bleistift übertragen. Schneiden Sie den Filterpapierträger mit einer feinen Schere aus.
    2. Schneiden Sie zwei identische Filterpapierträger für jeden Embryo explantiert werden. Bereiten Sie zusätzliche Filterpapierträger als Backup, falls ein Embryo während der Explantation verloren geht.
  4. Temperaturgeregelten Ölbad (am Tag des Experiments)
    1. Legen Sie die temperaturgesteuerte Becher in der Mitte des motorisierten XY-Tisch des aufrechten Zoom-Mikroskop und verbinden Sie den Becher auf die Temperaturregler.
    2. Setzen Sie vier große Edelstahlringe (30 mm Außendurchmesser, 4 mm in der Höhe, 1,5 mm Wandstärke) in eine 6 cm Petrischale als Gewichte zu wirken und die Schale in der Mitte des temperaturgesteuerten Becher platzieren.
      HINWEIS: Diese Petrischale dient nur als Platzhalter das Öl leve einzustellenl.
    3. Füllen Sie den temperaturgesteuerten Becher mit 130 ml leichtem Mineralöl. Stellen Sie die Ölstand gegebenenfalls so, dass es etwa 3 mm unterhalb der Oberkante des Tellers 6 cm Petri endet.
    4. Entfernen Sie die 6 cm Petrischale aus dem temperaturgesteuerten Becher und die Temperatur auf 40 ° C.

2. Abgetaucht Filterpapier Sandwich Produktion

  1. Kulturmedium (am Tag des Experiments)
    1. Pour 30 ml PC-Salzlösung (1.1.1 bis 1.1.2 in Schritten hergestellt) in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Bereiten einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 30 ml PC-Kochsalzlösung gefüllt für alle zwei Embryonen explantiert werden.
    2. knacken Sie vorsichtig eine unbebrüteten Ei in eine 10 cm Petrischale.
    3. Ernte dünnen Eiklar durch eine Plastiktransferpipette an den Wänden der Petrischale zu bewegen und in dünnen Eiklar zu saugen. Sammle 30 ml dünnen Eiklars in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen für jeweils zwei Embryos explantiert werden. Achten Sie darauf, nur die t zu erhaltenHin Eiweiss.
      HINWEIS: In der Regel 3 bis 4 Eier, die Ernte von etwa 30 ml dünnen Eiklar ermöglichen.
    4. Gießen 20 ml dünnen Eiklars in jeden PC-Kochsalzlösung gefüllten 50 ml Zentrifugenröhrchen (wie in Schritt 2.1.1) hergestellt.
    5. Mischen Sie die PC-Kochsalzlösung mit dünnen Eiklar durch sanft die Rohre mehrmals umgekehrt wird. Lassen Sie es für einige Minuten absetzen und prüfen, ob die Mischung, die so genannte Kulturmedium von hier an, ist klar. Wenn das Kulturmedium nicht klar ist, bereiten Sie frisches PC-Kochsalzlösung aus der Stammlösung und ernten frisch dünnen Eiklar.
  2. Legen Sie zwei kleine Edelstahlringe (20 mm Außendurchmesser, 4 mm in der Höhe, 1,5 mm Wandstärke 6,5 mm Lücke im Ring) so weit wie möglich voneinander entfernt in einem frischen 6 cm Petrischale aus Kunststoff und füllen es mit 22 ml Kultur Medium unter Verwendung einer 25 ml Kunststoffpipette (1-H) (wie in den Schritten 1.4.1 bis 1.4.4) hergestellt. Stellen Sie sicher, dass Ablagerungen auf dem Medium angesammelt bleibt in dem Zentrifugenröhrchen.
  3. Entfernen Sie die Verschmutzungen or Blasen aus dem Medium eine Plastiktransferpipette.
  4. Füllen Sie eine 10 cm-Petrischale mit 75 ml PC-Salzlösung (im Schritt 2.15 verwendet werden).
  5. Entfernen Sie ein Ei aus dem Inkubator und lassen Sie es für 1 Minute auf der Bank auf seiner Seite ruhen der Embryo kommen an die Spitze des Eigelbs zu lassen.
  6. Knacken Sie vorsichtig das Ei in eine Petrischale (Abbildung 1-A). Genießen Sie die Kante eines Stückes von feinen Seidenpapier in den dicken Eiweiss und die blastoderm Zentrum durch Ziehen, falls erforderlich.
  7. Entfernen Sie die meisten der dünnen und dicken Eiweiss aus der Petrischale eine Plastiktransferpipette (mit der Spitze abgeschnitten, die Aufnahme der dicken Eiklars zu erleichtern).
  8. Erstellen Sie ein Fenster in den dicken Eiklars um den Embryo durch leichtes Abwischen der dicken Eiklars mit einem Stück Seidenpapier, bewegt sich weg von der Mitte (Abbildung 1-B) entfernt. Verhindern, dass das Seidenpapier von der Befestigung an der Vitellinmembran.
  9. Mit einer Pinzette, legen Sie vorsichtig mit einem Filterpapierträger auf der vitelline Membran um den Embryo, mit der längeren Achse der elliptischen Öffnung parallel zur Anterior-Posterior - Achse des Embryos (1-C).
  10. Pinch eine Spitze der Nagelschere durch die Dotterhaut nahe dem Filterpapierträger und schnell um den gesamten Filterpapierträger geschnitten (Abbildung 1-D).
  11. Mit einer Pinzette, Anheben der Filterpapierträger weg von dem Eigelb in einer schrägen Richtung parallel zur Anterior-Posterior - Achse des Embryos (1-E).
  12. Drehen Sie den Filterpapierträger um die Bauchseite des Embryos an der Spitze zu haben und tauchen Sie es in der PC-Kochsalzlösung. Tauchen die Filterpapierträger entlang der anterior-posterioren Achse des Embryos in einer schrägen Richtung.
  13. Befreien Sie sich von all dem Eigelb gebunden noch die Dotterhaut und die blastoderm indem Sie es vorsichtig mit PC-Kochsalzlösung aus einem Kunststoff Transferpipette Spülung. Halten Sie die Gesamtheit des Filterpapierträger auf ein unter Wasserll Zeiten (1-F).
  14. Entfernen der Filterpapierträger von der PC-saline entlang der anterior-posterioren Achse des Embryos in einer schrägen Richtung und erhalten von der überschüssigen Flüssigkeit zu befreien, indem der Rand des Filterpapierträger auf einem Seidenpapier Abtupfen.
  15. Halten Sie das Filterpapier horizontal, mit der Bauchseite des Embryos nach oben und legen Sie eine weitere Filterpapierträger auf dem ersten, ein zweites Paar mit einer Pinzette. Ihre Öffnungen sollten genau übereinstimmen, um dadurch zwischen sich den Embryo zwischen den beiden Lagen aus Filterpapier (1-G).
  16. Unmittelbar unterzutauchen den Filterpapierträger Sandwich in das Kulturmedium in einer schrägen Richtung entlang der Anterior-Posterior-Achse des Embryos. Legen Sie sie in den Bereich überspannt den Raum zwischen den beiden Stahlringen (Abbildung 1-H).
  17. Befestigen Sie das Filterpapier Sandwich von zwei auf der Oberseite des anderen zwei Stahlringe platzieren, um sicherzustellen, dass die Öffnung mit dem embryo bleibt vollständig freigelegt (Abbildung 1-I).
  18. Überprüfen Sie die mittlere Ebene und stellen Sie sicher, dass der obere Abstandshalter nur im Medium eingetaucht ist. Falls erforderlich, oder kleine Mengen von Medium zu entfernen.
  19. Legen Sie das Petrischale in der Mitte der temperaturgesteuerten Ölbad und stabilisieren die Schale seitlich drei große Edelstahlringe, indem (30 mm Außendurchmesser, 4 mm in der Höhe, 1,5 mm Wandstärke) neben dem Gericht im Öl . Stellen Sie sicher , dass die Stahlringe an den Seiten der Schale (Abbildung 1-J) berühren.
  20. Langsam pipettieren etwa 6 ml leichtem Mineralöl auf die Oberseite des Mediums mit einem Kunststofftransferpipette, so dass das Medium mit einer kontinuierlichen Schicht aus Mineralöl (1-K) bedeckt ist.
  21. Stellen Sie die Zeitraffer-Akquisition auf.
    HINWEIS: Die Abbildung der Embryonen als horizontale Panoramen von fünf überlappende Teilbilder (Fliesen) ermöglicht eine detaillierte Bildgebung (5X Objektiv), mit einer allgemeinen overview der Morphologie 29-30. Abbildungs Intervallen zwischen 3 und 10 min ermöglichen die detaillierte Verfolgung von morphologischen 31 ändert, und die Erfassung von kleinen z-Stapel (fünf zu sieben verschiedene Ebenen mit einem Abstand von 30 & mgr; m) kompensiert , ein Großteil der Verdickung und Drehen des Embryos 30 . (Siehe Abschnitt den Repräsentative Ergebnisse für detaillierte Informationen über die Bildaufnahme) Z-Ebenen mit dem höchsten Kontrast kann vor der weiteren Verarbeitung 32 von Einzelbildern in Zeitraffer-Filmen ausgewählt werden.

Abbildung 1
Abbildung 1: Die getauchten Filterpapier Sandwich einrichten. (A) Ein Ei wird in eine Petrischale geknackt. (B) Die meisten der dicken und dünnen Eiklar wird aus der Petrischale entfernt mit einer Plastiktransferpipette (nicht dargestellt). Dann wird ein Fenster in den dicken Eiweiss entsteht einum den Embryo durch leichtes Abwischen der dicken Eiklars mit einem Seidenpapier entfernt. (C) Ein Filterpapierträger ist um das Blastoderm auf der Oberseite des Dotters angeordnet. (D) Der Filterpapierträger wird geschnitten lose von der umgebenden Vitellinmembran und (E) von der Oberseite des Dotters entfernt. (F) Der verbleibende Dotter wird sorgfältig in einem PC-Solebad weggespült. (G) Der Embryo wird mit einem zweiten identischen Filterpapierträger eingelegt. (H) Das Filterpapier Sandwich wird in das Medium eingetaucht und positioniert auf zwei Metalledelstahlringe (Embryogegenüber dorsalen oder ventralen Seite nach oben). (I) Zwei Ringe stabilisieren das Sandwich von oben. (J) Die Petrischale den Embryo enthält , zu dem temperaturgeregelten Ölbad überführt wird. Edelstahlringe stabilisieren die Petrischale seitlich. (K) Das Kulturmedium wird mit einer Schicht Mineralöl bedeckt.(L) Schematische Darstellung des untergetauchten Filter - Sandwich. (M) Abmessungen der Filterpapierträger für das Tauchfilterpapier Sandwich verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Representative Results

Figur 2
Abbildung 2: Morphologische Vergleich von Embryonen in der EG - Kultur 1 und in Versenkte Filterpapier Sandwich Kultur. Ausgewählte Zeitraffer-Frames zeigen die Embryonen in 3 Stunden-Intervallen. Frames werden der Größe verändert sich einen Überblick über volle Embryo Morphologie zu geben. Die Embryonen wurden alters abgestimmt auf die 7-somite Stufe (HH9) 15. 0 h zeigt den Beginn jedes Experiments. Anterior ist immer links. Die Bilder wurden mit Dunkelfeldbeleuchtung erworben. (A) Embryo in der EG - Kultur 1, kultiviert Bauchseite nach oben auf einem Agar-Eiweiss Boden 1,33. Bilder hoher Qualität können erworben werden, da der Embryo in der z-Richtung beschränkt ist. (B und C) Zwei Embryonen kultiviert in dem untergetauchten Filterpapier Sandwich: (B) ventrale Seite nach oben und (C) Rückenseite nach oben.Embry in dem Filterpapier Sandwich entwickeln, ohne qualitative Unterschiede für 27 Stunden mindestens. Sie entwickeln funktionelle Blutzirkulation und Schädel- und Nackenbeuge und drehen erfolgreich. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Zeitraffer-Akquisition ist abhängig von der Mikroskopsystem zur Verfügung. In dieser Studie wurde eine lange Arbeitsabstand wurde aufrecht Zoom-Mikroskop verwendet. Der Zoomfaktor wurde auf 5X eingestellt. In Kombination mit dem 16 - facher Vergrößerung des Okulars führte dies zu 80X Gesamtvergrößerung, mit einer theoretischen Auflösung von 1,3 & mgr; m / Pixel (wie in der Mikroskop - Software angegeben) 30. Um das Feld-of-view erhöhen, Embryonen wurden als horizontale Panoramen von fünf Teilbilder (Fliesen) abgebildet. Daher wurde ein Fliesenbereich, bestehend aus fünf überlappenden Fliesen, 29 definiert. Diese Fliese Regionpositioniert wurde , um vollständig die elliptische Öffnung des Filterpapierträger in seiner horizontalen Ausdehnung (2B - 0 hr) abzudecken. Jede Kachel hatte eine Größe von 2.048 x 2.048 Pixel, Bedecken eines field-of-view von ca. 2,7 mm und Fliesen wurden mit einer Überlappung von 10% gewonnen, was zu einer Gesamtfeld-of-view von etwa 12 mm x 2,7 mm für das Panorama. Die motorisierte XY-Tisch bewegt relativ zu dem Ziel mit einer Geschwindigkeit von etwa 1,75 mm / sec zwischen Erfassung der getrennten Kacheln 29. Das Live-Bild wurde auf der vorderen präsomitischen Mesoderm konzentriert und die zuletzt gebildeten Somiten (der Forschungsschwerpunkt unserer Gruppe). Um sich für die Verdickung und Kräuseln der Embryonen in der z-Richtung, kleine z-Stapel (fünf zu sieben verschiedene Ebenen mit einem Abstand von 30 & mgr; m) zu kompensieren wurden zu jedem Zeitpunkt 30 erfasst. Diese wurden um die Brennebene der vorderen Spitze des präsomitischen Mesoderm ausgewählt. Die Dauer der Zeitraffer-ACQuisition wurde auf 50 h eingestellt, und Imaging - Intervallen von 3, 4 oder 10 Minuten wurden 31 ausgewählt. 10 Stunden und die z-Stapel um den neuen optimalen Fokusebene neu zu definieren - Die Qualität der Zeitraffer-Akquisition konnten alle 5 durch Refokussierung verbessert werden. Am Ende des Experiments wurde die gesamte Zeitreihe manuell bearbeitet, und Teilmengen der Bilder der z-Ebene mit dem besten Fokus enthielten , wurden erstellt und gespeichert in einen separaten Ordner 32. Diese Teilmengen der Bilder waren zeit genäht, um eine vollständige Zeit-Serie von Bildern mit optimalen Fokus erstellen. Die Fliesen jedes Bild dieser vollständigen Zeitreihen wurden genäht und miteinander verschmolzen , ohne Shading - Korrektur 30 und Zeitraffer-Rahmen wurden als JPEG-Bilder von 100% Größe und 95% Kompression 32 exportiert. Die Zeitraffer-Rahmen wurden als Bildsequenz in die professionelle Video-Editing-Software importiert. Die detaillierten 100% zoomt wurden stabilisiert, und der Gesamtkontrast wurde nach unserem Geschmack angepasst. Die Endzeit-Verfehlungen waren kodierend mit dem H.264-Codec und in MPEG-4-Container exportiert. Filme werden mit einer Bildrate von 15 Bildern / s (fps) und einer Auflösung von 1.920 x 1.080 Pixeln angezeigt.

Abbildung 2 zeigt einen Vergleich zwischen einem Embryo in der EG - Kultur 1 (2A) und zwei Embryonen in dem untergetauchten Filterpapier Sandwichkultur, von denen eines kultivierten Bauchseite nach oben (2B) und die andere Rückenseite nach oben (Abbildung 2C). Alle Embryonen wurden alters abgestimmt auf die sieben somite Stufe (HH9) 15 und mit einer zeitlichen Auflösung von 4 min (2A und B) oder 10 min (2C) abgebildet. Ausgewählte Rahmen von 3 Stunden Intervallen dargestellt. Die EG - Kultur (2A) erlaubt sehr stabile Bildgebung aufgrund der Embryo auf einem stabilen Agar-Eiweiss Boden 1,33 ruht. Der gesamte Embryo blieb in einer Fokusebene im gesamten ter ganze Zeitraffer. Dies könnte für kürzere Experimente (mehrere Stunden) und sehr frühen Embryonen von Vorteil sein, aber es wird mit einer starken Begrenzung des Embryos in der z-Richtung, möglicherweise seine erfolgreiche dreidimensionale Entwicklung langfristig zu behindern. Am Anfang führte die Confinement nur in einem geringen seitlichen Abflachung des Kopfes des Embryos im Vergleich zu einem Embryo kultiviert in dem untergetauchten Filterpapier - Sandwich mit seiner Bauchseite nach oben (2A und 2B bei 0 hr vergleichen). Später wurde die Drehung des Kopfes beeinträchtigt (2A - 21 h) und der Herzschlag verlangsamt. Die Blutzirkulation fast gestoppt. Siehe Supplemental Film 1 für den kompletten Zeitraffer des Embryos in der EG - Kultur. Die obere Platte in diesem Film zeigt einen vollständigen Überblick über den Embryo, während die Platte auf der unteren linken die Herzentwicklung in voller Auflösung visualisiert. Die Segmentierung des präsomitischen Mesoderm in Somiten kann sich seinen im Detail auf der unteren rechten Seite.

Embryos im Tauchfilterpapier-Sandwich, auf der anderen Seite, wurden nur durch die natürliche Spannung der Membranen umgeben sie in ihrer dreidimensionalen Ausdehnung begrenzt. Sie konnten kultiviert entweder mit ihren ventralen (2B) oder dorsalen Seite nach oben (Abbildung 2C) sein. So oder so, zeigten die Embryonen kontinuierlich Somitogenese, und ihre Köpfe gedreht. Sie entwickelten Schädel- und Nackenbeuge und funktionellen Blutzirkulation. Beide Embryonen in das Filterpapier Sandwich wurden mit dem Fokus auf das Segmentieren Mesoderm abgebildet, so dass Teile des Kopfes nach und nach aus dem Fokus bewegt, wie die Embryonen wuchsen, verdickt, und fing an zu drehen, während das Segmentieren Teil des Mesoderm im Fokus blieb (2B und 2C bei 21 h bis 27 h vergleichen). Supplemental Movie 2 zeigt die komplette Zeitraffer-Film des Embryos dargestelltin 2B. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Die obere Platte des Films zeigt einen vollständigen Überblick über den Embryo. Die Entwicklung des Embryos wurde nacheinander über 46 h abgebildet wird, aber nach etwa 30 Stunden, wurde der Fokus auf die Segmentierungs Mesoderm aufgrund der allgemeinen Verdickung und Drehen des embryonalen Gewebes verloren. Die untere linke Tafel zeigt die frühe Entwicklung des Herzens in voller Auflösung aus den akquirierten Zeitraffer Frames. Durch Fusion der paarigen Herz primordia auf beiden Seiten der Mittellinie wird eine nahezu gerade röhrenförmige Struktur gebildet, die auf der rechten Seite später beginnt Schlagen und Biegen. Die untere rechte Bild zeigt die zuletzt gebildeten Somiten und die vordere Spitze des präsomitischen Mesoderm in voller Auflösung und verfolgt die Bildung neuer Somiten im Laufe der Zeit. Supplemental Movie 3 zeigt eine andere Embryo kultiviert und Bauchseite nach oben in dem untergetauchten Filterpapier Sandwich abgebildet. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Der Film deckt the Entwicklung des Embryos von Stufe HH5-6 auf etwa Stufe 15 HH14, über etwa 27 h Kulturzeit. Der Kopf falten Formen und schreitet nach hinten. Die Herzformen von ihren bilateralen primordia, beginnt zu schlagen, und biegt nach rechts ab. Die ersten drei bis vier Somiten gleichzeitig bilden. Zusätzliche Somiten Knospe der Reihe nach von der vorderen Spitze des präsomitischen Mesoderm ab. Das untere Feld zeigt den Kopfbereich des Embryos in voller Auflösung, so dass die Beobachtung der Kopffalte und frühen Herzbildung in hoher Detailstufe. Aufgrund der Transparenz des Embryos kann der Verschluss des Neuralrohrs in Zukunft Kopfbereich zu beobachten. Supplemental Film 4 Displays somite Bildung im gleichen Embryo in voller Auflösung über den gesamten Belichtungszeit in der unteren Platte. Supplemental Film 5 zeigt den kompletten Zeitraffer des Embryos kultiviert dorsalen Seite nach oben (Abbildung 2C). Das Abbildungs ​​Intervall betrug 10 min. Während der upper Tafel zeigt die Entwicklung des Embryos von der sieben somite Stufe (HH9) auf etwa Stufe HH16-17 wird die untere Platte, die morphologischen Veränderungen in der frühen Gehirn in dieser Phase in voller Auflösung angezeigt werden abgeschnitten. Die lokale Schwellung des Neuralrohr beobachtet werden kann, auf die Regionalisierung des Vorderhirns, des Mittelhirns führt, und Rautenhirns, die in den fünf Teilbereiche des embryonalen Gehirn teilen , werden an 13 Stufen. Außerdem kann das Wachstum der Augenblasen deutlich zu erkennen. Nach etwa 30 Stunden in der Kultur, stirbt der Embryo.

Um die Kompatibilität des Tauchfilterpapier-Sandwich mit mikro Manipulationen mehrere Polystyrolmikrokügelchen (~ 40 & mgr; m im Durchmesser) zeigen, wurden in den oder in der Nähe des präsomitischen Mesoderm eines Hühnerembryo in dem untergetauchten Filterpapier Sandwichkultur implantiert. Die Mikrokügelchen wurden in PBS gewaschen Aufbewahrungspuffer zu entfernen und IMPLANted, bevor sie mit der Schicht aus leichtem Mineralöl das Kulturmedium zur Deckung (vergleiche 2.18 des Protokolls Abschnitt zu Schritt). Eine Glaspasteurpipette wurde verwendet, um die Perlen zu den Embryo Oberfläche zu übertragen, unter Beobachtung durch die Okulare des Mikroskops. Fünf Löcher wurden in der endoderm erstellt indem Sie es vorsichtig mit einer Akupunktur-Nadel Schaben. Eine maßgeschneiderte J-förmigen Werkzeug, geschaffen durch Strecken und ein Glas Pasteur Pipette in einer Flamme Biegen, wurde verwendet, um die Perlen zu manipulieren und schieben Sie sie vorsichtig in die Löcher, bis sie unbeweglich geworden ist. Drei Bohrungen wurden mit einem Wulst jeweils gefüllt (3A - 0 h und 3B *) und zwei Löcher mit zwei Perlen jeder (3A - 0 h). 3A zeigt, in ausgewählten Zeitraffer-Frames, die Entwicklung des Hühnerembryos nach der mikro Implantation der Perlen. Drei Perlen wurden erfolgreich in das Gewebe an der gewünschten Stelle eingebracht, und ihre Bewegung wurde über die abzubildendeVerlauf des Experiments in hoher Detailstufe (3B). Die Entwicklung des Embryos schien nicht durch die Manipulation oder das Vorhandensein der Kugeln beeinträchtigt. Siehe Supplemental Film 6 für die volle Zeitraffer-Film. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min.

Figur 3
Abbildung 3: Zeitraffer-Imaging nach Microbead Implantation. Proof-of-Prinzip Experiment, um die Kompatibilität des Tauchfilterpapier Sandwich mit Mikrobead Implantation zeigt. Der Kopf des Embryos ist auf der linken Seite, aber es wurde während dieses Experiments abgebildet. Die Bilder wurden mit Dunkelfeldbeleuchtung erworben. (A) Ausgewählte Zeitraffer-Frames der manipulierten Embryos in 3 Stunden Intervallen nach der Implantation von sieben Mikrokügelchen zeigt (~ 40 & mgr; m im Durchmesser). Der Embryo verlängert und kontinuierlich zusätzliche SOMIT gebildetes. Drei Perlen scheinen wurden ordnungsgemäß angebracht und medial mit dem Gewebe fließen über 18 Stunden der Kultur bewegt. Die anderen vier Perlen tauchte aus ihren Löchern zwischen 6 und 9 h der Kultur und posterior trieb. (B) Detailansicht der drei einzelnen Kügelchen (B1 bis B3) implantiert in die präsomitischen Mesoderm zu Beginn des Experiments (0 h, B *) und nach 12 Stunden Inkubation (B **). Die Anzahl der gerade bildenden Somiten angezeigt (S9 in B * und S18 in B **). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Film 1
Supplemental Film 1: EC-Kultur ventralen Seite nach oben. Embryo in der EG - Kultur 1, kultiviert Bauchseite nach oben, von der sieben somite Stufe (HH9) 15 weiter auf einem Agar-Eiweiss bottom 1,33. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Die relative Zeit wird in der linken oberen Ecke angezeigt. Qualitativ hochwertige Bilder konnten erworben werden, wie der Embryo in der z-Richtung beschränkt war. Nach 21 Stunden wurden die Herzschlag und den Blutfluss fast verhaftet und der Embryo zu zerfallen begonnen hatte. Das obere Feld zeigt eine Größe veränderte Überblick über den Embryo, während die unteren Platten der Herzentwicklung (linkes Bild) und Segmentierung des präsomitischen Mesoderm (rechtes Bild) in voller Auflösung (100% Zoom) zu visualisieren. (Rechtsklick zum Download).

Movie 2
Supplemental Movie 2: Abgetaucht Filterpapier Sandwich ventralen Seite nach oben. Embryo in dem untergetauchten Papier Sandwich kultiviert aus der sieben somite Stufe (HH9) 15 ab, ventralen side nach oben zeigt. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Die relative Zeit wird in der oberen linken Ecke in h und min angezeigt, nach 24 Stunden neu gestartet wird. Das obere Feld zeigt eine Größe veränderte Überblick über die Entwicklung des Embryos über 46 h, nacheinander. Die untere linke Tafel visualisiert frühen Herzentwicklung während der ersten 10 Stunden der Bildaufnahme in voller Auflösung (100% Zoom). Die untere rechte Tafel zeigt Segmentieren Mesoderm über ca. 30 h Entwicklung in voller Auflösung (100% Zoom) bis Fokus aufgrund der allgemeinen Verdickung und Drehen von embryonalem Gewebe verloren geht. (Rechtsklick zum Download).

Movie 3
Supplemental Movie 3: Kopf Faltenbildung. Embryo kultiviert Bauchseite nach oben in dem untergetauchten Filterpapier Sandwich aus der erAd-Prozess / Kopf-fach Stufe (HH5-6) 15 bis etwa dem 22 somite Stufe (HH14) 15 über etwa 27 h Kulturzeit. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Die relative Zeit wird in der oberen linken Ecke in h und min angezeigt, nach 24 h erneut gestartet wird. Das obere Feld zeigt eine Größe veränderte Überblick über die Entwicklung des Embryos. Das untere Feld zeigt den Kopfbereich des Embryos in voller Auflösung (100% Zoom). Die Bildung der Kopffalte und frühen Herz und die Schließung des Neuralrohrs beobachtet werden kann. (Rechtsklick zum Download).

Film 4
Supplemental Film 4: Somitogenese. Embryo kultiviert Bauchseite nach oben in dem untergetauchten Filterpapier Sandwich aus dem Kopf-Prozess / Kopf-fach Stufe (HH5-6) 15auf etwa die 22-somite Stufe (HH14) 15 über etwa 27 h Kulturzeit. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Die relative Zeit wird in der oberen linken Ecke in h und min angezeigt, nach 24 h erneut gestartet wird. Das obere Feld zeigt eine Größe veränderte Überblick über die Entwicklung des Embryos. Das untere Feld zeigt das Segmentieren paraxialen Mesoderm in voller Auflösung (100% Zoom). (Rechtsklick zum Download).

Film 5
Supplemental Film 5: Unterfilterpapier Sandwich dorsalen Seite nach oben. Embryo kultiviert dorsale Seite der sieben somite Stufe (HH9) 15 bis etwa zur HH16-17 Stufe 15 in dem untergetauchten Filterpapier Sandwich nach oben. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 10 min. Die relative Zeit angezeigt wirdin der linken oberen Ecke in h und min, einen Neustart nach 24 Stunden. Das obere Feld zeigt eine Größe veränderte Überblick über die Entwicklung des Embryos. Das untere Feld zeigt morphologische Veränderungen im frühen Gehirn in voller Auflösung (100% Zoom). Der Embryo starb nach etwa 30 Stunden in der Kultur. (Rechtsklick zum Download).

Film 6
Supplemental Film 6: Microbeads Implantierte. Embryo kultiviert Bauchseite für etwa 19 Stunden in dem untergetauchten Filterpapier Sandwich nach oben, von der neun somite Stufe beginnend (HH9-10) 15. Das Abbildungs ​​Intervall betrug 4 min. Die relative Zeit wird in der oberen linken Ecke in h und min angezeigt. Das obere Feld zeigt eine Größe veränderte Überblick über den Heckbereich mit sieben Mikrokügelchen in die pr implantiertesomitic Mesoderm. Das untere Feld zeigt den Bereich mit implantierten Mikrokügelchen in voller Auflösung (100% Zoom). (Rechtsklick zum Download).

Discussion

Als neue Variante des etablierten EG Kultur 1 erleichtert die untergetauchten Filterpapier Sandwich den Erwerb von langfristigen Hell- und Dunkelfeld Zeitrafferfilme der frühen Hühnerembryo ex ovo durch eine temperatur- und feuchtigkeitsgesteuerten Inkubator machen um das Mikroskop entbehrlich. Anstatt sich auf einem halbfesten agar-Eiweiss Boden kultiviert werden, werden die Embryonen gehalten vollständig in einem einfachen Kulturmedium eingetaucht, bestehend aus PC-Kochsalzlösung und dünnen Eiklar. Verdampfung und Wärmeverluste werden durch eine Schicht aus Mineralöl minimiert schwimmend auf dem Kulturmedium. Die Embryonen können leicht kultiviert werden, entweder Rücken- oder Bauchseite nach oben, ohne sichtbare Unterschiede in der Qualität. Wie hier gezeigt, Embryonen im Tauchfilterpapier Sandwich zugänglich sind mikro Interventionen, wie die Anwendung von Morphogen-getränkten Perlen. Zukünftige Anwendungen gehören Live-Fluoreszenz-Bildgebung, Mikroinjektionen und Elektroporation und Gen zu ma-Silencingnipulate und studieren ein breites Spektrum von morphogenetischen Ereignisse während der ventralen (zB frühe Herz und Somitogenese) und dorsalen (zB spät Gastrulation Neuralrohrschlusses und frühen Gehirn) Entwicklung. Eine zeitabhängige medikamentöse Behandlung ist möglich, wenn die Petrischale, die Filterpapier-Sandwich enthält, mit einer Perfusionskammer ersetzt wird, so dass der Austausch des Kulturmediums unter der Mineralölschicht. Das Tauchfilterpapier Sandwich wird seine volle Abbildungspotenzial in Kombination mit laserbasierten Bildgebung (einschließlich Lichtbogen-Mikroskopie) und Tauchziele zu entwickeln.

Einige Schwierigkeiten bei der Herstellung des Tauchfilterpapier-Sandwich wird in den nachfolgenden Absätzen behandelt. Obwohl es nur eine moderate Menge an Ausbildung benötigt, kann einen Embryo aus dem Eigelb in das Filterpapier Sandwich, mehrere Schritte, um die Qualität des Embryos in der Kultur beeinflussen immer noch deutlich zu übertragen. Vor der Filterpapierträgerplatziert auf den Dotter, sollte die Dotterhaut um den Embryo von irgendwelchen dicken Eiklars befreit werden. Erst dann wird die Verbindung zwischen dem Filterpapier und der Dottermembran stark genug sein, das Waschen in PC-Kochsalzlösung zu widerstehen. Das Filterpapier des Embryos verbunden sind, sollten Sie die Flüssigkeit / Luft-Grenzfläche so wenig wie möglich überqueren die Spannung auf den Membranen zu minimieren. Einmal zum Waschen in die PC-Kochsalzlösung gebracht wird, muss der gesamte Filterpapierträger jederzeit vollständig untergetaucht bleiben. Die Zeit, in der PC-Salzbad muss auf etwa 30 begrenzt - 60 sec, wenn die Dottermembran aus dem Filterpapier Freigabe beginnt. Dennoch sollte die Reinigung des Embryos sehr sorgfältig ausgeführt werden, wie Eigelb Reste später die Ansicht des Embryos verdunkeln. Während des Waschens, weisen niemals den Strom von der Transferpipette direkt auf den Embryo, sondern immer radial von ihr entfernt. Nach der Embryo aus der PC-Kochsalzlösung zu entfernen, stellen Sie sicher, dass das Filterpapier horizontal zu halten, zu minimierenSpannung auf den Eihüllen. Dann stabilisieren den Embryo mit dem zweiten Filterpapierträger. Sobald der zweite Filterpapierträger platziert ist, vermeiden jegliche seitliche Spannung zu schaffen, die die Filterpapierträger relativ zueinander und reißen die Eihüllen verschieben könnte. Wenn das Filterpapier-Sandwich in das Kulturmedium gebracht wird, sollte sie auch die Luft / Flüssigkeitsgrenzfläche kreuzen nur einmal Spannung auf die Membranen zu minimieren. Das zweite Paar von Edelstahlringe verwendet, um die Filterpapier-Sandwich von der Spitze zu stabilisieren, sollte sehr langsam gesetzt und ohne Druck Kompression der embryonalen Membranen zu minimieren. Kleine Brüche des Bereichs opaca des Embryos in der Regel während der ersten Stunde der Kultur heilen, aber ein beschädigter Embryo kann und sollte immer durch eine neue Probe ersetzt werden, bevor die Ölschicht oben auf dem Kulturmedium pipettiert.

Um das Bild ein ganzer Embryo oder mehrere Proben für hochauflösende Zeitraffer-Filme, die micROSCOPE muss mit einem motorisierten XY-Tisch ausgestattet sein, durch das Mikroskop Software gesteuert. Es ist von entscheidender Bedeutung, die xy-Bühne bewegen sich mit einer minimalen Geschwindigkeit zu haben Schäden an den Embryonen und Turbulenzen in dem Kulturmedium und das Öl zu vermeiden, was die Bildqualität verringert. Für den Erwerb der Zeitraffer-Filme, die hier dargestellt, bewegt die motorisierte XY-Tisch mit einer Geschwindigkeit von etwa 1,75 mm / sec. In Zukunft Bildgebung weiter, indem zuerst die Bühne in die gewünschte Position verbessert werden könnte und das Bild nach einer kurzen Ruhezeit zu erwerben Schwingungen und Turbulenzen ausklingen zu lassen.

Als Einschränkung sollten potenzielle Nutzer des relativ großen Arbeitsabstand bewusst sein (ca. 1 cm), die für dieses Kulturverfahren, wenn ein aufrechtes Mikroskop ohne Tauchziele verwendet wird. Diese Arbeitsabstand ergibt sich aus der Schicht des Mediums und von Mineralöl auf der Oberseite des Embryos. In der 6 cm Petrischale, hat die Ölschicht ein thickness von etwa 1 bis 1,5 mm, und der Embryo eingetaucht ist etwa 4 mm tief in das Kulturmedium. Je nach Durchmesser des Objektives, könnte die obere Kante der 6 cm-Petrischale auch Zugriff auf den Embryo begrenzen. Dies könnte durch die Verwendung eines größeren Gericht umgangen werden.

Der Arbeitsabstand von der Spitze leicht durch die Minimierung der Dicken der Flüssigkeitsschichten reduziert werden. Darüber hinaus könnte der Arbeitsabstand von unten, indem der Embryo weiter nach unten auf den Boden der Petrischale und die Verringerung der Dicke der Glasscheibe des erwärmten Becher minimiert werden. Während das Protokoll optimiert wurde mit einem aufrechten Arbeitsabstand Zoom-Mikroskop arbeiten, könnte es auch zu einem inversen Mikroskop angebracht werden. Künftige Nutzer sollten bedenken , dass zu tief in das Kulturmedium des Embryos Untertauchen könnte zu O 2 -Diffusion Problemen führen, wenn auch vorläufige Experimente deuten darauf hin , dass begrenzte Diffusion scheint kein prob seinlem, solange der Embryo von einem ausreichend großen Reservoir von Kulturmedium und das Filterpapier umgeben sandwichartig ist nicht auf den Boden der Petrischale gedrückt.

Eine weitere Einschränkung ist die Temperaturregelung. Durch Einstellen der Temperatur des Reglers für den erwärmten Becherglas auf 40 ° C, die Temperatur im Medium äquilibriert bis 37,5 ° C um die Embryonen, wenn das Medium mit Mineralöl bedeckt ist. Dies zeigt, dass ein Teil der Energie zwischen dem Boden des Bechers verloren geht, in dem die Heizelemente und der Temperatursensor angeordnet sind, und die Lage der Embryonen. Die Temperaturregelung kann durch die Verlagerung des Sensors und die Neuverteilung der Heizelemente optimiert werden.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung von einem ZonMW-VICI Zuschuss 918.11.635 (Niederlande). Die Autoren möchten sich das Werkzeug-Shop von der Vrije Universiteit Amsterdam für ihre praktische Vorschläge zu danken und für die Herstellung der Setup-Komponenten und Jarno Voortman von Carl Zeiss Niederlande für hilfreiche Ratschläge zum Mikroskopie. Marjolein Blaauboer war eine große Unterstützung bei kritisch auf mehrere Entwürfe des Manuskripts zu kommentieren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q Reference Water Purification System Millipore Z00QSV0WW 
Duran laboratory bottles, with caps, 1 L Sigma-Aldrich/Duran Z305200-10EA 
Name Company Catalog Number Comments
Solution A
NaCl Merck Millipore 1064041000
KCl Merck Millipore 1049361000
CaCl2·H2O Merck Millipore 1023821000
MgCl2·6H2O Merck/Sigma-Aldrich 13152-1KG-D 
Name Company Catalog Number Comments
Solution B
Na2HPO4·2H2O Merck 1065801000
NaH2PO4·2H2O Merck 1063420250
Name Company Catalog Number Comments
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 Sigma-Aldrich 10311611
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130 W, wavelength 10.6 µm Micro Lasersystems
Tork Extra Soft Facial Tissues Tork 140280
Latex gloves Sigma-Aldrich Z645613
EMDAMED EMDA 300.131
Transfer pipettes Sigma-Aldrich Z350613
VWR WITG5.480.003
Accu-jet pro Pipette Controller BrandTech Scientific 26332
Serological plastic pipettes, 25 ml Sigma-Aldrich CLS4251
Plastic document sleeves
Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40 Fiem
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 cm Tissue culture dishes Sigma-Aldrich P5731
Greiner Bio-one 664160
6 cm Petri dishes Sigma-Aldrich P5481
50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes Sigma-Aldrich T2318
greiner bio-one 227261
Name Company Catalog Number Comments
Stainless steel rings, custom-made
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring
Nail scissors
Forceps, Dumont #5, Inox Fine Science Tools , F.S.T. 11251-20
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper VWR 21-102
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil Sigma-Aldrich CAS Number 8042-47-5
Name Company Catalog Number Comments
Agar bottoms for EC culture
Agarose Sigma-Aldrich A9539 SIGMA
NaCl Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Name Company Catalog Number Comments
Microbead implantation
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) Polysciences, Inc. 16905-1
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30 mm SEIRIN  type J, No.02, 0.12x30mm
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 
Name Company Catalog Number Comments
Temperature controlled beaker
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M Omega RTD-850M
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M Omega HSRTD-3-100-A-1M
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 Omega EXTT-3CU-26S-50
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M Omega MTP-U-M
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P Omega KHLV-103/(10)-P
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC Omega CNi16D24-C4EIT-DC
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)
Name Company Catalog Number Comments
Microscope setup
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN Carl Zeiss AG 495010-0009-000
Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56 mm Carl Zeiss AG 435281-9100-000
Manual Rotary Control MARC Carl Zeiss AG 435604-0000-000
Transillumination top 450 mot Carl Zeiss AG 435500-9000-000
Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D) Carl Zeiss AG 435465-9020-000
Insert plate S, glass 237x157x3 mm (D) Carl Zeiss AG 435465-9053-000
Controller EMS 3 Carl Zeiss AG 435610-9010-000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss AG 435611-9010-000
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera Hamamatsu C11440-22CU
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual Carl Zeiss AG 490004-0025-000
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US Carl Zeiss AG 410373-0200-000
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" Carl Zeiss AG 410350-2403-000 not available anymore
ZEN pro 2012 Hardware License key Carl Zeiss AG 410135-1002-120 not available anymore
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key Carl Zeiss AG 410136-1045-110
ZEN module Z Stack Carl Zeiss AG 410136-0030-110
ZEN Module Tiles/ Positions Carl Zeiss AG 410136-1025-110
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss AG 410136-1031-110
ZEN Module Experiment Designer Carl Zeiss AG 410136-1022-110
ZEN Desk 2012 Hardware License Key Carl Zeiss AG 410135-1004-120 not available anymore

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References

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  32. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Importing and exporting images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf (2014).
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Entwicklungsbiologie Heft 118 Zeitraffer-Bildgebung Filterpapier Sandwich Hühnerembryo EC Kultur, Mikromanipulations Somitogenese Neurulation Herzentwicklung Hirnbildung
Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen
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Schmitz, M., Nelemans, B. K. A.,… More

Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (118), e54636, doi:10.3791/54636 (2016).

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