Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En neddykket Filter Paper Sandwich til Langsigtet Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54636
Automatic Translation
*1, *1, 2
1Department of Orthopaedic Surgery, VU University Medical Center Amsterdam, MOVE Research Institute Amsterdam, 2Department of Anatomy, Embryology & Physiology, Academic Medical Center Amsterdam
* These authors contributed equally

Abstract

På grund af dets tilgængelighed, lave omkostninger, flad geometri, og gennemsigtighed, ex ovo chick embryo er blevet en vigtig hvirveldyr model for studiet af morfogenetiske begivenheder, såsom gastrulation 2, neurulation 3 - 5, somitogenesis 6, hjerte bøjning 7, 8, og hjerne formation 9 - 13, under tidlig embryogenese. Nøglen til at forstå morfogenetiske processer er at følge dem dynamisk ved time-lapse billeddannelse. Købet af time-lapse film af chick embryogenese ex ovo har været begrænset til enten korte tidsvinduer eller til behovet for en inkubator for at styre temperatur og fugtighed omkring embryo 14. Her præsenteres en ny teknik til kultur kyllingefostre ex ovo til høj opløsning time-lapse billeddannelse ved hjælp transmitteret lysmikroskopi. Den neddykkede filtrerpapir sandwich er en variant af den veletablerede filterpapir carrier technique (EF-kultur) 1 og tillader dyrkning af kyllingefostre uden behov for et klimakammer. Embryoet er klemt inde mellem to identiske filtrerpapir bærere og holdes fuldt neddykket i en enkel, temperaturstyret medium dækket af et lag af let mineralolie. Begyndende fra primitivstriberne etape (Hamburger-Hamilton etape 5, HH5) 15 op til mindst den 28-somit trin (HH16) 15, kan embryoner dyrkes med enten deres bug- eller dorsale side op. Dette giver mulighed for erhvervelse af time-lapse film, der dækker omkring 30 timers af fosterudviklingen. Repræsentative time-lapse rammer og film vises. Embryoner sammenlignes morfologisk til et embryo dyrket i standard EF-kultur.

Den undersøiske filtrerpapir sandwich giver et stabilt miljø at studere tidlig dorsale og ventrale morfogenetiske processer. Det giver også mulighed for levende fluorescensafbildning og micromanipulations, såsom mikrokirurgi, bead implantation, mikroinjektion, gendæmpning og elektroporation, og har et stort potentiale til at blive kombineret med nedsænkning mål for laser-baserede imaging (herunder lys ark mikroskopi).

Introduction

Embryogenese har fascineret mennesket siden begyndelsen af ​​historien. Hvordan strukturen og morfologi af et embryo udvikle sig i sådan en veldefineret tidsmæssige og rumlige måde? Den chick embryo er blevet en af ​​de klassiske hvirveldyr modeller for embryogenese af flere grunde: Det er let tilgængelige, billige, gennemsigtige i sin vorden, og tilgængelige for eksperimentelle manipulationer, som det udvikler sig uden moderen. Desuden har den en næsten flad geometri i den tidlige morfogenetiske begivenheder, såsom hjerte og hjerne dannelse, gastrulation, neurulation, og somitogenesis 15.

Morfogenetiske processer kan forstås bedst, hvis de er undersøgt dynamisk, såsom gennem opkøb af time-lapse billeder. Den chick embryo kan visualiseres i ovo 16, men med dårlig tilgængelighed til forsøg manipulationer og begrænset synlighed for transmission lysmikroskopi billeddannelse. Derfor several teknikker er blevet foreslået til kultur chick embryoner ex ovo, enten i hele æggeblomme dyrkningssystemer 13,17 - 19 eller som eksplantatkulturer 1,20 - 23. I hele blommen dyrkningssystemer, embryonet forbliver på toppen af ​​den intakte blomme, og hele indholdet af ægget overføres til en anden beholder til inkubation. Denne beholder kan være et surrogat æg shell 17, en petriskål 19, eller en hængekøje fremstillet af plast plastfilm 13,18. Embryoner i hele æggeblomme kulturer kan ideelt set dyrkes indtil klækning og er tilgængelige for micromanipulations. Disse teknikker er særligt nyttige til at studere udviklingen af ​​embryoner efter indledningen af ​​blodcirkulationen (hvilket øger kontrasten), mens de yngre fostre forbliver svært at visualisere. Disse tidlige embryoer kan afbildes bedst, hvis de udskæres fra blommen og dyrkes som in vitro eksplantater. Eksplantaterne er let tilgængelige for eksperimental manipulationer og kræver mindre plads til dyrkning. I mange år, en teknik udviklet af Denis Nyt i 1955, og dens variationer var de gyldne standarder for eksplantatpartikler dyrkningsmetoder til chick embryoner, hvorved embryoet tilgængeligt for time-lapse mikroskopi og mikrokirurgiske indgreb 20,21. Trods sin store succes, New teknik er relativt krævende og tidskrævende. Blastoderm løsriver ofte når vitellinmembranen, der bærer blastoderm, strækkes omkring et glas ring for at opnå den rette spænding 1. Desuden kan embryoet kun dyrkes med sin ventrale side op. EF (Early Chick) kultur, en nyere teknik udviklet af Chapman og Collignon 1, omgår strækning af vitellinmembranen ved anvendelse af et filtrerpapir bærer med en central åbning. Filtrerpapiret tillægger vitellinmembranen, dermed sin naturlige spænding vedligeholde, og omgiver fosteret som en billedramme 1.Embryoner dyrkes derefter på en agar-æggehvidestof bund, normalt med deres ventrale side op. Dyrkning dorsale side op synes kun muligt for embryoner på HH8 15 og ældre. Mange grupper har tilpasset filtrerpapiret luftfartsselskab til deres behov, såsom ved at erstatte den agar-æggehvide bunden med en støtte lavet af kirurgisk sutur fibre 24 eller en kollagen coatet membran 25. Ofte er embryoner dyrket med New teknik eller med EF kultur eksponeret, med deres dorsale eller ventrale overflade til luft for at lette iltdiffusion 1,20. Disse eksplantatkulturer skal opbevares i en fugtig atmosfære for at undgå fordampning af medium og forhindre embryo tørrer ud. Dette opnås ved at inkubere skål med eksplantatet kultur i et større petriskål indeholdende fugtet tissuepapir 1. Købet af time-lapse billeder af disse embryoer kræver enten brug af et klima-kontrollerede inkubator omkring hele mikroskop eller et temperamentstemet-styret beholder med et opvarmet låg for at forhindre kondens i strålegangen 14. Imidlertid kan kyllingefostre også udvikle ex ovo helt neddykket i dyrkningsmedium som filterpapir kulturer 25, indlagt mellem et lag svær mineralolie og æggehvide i tilpasninger af New teknik 2,21, eller som foldede blastoderm eksplantater i "Cornish Pasty Culture "23,26, uden direkte kontakt med luften.

Den neddykkede filtrerpapir sandwich er en ny variant af filtrerpapiret carrier teknik. Ved at kombinere tidligere viden om dyrkning kyllingefostre ex ovo, det gør klimastyret inkubator og det opvarmede låg undværes. Embryoet er klemt inde mellem to identiske (laserskåret) filtrerpapir bærere 24 og dyrket fuldt nedsænket i en enkel dyrkningsmedium (Pannett-Compton saltvand 27,28 og tynde æggehvide i en 3: 2-forhold) i et temperaturstyret indeholdeis. Et lag af let mineralolie flyder oven på mediet forhindrer fordampning 2,21 og minimerer varmetab til omgivelserne. Bunden af ​​beholderen har et glas vindue, og hele opsætningen udføres på en opretstående lang arbejdsafstand zoom mikroskop. Denne opsætning giver mulighed for erhvervelse af høj opløsning lysfelt og Darkfield time-lapse film på omkring 30 timer af embryonale udvikling, lige fra den tidlige primitivstriberne fase til den 28 somit fase (svarende til Hamburger Hamilton iscenesætter 5-16, HH5-16 ) 15. Embryoner kan dyrkes lige godt med deres ventrale eller dorsale side op. Derfor embryoner er tilgængelige for observation og manipulation af ventrale (f.eks tidlig hjerte 7,8 og somitogenesis 6) og dorsal (fx sen gastrulation 2, neuralrøret lukning 3 - 5, og tidlig hjerne 9-13) udvikling. Den neddykkede filtrerpapir sandwich provides en enkel og stabilt klima for mikrokirurgi, perle implantation, mikroinjektion, gendæmpning, og elektroporation studier. Dens imaging potentiale kan skubbes meget længere ved hjælp af laser-baserede imaging (herunder lys ark mikroskopi) og nedsænkning mål.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med de nederlandske Forsøg med Animals Act.

BEMÆRK: nedsænket filtrerpapir sandwich metode er modificeret fra en.

1. Neddykket Filter Paper Sandwich Fremstilling

  1. Pannett-Compton (PC) -saline 27,28
    1. Forbered stamopløsninger A (1 l ultrarent H2O, 121 g NaCl, 15,5 g KCI, 10,42 g CaCl2 · H2O, og 12,7 g MgCl2 · 6H 2 O) og B (1 l ultrarent H2O, 2,365 g Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, og 0,188 g NaH 2 PO4 · 2H 2 O) i rene 1-liters flasker. Opbevare dem ved 4 ° C.
    2. Forbered 1 L PC-saltvand ved blanding 900 ml ultrarent H2O med 40 ml stamopløsning A og 60 ml stamopløsning B (i dette for at undgå udfældning). Forbered PC-saltvand frisk frabout stamopløsninger A og B hver uge.
      BEMÆRK: Stamopløsninger kan opbevares ved 4 ° C i flere måneder. Autoklavering og / eller ved tilsætning af antibiotika eller antimykotika er ikke nødvendige.
  2. Inkubation af befrugtede hønseæg
    1. I en befugtet inkubator, lægge æg på deres side og inkubere dem ved 37,5 ° C, indtil de når den ønskede alder.
      BEMÆRK: Opbevar æg ikke længere end to uger (helst ved 12-15 ° C), før eksperimentet, da udrugningsevne vil falde markant
  3. Filter papir luftfartsselskaber (tilpasset fra 1)
    1. Hvis det er tilgængeligt, skal du bruge en laser skære maskine til at skære timeglasformede filter papir luftfartsselskaber fra tykt filtrering papir (28 mm x 22 mm). Taper bredden i midten fra 22 mm til 10,4 mm. Skære en central elliptisk åbning (10,6 mm x 5,5 mm), med den længste akse af ellipsen orienteret parallelt med den større side af filterpapir bærer (Figur 1-M).
      1. Eventuelt udarbejde en pap stencil med de korrekte dimensioner og overføre dens omrids og af den centrale åbning til tykt filtrering papir ved hjælp af en blyant. Klip filtrerpapiret bærer under anvendelse af fine sakse.
    2. Skær to identiske filter paper bærere for hvert embryo skal eksplanteret. Forbered ekstra filter papir luftfartsselskaber som backup i tilfælde et foster bliver tabt under eksplantering.
  4. Temperaturstyret oliebad (på dagen for eksperimentet)
    1. Placer temperaturstyret bægerglas i centrum af den motoriserede xy-fase af den opretstående zoom mikroskop og tilslut bægeret til dets temperatur controller.
    2. Put fire store rustfrit stål ringe (30 mm ydre diameter, 4 mm i højden, 1,5 mm vægtykkelse) i en 6 cm petriskål til at fungere som vægte og placer fadet i midten af ​​temperaturregulerede bæger.
      BEMÆRK: Denne petriskål bare fungerer som en pladsholder for at justere olien level.
    3. Fyld temperaturstyret bægerglas med 130 ml let mineralolie. Juster oliestanden om nødvendigt, således at det ender ca. 3 mm under den øvre kant af den 6 cm petriskål.
    4. Fjern 6 cm petriskål fra temperaturregulerede bægerglas og indstille temperaturen til 40 ° C.

2. Neddykket Filter Paper Sandwich Produktion

  1. Dyrkningsmedium (på dagen for eksperimentet)
    1. Hæld 30 ml PC-saltvand (som fremstillet i trin 1.1.1 til 1.1.2) i en 50 ml centrifugerør. Der forberedes en 50 ml centrifugerør fyldt med 30 ml PC-saltvand for hver to embryoer eksplanteret.
    2. crack forsigtigt en ikke-inkuberede æg i en 10 cm petriskål.
    3. Harvest tynde æggehvide ved at bevæge en plastik overførsel pipette langs væggene i petriskålen og sutte i de tynde æggehvide. Collect 30 ml tynde æggehvide i et 50 ml centrifugerør for hver to embryoer eksplanteret. Sørg for at få kun thin æggehvide.
      BEMÆRK: Normalt 3 - 4 æg tillader høst af ca. 30 ml tynde æggehvide.
    4. Hæld 20 ml tynde æggehvide i alle PC-saltvand fyldt 50 ml centrifugerør (som fremstillet i trin 2.1.1).
    5. Bland PC-saltvand med de tynde æggehvide ved forsigtigt at vende rørene flere gange. Lad det nøjes med flere minutter, og se om blandingen, kaldet dyrkningsmedium herfra og fremefter, er klar. Hvis dyrkningsmediet er ikke klart, lav en frisk PC-saltvand fra stamopløsningen og høste friske tynde æggehvide.
  2. Placer to små rustfrit stål ringe (20 mm ydre diameter, 4 mm i højden, 1,5 mm vægtykkelse, 6,5 mm hul i ringen) så langt fra hinanden som muligt i en frisk 6 cm plast petriskål og fyld den med 22 ml kultur medium (som fremstillet i trin 1.4.1 til 1.4.4) under anvendelse af en 25 ml plastik pipette (Figur 1-H). Sørge for, at snavs samler sig på toppen af ​​mediet forbliver i centrifugerør.
  3. Fjern eventuelle rester oR bobler fra mediet ved hjælp af en plastik overførsel pipette.
  4. Fyld en 10 cm petriskål med 75 ml PC-saltvand (til anvendelse i trin 2.15).
  5. Fjern et æg fra inkubatoren og lad den hvile på bænken på siden i 1 minut for at lade embryo komme til toppen af ​​blommen.
  6. Crack forsigtigt ægget i en petriskål (Figur 1-A). Soak kanten af ​​et stykke fint silkepapir i den tykke æggehvide og centrere blastoderm ved at trække, hvis det er nødvendigt.
  7. Fjerne de fleste af de tynde og tykke æggehvide fra petriskålen ved anvendelse af en plast transfer pipette (med spidsen skåret af for at lette optagelsen af ​​de tykke æggehvide).
  8. Skabe et vindue i den tykke æggehvide omkring embryonet ved forsigtigt at tørre væk den tykke æggehvide med et stykke silkepapir, bevæger sig væk fra midten (Figur 1-B). Forhindre silkepapir fra knyttet til vitellinmembranen.
  9. Ved hjælp af en pincet, forsigtigt placere et filtrerpapir luftfartsselskab på vitelline membran omkring embryonet, med den længere akse af den elliptiske åbning parallelt med den anteriore-posteriore akse af embryonet (Figur 1-C).
  10. Knivspids en spids af neglesakse gennem vitellinmembranen tæt på filtrerpapiret bærer og hurtigt skæres omkring hele filterpapir bærer (Figur 1-D).
  11. Med en pincet, løft filtrerpapiret bærer væk fra blommen i en skrå retning parallelt med den anteriore-posteriore akse af embryonet (Figur 1-E).
  12. Vend filtrerpapir luftfartsselskab rundt for at få den ventrale side af embryo på toppen og nedsænkes det i PC-saltvand. Fordybe filtrerpapiret bærer langs den anteriore-posteriore akse af embryonet i en skrå retning.
  13. Slip af med alle blommen stadig sidder vitellinmembranen og blastoderm ved forsigtigt at skylle det med PC-saltvand fra en plastik overførsel pipette. Hold helhed af filtrerpapiret bærer neddykket ved enll gange (Figur 1-F).
  14. Fjern filteret papir luftfartsselskab fra PC-saltvand langs anterior-posterior akse af embryoet i en skrå retning og slippe af med den overskydende væske ved at duppe kanten af ​​filterpapir luftfartsselskab på en silkepapir.
  15. Hold filtrerpapir vandret, med den ventrale side af embryoen opad, og placere et andet filter papirbærer oven på den første, anvendelse af en anden pincet. Deres åbninger skal matche nøjagtigt, hvorved indlægning embryonet mellem de to lag filtrerpapir (Figur 1-G).
  16. nedsænkes straks filtrerpapiret carrier sandwich i dyrkningsmediet i en skrå retning langs den anteriore-posteriore-akse af embryonet. Det anbringes i området, der spænder over mellemrummet mellem de to stålringe (Figur 1-H).
  17. Fastgør filtrerpapir sandwich ved at placere yderligere to stålringe oven på de to andre, og sørg for at åbningen med embryo forbliver helt afdækket (Figur 1-I).
  18. Kontroller medium niveau, og sørg for, at den øverste spacer bare er nedsænket i mediet. Hvis det er nødvendigt, tilføje eller fjerne små mængder af medium.
  19. Læg forsigtigt petriskål i midten af ​​temperaturstyret oliebad og stabilisere fadet sideværts ved at placere tre store rustfrit stål ringe (30 mm ydre diameter, 4 mm i højden, 1,5 mm vægtykkelse) ved siden af ​​fadet i olien . Sørg for, at stålringe røre siderne af skålen (Figur 1-J).
  20. Pipette langsomt ca. 6 ml let mineralolie oven på mediet med en plastik overførsel pipette, således at mediet er dækket med et kontinuerligt lag af mineralsk olie (Figur 1-K).
  21. Opsætning købet time-lapse.
    BEMÆRK: Billedbehandling embryoner som vandrette panoramaer af fem overlappende sub-billeder (fliser) giver detaljeret imaging (5X mål), med en generel overview af morfologien 29-30. Imaging intervaller mellem 3 og 10 min muliggøre detaljeret sporing af morfologiske ændringer 31, og erhvervelse af små z-stakke (fem til syv forskellige planer med en afstand på 30 um) kompenserer for meget af fortykkelse og drejning af embryoet 30 . Z-fly med den højeste kontrast kan vælges før yderligere behandling 32 af enkelte frames i time-lapse film (se repræsentative resultater sektionen for detaljeret information om erhvervelse billede).

figur 1
Figur 1: Opsætning af Oversvømmet Filter Paper Sandwich. (A) Et æg er revnet i en petriskål. (B) De fleste af de tykke og tynde æggehvide fjernes fra petriskålen med en plast transfer pipette (ikke vist). Derefter et vindue i den tykke æggehvide skabt enrunde embryonet ved forsigtigt at tørre væk den tykke æggehvide med en serviet. (C) En filterpapir bærer er placeret rundt om blastoderm oven af blommen. (D) Den filterpapir bærer skæres løs fra den omgivende vitellinmembranen og (E) fjernes fra toppen af blommen. (F) De resterende æggeblomme er omhyggeligt skyllet væk i en PC-saltvand bad. (G) Embryoet klemt med en anden identisk filterpapir bærer. (H) Filteret papir sandwich er nedsænket i mediet og placeret på to metal rustfrit stål ringe (embryo vender ryg eller ventrale side op). (I) To ringe stabilisere sandwich fra toppen. (J) The petriskål indeholdende embryonet overføres til temperaturstyrede oliebad. Ringe af rustfrit stål stabilisere petriskålen sideværts. (K) Dyrkningsmediet er dækket med et lag af mineralsk olie.(L) Skematisk af den neddykkede filter sandwich. (M) Dimensioner af filtrerpapiret bærere, der anvendes til den neddykkede filtrerpapir sandwich. Klik her for at se en større version af dette tal.

Representative Results

Figur 2
Figur 2: Morfologisk Sammenligning mellem Fostre i EF Kultur 1 og i Submerged Filter Paper Sandwich Culture. Udvalgte time-lapse rammer viser embryoner ved 3 timers intervaller. Rammer er ændret til at give et overblik over fuld embryo morfologi. Embryoner blev aldersmatchning 7-somit trin (HH9) 15. 0 timer angiver starten på hvert eksperiment. Anterior er altid til venstre. Billeder blev erhvervet ved hjælp Darkfield belysning. (A) Embryo i EF kultur 1, dyrket ventrale side op på en agar-æggehvide bund 1,33. Billeder af høj kvalitet kan erhverves, da fosteret er begrænset i z-retningen. (B og C) To embryoner dyrket i neddykket filtrerpapir sandwich: (B) ventrale side op og (C) dorsale side op.Embryoner i filtrerpapiret sandwich udvikle sig uden kvalitative forskelle i mindst 27 timer. De udvikler funktionelle blodcirkulation og kraniel og livmoderhalskræft bøjning og drej med succes. Klik her for at se en større version af dette tal.

Time-lapse erhvervelsen afhænger mikroskopet system til rådighed. I denne undersøgelse, en lang arbejdsafstand, blev oprejst zoom mikroskop anvendes. Zoomfaktoren var sat til 5X. I kombination med 16X forstørrelse af okularet, resulterede dette i 80X total forstørrelse, med en teoretisk opløsning på 1,3 um / pixel (som angivet i mikroskopet software) 30. For at øge field-of-view, blev embryoer afbildet som vandrette panoramaer af fem sub-billeder (fliser). Derfor er en flise region, der består af fem overlappende fliser, blev defineret 29. Denne flise regionblev anbragt således, at fuldstændigt at dække den elliptiske åbning af filtrerpapiret bærer i sin horisontale forlængelse (figur 2B - 0 h). Hver flise havde en størrelse på 2.048 x 2.048 pixels, der dækker et felt-of-view på ca. 2,7 mm, og fliser blev anskaffet med et overlap på 10%, hvilket resulterer i total field-of-view på ca. 12 mm x 2,7 mm for panorama. Den motoriserede xy-fase bevæges i forhold til målet med en hastighed på ca. 1,75 mm / sek mellem erhvervelse af de separate fliser 29. Live-billedet var fokuseret på den forreste presomitic mesoderm og de senest dannede somitter (forskning fokus af vores gruppe). For at kompensere for fortykkelse og curling af embryoner i z-retningen, blev små z-stakke (fem til syv forskellige planer med en afstand på 30 um) erhverves på hver gang punkt 30. Disse blev udvalgt omkring brændplanet af den forreste spids af presomitic mesoderm. Varigheden af ​​time-lapse ACQuisition var sat til 50 timer, og billedbehandling intervaller på 3, 4 eller 10 min blev valgt 31. Kvaliteten af ​​købet time-lapse kunne forbedres ved at ændre fokus hver 5 - 10 timer og omdefinere z-stack omkring den nye optimale brændplanet. Ved slutningen af forsøget blev hele tidsserier redigeret manuelt, og delmængder af billeder med z-planet med den bedste fokus blev oprettet og gemt til en separat mappe 32. Disse delmængder af billederne var tid-syet til at skabe et komplet tid-serie af billeder med optimal fokus. Fliserne af hvert billede af denne komplette tidsserier blev syet og smeltet sammen uden skygge korrektion 30, og time-lapse frames blev eksporteret som JPEG-billeder af 100% størrelse og 95% kompression 32. De time-lapse frames blev importeret som et billede sekvens i professionel video-redigeringssoftware. De detaljerede 100% zoom blev stabiliseret, og den samlede kontrast blev indstillet til vores smag. De endelige tidspunkter bortfalder var indkoded med H.264 codec og eksporteret i MPEG-4 containere. Film, vises i billedhastighed på 15 billeder / sek (fps) og en opløsning på 1.920 x 1.080 pixels.

Figur 2 viser en sammenligning mellem et foster i EF kultur 1 (figur 2A) og to embryoner i den neddykkede filtrerpapir sandwich kultur, det ene er dyrket ventrale side op (figur 2B) og den anden dorsale opad (figur 2C). Alle embryoer var alders-matchede til syv somit trin (HH9) 15 og afbildet med en tidsmæssig opløsning på 4 min (figur 2A og B) eller 10 min (figur 2C). Udvalgte rammer af 3 timers intervaller er afbildet. EF kultur (figur 2A) gav meget stabile billeddannelse på grund af embryo hviler på et stabilt agar-æggehvidestof bottom 1,33. Hele embryo forblev i en brændplan hele than hele tiden-lapse. Dette kunne være en fordel for kortere eksperimenter (flere timer) og meget tidlige embryoner, men det sker med en stærk indespærring af embryoet i z-retningen, muligvis hindre dens vellykkede tredimensionale udvikling på lang sigt. I begyndelsen, indespærring medførte kun en let lateral udfladning af fosterets hoved i forhold til et foster dyrket i neddykket filtrerpapir sandwich med sin ventrale side op (sammenlign figur 2A og 2B ved 0 timer). Senere blev drejning af hovedet svækket (Figur 2A - 21 timer) og hjerteslag bremset. Blodcirkulationen stoppet næsten. Se Supplerende Movie 1 for den fuldstændige time-lapse af embryoet i EF-kultur. Den øverste panel i denne film viser en fuld oversigt af embryonet, mens panelet nederst til venstre visualiserer hjertet udviklingen i fuld opløsning. Den segmentering af presomitic mesoderm i somitter kan seen i detaljer på den nederste højre.

Embryoner i den neddykkede filtrerpapir sandwich, på den anden side, var begrænset i deres tredimensionale ekspansion kun af naturlige spænding af membranerne, der omgiver dem. De kunne dyrkes enten med deres ventrale (figur 2B) eller dorsale opad (figur 2C). Uanset hvad, viste embryoner kontinuerlig somitogenesis, og deres hoveder vendt. De udviklede kraniel og livmoderhalskræft bøjning og funktionel blodcirkulationen. Begge embryoner i filtrerpapiret sandwich blev afbildet med fokus på segmentering mesoderm, således at dele af hovedet gradvist flyttes ud af fokus som embryonerne voksede, fortykket, og begyndte at dreje, medens den segmentering del af mesoderm forblev i fokus (sammenlign figur 2B og 2C på 21 timer til 27 timer). Supplerende Movie 2 viser den komplette time-lapse film af embryoet afbildeti figur 2B. Den billeddannende interval var 4 min. Det øverste panel af denne film viser et fuldt overblik over embryoet. Udviklingen af ​​embryo blev afbildet fortløbende over 46 timer, men efter cirka 30 timer, fik fokus på segmentering mesoderm tabt på grund af den generelle fortykkelse og drejning af embryonale væv. Den nederste venstre panel viser den tidlige udvikling af hjertet i fuld opløsning fra de tilkøbte tid-lapse rammer. Gennem fusion af parrede cardiac primordier på begge sider af midterlinjen, er en næsten lige rørformet struktur dannet, som senere begynder at slå og bøjning til højre. Den nederste højre panel viser de mest nyligt dannede somitter og den forreste spids af presomitic mesoderm i fuld opløsning og sporer dannelsen af ​​nye somitter over tid. Supplerende Movie 3 viser en anden embryo dyrket og afbildes ventrale side op i neddykket filtrerpapir sandwich. Den billeddannende interval var 4 min. Filmen dækker the udvikling af embryo fra scenen HH5-6 til ca. iscenesætte HH14 15 over omtrent 27 timers kultur tid. Hovedet fold former og skrider bagtil. Hjertet formularer fra sin bilaterale primordier, begynder at slå, og bøjer til højre. De første tre til fire somitter dannes samtidigt. Yderligere somitter bud off sekventielt fra den forreste spids af presomitic mesoderm. Det nedre panel viser hovedområdet af embryoet i fuld opløsning, tillader observation af hovedet fold og tidlig hjerte-dannelse i høj detalje. På grund af gennemsigtigheden af ​​embryonet, kan observeres lukningen af ​​neuralrøret i fremtiden hoved region. Supplerende Movie 4 displays somite dannelse i samme embryo i fuld opløsning over hele billedbehandling tid i det nederste panel. Supplerende Movie 5 viser den komplette time-lapse af embryoet dyrkede dorsale side op (Figur 2C). Den billeddannende interval var 10 min. Mens uppER panel viser udviklingen af ​​embryo fra syv somit etape (HH9) til ca. fase HH16-17, er det nederste panel beskåret at vise morfologiske ændringer i den tidlige hjernen på dette tidspunkt i fuld opløsning. Kan observeres lokal hævelse af neuralrøret, hvilket fører til en regionalisering af forhjernen, midthjernen, og baghjerne, som vil opdele i de fem underregioner af embryonale hjernen på senere stadier 13. Derudover kan væksten af ​​de optiske vesikler ses tydeligt. Efter ca. 30 timer i kultur, er embryonet døende.

For at vise foreneligheden af ​​den neddykkede filtrerpapir sandwich med mikrokirurgiske manipulationer, flere polystyren mikrokugler (~ 40 um i diameter) blev implanteret i eller i nærheden af ​​presomitic mesoderm af en kylling embryo i neddykket filtrerpapir sandwich kultur. Mikroperlerne blev vasket i PBS for at fjerne opbevaringsbuffer og implanted før dække dyrkningsmediet med lag af let mineralsk olie (sammenlign til trin 2.18 i protokollen afsnit). Et glas Pasteur pipette blev anvendt til at overføre perlerne til embryonet overflade, under observation gennem okularerne af mikroskopet. Fem huller blev skabt i endoderm ved forsigtigt at skrabe det med en akupunktur nål. En specialfremstillet J-formet værktøj, skabt ved strækning og bøjning et glas Pasteur-pipette i en flamme, blev anvendt til at manipulere perlerne og skubbe dem omhyggeligt ind i hullerne, indtil de blev immobile. Tre huller blev fyldt med en perle hver (figur 3A - 0 timer og 3B *) og to huller med to perler hver (figur 3A - 0 HR). Figur 3A viser, i udvalgte time-lapse frames, udvikling af kyllingefosteret efter mikrokirurgisk implantation af perlerne. Tre perler lykkedes inkorporeret i vævet på det ønskede sted, og deres bevægelse blev afbildet overeksperimentets forløb i høj detalje (figur 3B). Udviklingen af ​​embryo tilsyneladende ikke hindres af den manipulation eller tilstedeværelsen af ​​perlerne. Se Supplerende Movie 6 til fuld tid-lapse film. Den billeddannende interval var 4 min.

Figur 3
Figur 3: Time-lapse Imaging efter mikroperle Implantation. Proof-of-principle eksperiment viser foreneligheden af ​​den neddykkede filtrerpapir sandwich med mikroperle implantation. Lederen af ​​fosteret er til venstre, men det var ikke afbildet under dette eksperiment. Billeder blev erhvervet ved hjælp Darkfield belysning. (A) Valgt time-lapse frames viser den manipulerede embryo på 3 timers intervaller efter implantation af syv mikroperler (~ 40 um i diameter). Embryoet aflang og kontinuerligt formede yderligere Somites. Tre perler synes at have været monteret korrekt og flyttede medialt med vævet flow over 18 timer af kultur. De andre fire perler dukkede ud af deres huller mellem 6 og 9 timer af kultur og gled posteriort. (B) Detaljeret visning af de tre enkelt perler (B1 til B3) implanteret i presomitic mesoderm ved begyndelsen af eksperimentet (0 timer, B *), og efter 12 timer inkubation (B **). Antallet af de netop danner somitter angives (S9 i B * og S18 i B **). Klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Supplerende Movie 1: EF-kultur ventrale side op. Embryo i EF kultur 1, dyrket ventrale side op, fra syv somit etape (HH9) 15 og frem på en agar-æggehvidestof bottom 1,33. Den billeddannende interval var 4 min. Den relative tid vises i øverste venstre hjørne. Billeder af høj kvalitet kunne erhverves, da fosteret var begrænset i z-retningen. Efter 21 timer blev hjerteslag og blodgennemstrømningen næsten anholdt og embryoet var begyndt at gå i opløsning. Det øverste panel viser en skalerede overblik over embryonet, mens de nederste paneler visualisere hjerte udvikling (venstre panel) og segmentering af presomitic mesoderm (højre panel) i fuld opløsning (100% zoom). (Højreklik for at downloade).

Movie 2
Supplerende Movie 2: Oversvømmet Filter Paper Sandwich ventrale side op. Embryo dyrket i neddykket papir sandwich fra syv somite etape (HH9) 15 fremefter, ventral side opad. Den billeddannende interval var 4 min. Den relative tid vises i det øverste venstre hjørne i hr og min, start efter 24 timer. Det øverste panel viser en skalerede overblik over udviklingen af ​​embryo over 46 timer, efter hinanden. Den nederste venstre panel visualiserer tidlig hjerte udvikling i løbet af de første 10 timer af erhvervelse billede i fuld opløsning (100% zoom). Den nederste højre panel afbilder segmentere mesoderm i løbet af ca. 30 timer af udviklingen i fuld opløsning (100% zoom), indtil fokus er tabt på grund af den samlede fortykkelse og drejning af embryonale væv. (Højreklik for at downloade).

Movie 3
Supplerende Movie 3: Leder Fold Formation. Embryo dyrket ventrale side op i neddykket filtrerpapir sandwich fra hanad-proces / head-fold etape (HH5-6) 15 til omtrent 22-somit stadie (HH14) 15 forhold omtrent 27 timers kultur tid. Den billeddannende interval var 4 min. Den relative tid vises i det øverste venstre hjørne i h og min, start efter 24 timer. Det øverste panel viser en skalerede overblik over udviklingen af ​​embryo. Det nederste panel viser hoved region af embryo i fuld opløsning (100% zoom). kan observeres dannelsen af ​​hovedet fold og tidlig hjerte og lukningen af ​​neuralrøret. (Højreklik for at downloade).

Movie 4
Supplerende Movie 4: Somitogenesis. Embryo dyrket ventrale side op i neddykket filtrerpapir sandwich fra hovedet-processen / head-fold trin (HH5-6) 15til omtrent 22-somit stadie (HH14) 15 forhold omtrent 27 timers kultur tid. Den billeddannende interval var 4 min. Den relative tid vises i det øverste venstre hjørne i h og min, start efter 24 timer. Det øverste panel viser en skalerede overblik over udviklingen af ​​embryo. Det nederste panel viser segmentere akseparallelle mesoderm i fuld opløsning (100% zoom). (Højreklik for at downloade).

Movie 5
Supplerende Movie 5: Oversvømmet Filter Paper Sandwich Dorsal Side Up. Embryo dyrket dorsale opad i neddykket filtrerpapir sandwich fra syv somit trin (HH9) 15 til omtrent HH16-17 stadium 15. Den billeddannende interval var 10 min. vises den relative tidi det øverste venstre hjørne i hr og min, start efter 24 timer. Det øverste panel viser en skalerede overblik over udviklingen af ​​embryo. Den nedre panel viser morfologiske ændringer i den tidlige hjernen i fuld opløsning (100% zoom). Embryoet døde efter ca. 30 timer i kultur. (Højreklik for at downloade).

Movie 6
Supplerende Movie 6: Microbeads implanteret. Embryo dyrket ventrale side op i neddykket filtrerpapir sandwich til ca. 19 timer, startende fra ni somit trin (HH9-10) 15. Den billeddannende interval var 4 min. Den relative tid vises i det øverste venstre hjørne i h og min. Den øvre panel viser en skalerede oversigt over halen region med syv mikroperler implanteret i presomitic mesoderm. Det nederste panel viser regionen med implanterede mikroperler i fuld opløsning (100% zoom). (Højreklik for at downloade).

Discussion

Som en ny variant af den veletablerede EF-kultur 1, den undersøiske filtrerpapir sandwich fremmer tilegnelsen af langsigtede lysfelt og mørkefelt time-lapse film af den tidlige chick embryo ex ovo ved at lave en temperatur- og luftfugtighed-kontrollerede inkubator rundt mikroskopet undværes. Snarere end at være dyrket på et halvfast agar-æggehvidestof bund, er embryonerne holdt fuldt neddykket i en enkel dyrkningsmedium bestående af PC-saltvand og tynde æggehvide. Inddampning og varmetab minimeres af et lag af mineralsk olie flydende på toppen af ​​dyrkningsmediet. Embryoner kan dyrkes let, enten dorsale eller ventrale side op, uden synlige forskelle i kvalitet. Som vist her, embryoner i den neddykkede filtrerpapir sandwich er tilgængelige for mikrokirurgiske indgreb, ligesom anvendelsen af ​​morfogen-gennemblødt perler. Fremtidige applikationer omfatter levende fluorescens billeddannelse, mikroinjektioner og elektroporation og gendæmpning til manipulate og studere en bred vifte af morfogenetiske hændelser under ventrale (fx tidlig hjerte og somitogenesis) og dorsal (fx sen gastrulation, neuralrøret lukning, og tidlig hjernen) udvikling. En tidsafhængig lægemiddelbehandling er mulig, hvis petriskålen indeholdende filtrerpapiret sandwich er erstattet med en perfusion kammer, hvilket tillader udvekslingen af ​​dyrkningsmediet under mineralolie lag. Den undersøiske filtrerpapir sandwich vil udvikle sit fulde billedbehandling potentiale i kombination med laser-baserede imaging (herunder lys ark mikroskopi) og nedsænkning mål.

Nogle problemer med udarbejdelsen af ​​den neddykkede filtrerpapir sandwich vil blive behandlet i de følgende afsnit. Selvom det kræver kun en moderat mængde træning til at overføre et embryon fra blommen i filtrerpapiret sandwich, kan flere trin stadig betydeligt påvirke kvaliteten af ​​embryoet i kultur. Før filterpapiret bærer eranbringes på blommen, bør vitellinmembranen omkring embryo blive befriet fra eventuelle tykke æggehvide. Først da vil forbindelsen mellem filterpapiret og vitellinmembranen være stærk nok til at modstå vask i PC-saltvand. Filterpapiret bærer embryo skal krydse væske / luft-grænsefladen så lidt som muligt for at minimere spændingen på membranerne. Når bragt ind i PC-saltvand til vask, skal hele filterpapir bærer forblive fuldstændig neddykket på alle tidspunkter. Tiden i PC-saltvand bad skal være begrænset til omkring 30 - 60 sek, som vitellinmembranen vil begynde at frigive fra filtrerpapiret. Alligevel bør rengøring af embryo udføres meget grundigt, da æggeblomme resterne senere vil forstyrre udsynet af embryoet. Under vask, aldrig peger strømmen fra overførselspipetten direkte på embryoet, men altid radialt væk fra det. Efter fjernelse af embryo fra PC-saltvand, skal du sørge for at holde filtrerpapiret vandret for at minimerespænding på de embryonale membraner. Derefter stabilisere embryo med det andet filter papir bærer. Når den anden filterpapir bærer er placeret, undgå at skabe lateral spænding, som kunne forskyde filtrerpapiret bærere i forhold til hinanden og rive embryonale membraner. Når filtrerpapir sandwich bringes i dyrkningsmediet, bør det også krydse luft / væske-grænsefladen én gang for at minimere spændingen på membranerne. Det andet par af ringe af rustfrit stål anvendes til stabilisering filtrerpapiret sandwich fra toppen skal placeres meget langsomt og uden pres for at minimere komprimering af embryonale membraner. Små bristninger i området opaca af embryoet sædvanligvis heler i den første time af kultur, men en beskadiget embryo kan og bør altid erstattes af en ny prøve før olielaget pipetteres ovenpå dyrkningsmediet.

Til billedet et helt embryo eller flere prøver til høj opløsning time-lapse film, mikrofonenroscope skal være udstyret med et motoriseret XY-scene, der kontrolleres af mikroskopet software. Det er af afgørende betydning at have xy-scenen farten med en minimal hastighed for at undgå skader på fostre og uro på dyrkningsmediet og olien, der vil falde billedkvaliteten. Ved køb af time-lapse film præsenteres her, den motoriserede xy-scenen flyttet med en hastighed på ca. 1,75 mm / sek. I fremtiden kunne imaging forbedres yderligere ved først at flytte scenen til den ønskede position og erhverve billedet efter en kort hvileperiode for at lade vibrationer og turbulenser blegne.

Som en begrænsning, bør potentielle brugere være opmærksomme på den relativt lange afstand (ca. 1 cm) er nødvendige til denne kultur metode, hvis der anvendes en opretstående mikroskop uden immersionsobjektiver. Denne arbejdsgruppe afstand resultater fra det lag af mellemstore og mineralsk olie på toppen af ​​embryoet. I 6 cm petriskål, olielaget har en thickness på ca. 1 - 1,5 mm, og embryoet er nedsænket ca. 4 mm dybt i dyrkningsmediet. Afhængigt af diameteren af ​​det formål, kunne den øvre kant af den 6 cm petriskål også begrænse adgangen til embryoet. Dette kunne omgås ved anvendelse af en større skål.

Arbejdsmiljøet afstanden fra toppen kunne blive reduceret en smule ved at minimere tykkelsen af ​​de flydende lag. Desuden kunne den arbejdsafstand nedefra minimeres ved at bringe embryo længere ned til bunden af ​​petriskålen og reducere tykkelsen af ​​glasset vindue af den opvarmede bægerglas. Mens protokollen blev optimeret til at virke med en opretstående lang arbejdsafstand zoom mikroskop, kunne det være forsynet med et inverteret mikroskop samt. Fremtidige brugere bør huske på, at nedsænke foster for dybt i dyrkningsmediet kan føre til O 2 -diffusion problemer, selvom indledende forsøg tyder på, at begrænset diffusion ikke synes at være en sandsynlighedlem, så længe embryoet er omgivet af en tilstrækkeligt-stort reservoir af dyrkningsmedium og filtrerpapiret klemt ikke trykkes til bunden af ​​petriskålen.

En anden begrænsning er den temperatur kontrol. Ved at justere temperaturen af ​​styreenhed til den opvarmede bægerglas til 40 ° C, temperaturen i mediet i ligevægt til 37,5 ° C omkring embryonerne når mediet er dækket med mineralsk olie. Dette viser, at noget energi går tabt mellem bunden af ​​bægerglasset, hvor varmelegemerne og temperaturføleren er placeret, og placeringen af ​​embryonerne. kontrol Temperaturen kan optimeres ved at flytte sensoren og omfordele varmelegemerne.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne for finansiel støtte fra en ZonMw-VICI tilskud 918.11.635 (Holland). Forfatterne vil gerne takke værktøj shop af Vrije Universiteit Amsterdam for deres praktiske forslag og til fremstilling setup komponenter og Jarno Voortman Carl Zeiss Nederlandene for nyttige råd om mikroskopi. Marjolein Blaauboer var en stor støtte i kritisk kommentere flere udkast af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q Reference Water Purification System Millipore Z00QSV0WW 
Duran laboratory bottles, with caps, 1 L Sigma-Aldrich/Duran Z305200-10EA 
Name Company Catalog Number Comments
Solution A
NaCl Merck Millipore 1064041000
KCl Merck Millipore 1049361000
CaCl2·H2O Merck Millipore 1023821000
MgCl2·6H2O Merck/Sigma-Aldrich 13152-1KG-D 
Name Company Catalog Number Comments
Solution B
Na2HPO4·2H2O Merck 1065801000
NaH2PO4·2H2O Merck 1063420250
Name Company Catalog Number Comments
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 Sigma-Aldrich 10311611
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130 W, wavelength 10.6 µm Micro Lasersystems
Tork Extra Soft Facial Tissues Tork 140280
Latex gloves Sigma-Aldrich Z645613
EMDAMED EMDA 300.131
Transfer pipettes Sigma-Aldrich Z350613
VWR WITG5.480.003
Accu-jet pro Pipette Controller BrandTech Scientific 26332
Serological plastic pipettes, 25 ml Sigma-Aldrich CLS4251
Plastic document sleeves
Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40 Fiem
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 cm Tissue culture dishes Sigma-Aldrich P5731
Greiner Bio-one 664160
6 cm Petri dishes Sigma-Aldrich P5481
50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes Sigma-Aldrich T2318
greiner bio-one 227261
Name Company Catalog Number Comments
Stainless steel rings, custom-made
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring
Nail scissors
Forceps, Dumont #5, Inox Fine Science Tools , F.S.T. 11251-20
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper VWR 21-102
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil Sigma-Aldrich CAS Number 8042-47-5
Name Company Catalog Number Comments
Agar bottoms for EC culture
Agarose Sigma-Aldrich A9539 SIGMA
NaCl Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Name Company Catalog Number Comments
Microbead implantation
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) Polysciences, Inc. 16905-1
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30 mm SEIRIN  type J, No.02, 0.12x30mm
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 
Name Company Catalog Number Comments
Temperature controlled beaker
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M Omega RTD-850M
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M Omega HSRTD-3-100-A-1M
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 Omega EXTT-3CU-26S-50
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M Omega MTP-U-M
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P Omega KHLV-103/(10)-P
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC Omega CNi16D24-C4EIT-DC
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)
Name Company Catalog Number Comments
Microscope setup
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN Carl Zeiss AG 495010-0009-000
Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56 mm Carl Zeiss AG 435281-9100-000
Manual Rotary Control MARC Carl Zeiss AG 435604-0000-000
Transillumination top 450 mot Carl Zeiss AG 435500-9000-000
Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D) Carl Zeiss AG 435465-9020-000
Insert plate S, glass 237x157x3 mm (D) Carl Zeiss AG 435465-9053-000
Controller EMS 3 Carl Zeiss AG 435610-9010-000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss AG 435611-9010-000
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera Hamamatsu C11440-22CU
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual Carl Zeiss AG 490004-0025-000
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US Carl Zeiss AG 410373-0200-000
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" Carl Zeiss AG 410350-2403-000 not available anymore
ZEN pro 2012 Hardware License key Carl Zeiss AG 410135-1002-120 not available anymore
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key Carl Zeiss AG 410136-1045-110
ZEN module Z Stack Carl Zeiss AG 410136-0030-110
ZEN Module Tiles/ Positions Carl Zeiss AG 410136-1025-110
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss AG 410136-1031-110
ZEN Module Experiment Designer Carl Zeiss AG 410136-1022-110
ZEN Desk 2012 Hardware License Key Carl Zeiss AG 410135-1004-120 not available anymore

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).
  2. Rozbicki, E., et al. Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation. Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).
  3. Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. Neurulation: Coming to closure. Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).
  4. Schoenwolf, G. C., Sheard, P. Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker. Development. 105 (1), 17-25 (1989).
  5. Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. Towards a cellular and molecular understanding of neurulation. Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).
  6. Pourquié, O. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).
  7. Maenner, J. Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process. Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).
  8. Wittig, J. G., Münsterberg, A. The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).
  9. Layer, P. G., Alber, R. Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases. Development. 109 (3), 613-624 (1990).
  10. Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras. Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).
  11. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  12. Andermatt, I., Stoeckli, E. T. RNAi-based gene silencing in chicken brain development. Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).
  13. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
  14. Endo, Y. Chick embryo culture and electroporation. Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  16. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In Ovo Live Imaging of Avian Embryos. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).
  17. Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells. Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).
  19. Auerbach, R., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).
  20. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).
  21. Stern, C. D., Bachvarova, R. Early chick embryos in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).
  22. Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo. Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).
  23. Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture. Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).
  24. Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. Culturing of avian embryos for time-lapse imaging. Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).
  25. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).
  26. Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods. Methods. 66 (3), 441-446 (2014).
  27. Pannett, C., Compton, A. The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice. Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).
  28. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).
  29. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Software Guide ZEN 2 - The Tiles & Positions Module. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/9943124DA6FFBA5DC1257E9300412F8B/$FILE/ZEN2_Tiles_and_Positions_Module_Software_Guide.pdf (2015).
  30. Carl Zeiss Microscopy. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide. , V1.0 en, Available from: https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf (2014).
  31. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Acquiring multidimensional images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/5D9162DBD5AF85DDC1257E35005A68A6/$FILE/ZEN_2-Acquiring_multidimensional_images.pdf (2014).
  32. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Importing and exporting images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf (2014).
  33. Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. Culture of Avian Embryos. Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).

Tags

Developmental Biology time-lapse billeddannelse filtrerpapir sandwich chick embryo EF kultur, Mikromanipuleringer somitogenesis neurulation hjerte udvikling hjerne dannelse
En neddykket Filter Paper Sandwich til Langsigtet<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse Imaging af Early Chick embryoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmitz, M., Nelemans, B. K. A.,… More

Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (118), e54636, doi:10.3791/54636 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter