Summary
interazioni proteina sono al centro della funzione di una cellula. tecniche calorimetriche e spettroscopiche sono comunemente usati per caratterizzare loro. Qui si descrive anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare l'interazione tra la proteina mutata nella sindrome di Shwachman-Diamond (SBDS) e il fattore di allungamento-simile 1 GTPase (EFL1).
Abstract
Le interazioni proteina-proteina svolgono un ruolo essenziale nella funzione di un organismo vivente. Una volta che l'interazione è stata identificata e convalidata è necessario caratterizzare al livello strutturale e meccanicistica. Esistono diversi metodi biochimici e biofisici per tale scopo. Tra questi, anisotropia di fluorescenza è una tecnica potente particolarmente utilizzata quando l'intensità di fluorescenza di una proteina fluoroforo marcato rimane costante mediante interazione proteina-proteina. In questa tecnica, una proteina fluoroforo marcato è eccitato con luce polarizzata verticalmente di opportuna lunghezza d'onda che eccita selettivamente un sottoinsieme dei fluorofori in base al loro orientamento rispetto al fascio in ingresso. L'emissione risultante ha anche una direzionalità cui rapporto in piani verticali e orizzontali definisce anisotropia (r) come segue: r = (I VV -I VH) / (I + 2I VV VH), dove Vv e
Introduction
Le cellule contengono una moltitudine di biomacromolecole che interagiscono costantemente con l'altro. Questa associazione dà luogo a complessi che partecipano alle vie cellulari responsabili per il loro funzionamento nella trasduzione del segnale, regolazione dell'espressione genica e la migrazione delle cellule, tra gli altri. Tutte le interazioni proteina-proteina che si verificano in una cella comprendono una rete nota come dell'interattoma. In Saccharomyces cerevisiae hanno dimostrato più del 70% delle proteine di avere partner interagenti 1. Comprendere la interattoma di una cella e le loro funzioni di fornire informazioni pertinenti sulla complessità e la diversità degli organismi viventi. Diverse metodologie sono state descritte per identificare e caratterizzare le interazioni proteina-proteina. Diverso alto attraverso metodi messi come il lievito doppio ibrido 2, saggi di complementazione proteine frammento 3, affinità di purificazione 4 accoppiata alla spettrometria di massa e microarra proteineys vengono utilizzati per identificare una interazione 5,6. Una volta identificato, è necessario convalidare e puo variare caso per caso. Tipicamente, questi esperimenti comportano interrompere stessa interazione a livello dei singoli membri della coppia interazione, ad esempio, dalla delezione gene o sovraespressione di una delle proteine, e quindi cerca di cambiamenti nelle proprietà o funzione di un altro membro del livello cellulare. Successivamente, tecniche biofisiche 7 sono utilizzati per caratterizzare l'interazione proteina-proteina a livello molecolare. A tal fine, la struttura di complessi proteici sono determinati mediante cristallografia a raggi X, risonanza magnetica nucleare e la microscopia crioelettronica mentre calorimetria e spettroscopia di fluorescenza sono utilizzati per descriverli quantitativamente e meccanicamente.
In questo lavoro, anisotropia di fluorescenza è stato utilizzato come tecnica per caratterizzare l'interazione tra la GTPasi EFL1 e SBDS proteine. Queste proteine partecipano nella sintesi dei ribosomi promuovendo il rilascio di fattore di inizio eucariotico 6 dalla superficie 60S ribosomiale subunità 8. La proteina SBDS è mutato in una malattia nota come Shwachman-Diamond Sindrome 9 e agisce come un fattore di scambio guanina nucleotide per EFL1 diminuendo la sua affinità per guanosindifosfato 10,11. mutazioni malattia in SBDS abolire l'interazione con EFL1 e quindi impediscono la sua attivazione.
Fluorescenza anisotropia è comunemente usato in applicazioni biologiche per studiare la proteina-peptide o interazioni degli acidi nucleici proteine. Si basa sul principio che un fluoroforo eccitato con risultati luce polarizzata in una emissione parzialmente polarizzata. Anisotropia di fluorescenza è definito dall'equazione 1:
dove ho vv e mi VH sono ilintensità di fluorescenza della verticale (VV) e in orizzontale (VH) polarizzati emissione quando il campione è eccitato con luce polarizzata verticalmente 12. Anisotropia di fluorescenza è sensibile a fattori che influenzano la velocità di diffusione rotazionale del fluoroforo e dipende dalla temperatura, la viscosità della soluzione e la dimensione molecolare apparente del fluoroforo così. La dimensione apparente di una proteina contenente un fluoroforo aumenta quando interagisce con un'altra proteina e tale modifica può essere valutato come un cambiamento di anisotropia. Più specificamente, un fluoroforo che ruota lentamente in soluzione rispetto alla sua durata fluorescente avrà un valore I VV e piccolo valore I VH e pertanto presentano una relativamente grande anisotropia. Per fluorofori che scendono rapidamente rispetto al loro ciclo di vita fluorescente, ho Vv e VH saranno simili e il loro valore anisotropia sarà piccolo 12 (Figura 1). Inoltre, per un buon segnale anisotropia di misura del rumore, è necessario avere un fluoroforo con una vita di fluorescenza simile al tempo di correlazione rotazionale della molecola di interesse. Altrimenti, non è possibile registrare accuratamente la differenza di anisotropia tra la proteina libero e che nel complesso. Ad esempio, l'anisotropia di una sonda fluorescente con una durata quasi 4 nsec come fluoresceina o rodamina collegati a un composto a basso peso molecolare di 100 Da è 0.05. Associazione a una molecola di 160 kDa aumenterà il suo valore anisotropia a 0,29; una differenza che può essere misurata con precisione. Al contrario, la stessa sonda fluorescente coinvolto in una reazione di legame cui incremento di peso molecolare varia da 65 a 1000 kDa comporterà solo un cambiamento anisotropia di 0,28 e 0,3, che è troppo piccola per essere misurata con precisione. In questo scenario, una sonda con una durata di 400 nanosecondi sarebbe più adatto 12.
Figura 1. Rappresentazione schematica delle apparecchiature utilizzate per misurare anisotropia di fluorescenza e la procedura. Rappresentazione schematica dell'attrezzatura utilizzata per eseguire una anisotropia di fluorescenza misurazione proteina-proteina interazione esperimento. Fluorofori che scendono visualizzazione rapida piccolo anisotropia che aumenta dopo il legame a un partner di interazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
applicazioni fluorescenza richiedono la presenza di un fluoroforo in una qualsiasi delle molecole studiate. Per studiare le interazioni proteina-proteina ci sono tre tipi di fluorofori: 1) i residui di triptofano presenti nelle proteine, 2) fluorofori allegate chimicamente e 3) partner di fusione fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP) e la sua Derivative. La maggior parte delle proteine hanno residui di triptofano sulla sua struttura, così il modo più semplice per misurare un'interazione è monitorando i cambiamenti nel corrispondente spettri di fluorescenza o monitorando i cambiamenti nell'intensità di fluorescenza dei residui di triptofano. Tuttavia, residui di triptofano possono essere presenti in entrambe le proteine complicare l'analisi. D'altra parte, per un fluoroforo per modificare le proprietà fluorescenti dovuto all'interazione deve essere situato sopra o vicino al sito di legame e potrebbe interferire con l'interazione stessa. Questo richiede particolare attenzione quando si utilizza fluorofori ingombranti come GFP. Se nessuno di questi fluorofori può essere utilizzato per studi di legame è necessario, quindi, di introdurre fluorofori estrinseci a una delle proteine coinvolte. Molti fluorofori sintetizzati chimicamente esistono e possono essere covalentemente attaccati alle proteine attraverso i loro gruppi reattivi come i gruppi amminici (catena laterale di lisine o N-terminale) ei gruppi tiolici in cisteina. Fderivati luorophore con isotiocianato e succinimidyl esteri reagiscono con gruppi ammidici mentre Iodoacetamide e maleimmide sono gruppi tiolo-reattivi 13. I coloranti più comuni utilizzati in applicazioni in fluorescenza sono derivati del fluoresceina ei coloranti verdi rodamina, cumarine, fluorofori BODIPY e coloranti Alexa Fluor. Un elenco dettagliato dei fluorofori disponibili in commercio e il loro uso può essere trovato in riferimenti 14,15. Per l'etichettatura di successo, il gruppo reattivo deve essere esposto sulla superficie della proteina, ma a causa del gran numero di gruppi funzionali reattivi tipicamente presenti in polipeptidi è molto difficile ottenere modificazioni sito-specifica. La proteina di interesse in questo studio, SBDS, contiene 5 cisteine libere e 33 lisine che possono provocare l'etichettatura più siti. l'etichettatura non uniforme può influenzare il legame e complicherà l'analisi dei dati come diverse molecole fluorofori possono suscitare diversi segnali di intensità fluorescente su vincolante. a Overcome questo problema, abbiamo usato il fluoroforo flash, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina all'etichetta sito-diretta la proteina SBDS. Questo è un colorante arsenoxide con alta affinità per quattro cisteine distanziati in un motivo conosciuto come FlAsH-tag costituito dalla CCXXCC sequenza in cui X è un qualsiasi amminoacido diverso cisteina 16,17. Questo motivo tetracysteine viene aggiunto N- o C-terminale della proteina mediante ingegneria genetica insieme ad un linker opportuno evitare l'interruzione della piega complessiva della proteina. La coppia che consiste di Flash tintura e Flash-tag è stato originariamente progettato per le proteine di etichette site-specific nelle cellule viventi 17, ma può anche essere usato per etichettare le proteine purificate in vitro come è esemplificato qui. Inoltre, sono stati sviluppati strategie enzimatici per consentire funzionalizzazione site-specific di proteine 18.
In questo manoscritto descriviamo l'utilità di anisotropia di fluorescenza unTool SA per studiare le interazioni proteina-proteina. Binding può essere valutata semplice ispezione della forma vincolante curva mentre le informazioni quantitative può essere ottenuta dalla misura dei dati sperimentali.
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Protocol
1. SBDS-Flash etichetta proteine Espressione e purificazione
NOTA: Per gli esperimenti di anisotropia, un flash-tag corrispondente alla sequenza Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys stato aggiunto al C-terminale delle SBDS umani sequenza codificante mediante PCR. Questo costrutto è stato subclonato nel vettore di espressione pRSET-A e trasformato in celle C41 Escherichia coli per esprimere una proteina che codifica per un tag hexahistidine N-terminale (His-tag), i SBDS umani codificante sequenza e un C-terminale Flash etichetta 10.
- Espressione della proteina SBDS-FLASH
- Trasforma competente E. cellule coli C41 con il plasmide pRSET-HisSBDS-flash utilizzando un protocollo standard shock termico 19. Piastra le cellule in mezzi solidi Luria-Bertani (LB) integrato con 100 mg / ml di ampicillina. LB composizione mezzi solidi consiste di 10 g di NaCl, 5 g di estratto di lievito, 10 g di triptone e 20 g di agar per il volume 1 L.
- Culture batteri trasformati a 37 ° C finoassorbanza a 600 nm (A 600) raggiunge 0,5-0,7 in 1 L di LB liquidi integrato con 100 ug / ml di ampicillina.
- Indurre l'espressione delle proteine con l'aggiunta di 0,5 mm isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside alla cultura e continuare l'incubazione per ulteriori 5 ore.
- Raccogliere sospensione batterica mediante centrifugazione a 3.800 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. A questo punto, sia immagazzinare il pellet cellulare a -20 ° C o utilizzare immediatamente per la purificazione della proteina.
- Purificazione della proteina SBDS-FLASH
NOTA: Tutti i passaggi cromatografici sono eseguite utilizzando un sistema di cromatografia liquida (FPLC) veloce proteina o una pompa peristaltica. Ni 2+ -affinity cromatografia utilizza una colonna flusso veloce 5 ml. Cromatografia a scambio anionico utilizza una forte colonna di scambio cationico solfopropil 5 ml. Un flusso di 3 ml / min è stato usato per tutti i passaggi cromatografici.- Risospendere le cellule in 35 ml di Lysis SBDS BUffer (50 mM tampone fosfato pH 7,5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo) supplementato con 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) e lisi mediante sonicazione per un tempo totale di 4 min con cicli di 10 secondi ON e 30 secondi OFF, a 4 ° C.
- Centrifugare il campione a 9000 xg per 50 min a 4 ° C.
- Tenere il surnatante e scartare il pellet per rimuovere i detriti cellulari.
- Equilibrare la colonna Ni 2+ affinità con 3 volumi di colonna (CV) di SBDS Lysis buffer e introdurre il tutto chiarito surnatante sulla colonna.
- Rimuovere la proteina non legato mediante lavaggio con 3 CV di SBDS Lysis buffer e eluire con 3 CV di tampone SBDS eluizione (50 mm tampone fosfato pH 7.5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo).
- Diluire la proteina 6-fold eluita con 50 mM di tampone fosfato pH 6,5 e rimuovere eventuali aggregati di filtrazione attraverso una membrana da 0,22 micron cellulosa.
- Equilibrare la colonna solfopropil cazione scambiatore con 3 CV di mancanza sale colonna Stampone (50 mM tampone fosfato pH 6,5, 50 mM NaCl) e introdurre il campione di proteine dal passaggio precedente.
- Lavare il materiale non legato con 3 CV di mancanza sale S buffer di colonna ed eluire la proteina in un unico passaggio con 50 mM tampone fosfato pH 6,5, 1 M NaCl.
- Diluire la proteina 3.3-fold eluita con tampone fosfato 50 mM pH 6.5. Concentrare la proteina con dispositivi di ultrafiltrazione per centrifugazione a 3.800 xg per 15 min. Flash congelare la proteina in azoto liquido e conservarlo a -80 ° C fino all'utilizzo.
- Verificare la purezza della proteina mediante analisi SDS-PAGE e colorazione Coomassie 20.
2. EFL1 espressione della proteina e purificazione
NOTA: EFL1 è stata espressa ai sensi del regolamento del Gal 1/10 promotore divergenti 21 e il Saccharomyces cerevisiae MAT A 3'UTR nel pRS426 vettore. La proteina ricombinante codifica il EFL1 isoforma umana 1 fuso ad un virus proteasi Tobacco Etch (TEV) sito di riconoscimento e un tag hexahistidine al C-terminale.
- Espressione della proteina EFL1
- Trasforma S. cellule cerevisiae BCY123 con il plasmide pRS426-EFL1TevHis usando una batteria agli standard di acetato di protocollo 22. Piatto tutte le cellule trasformate a goccia sintetica su supporti senza uracile (SD-URA) addizionato con 2% (w / v) di glucosio. Composizione dei media SD-URA consiste di 8 g base azotata di lievito senza amminoacidi, acidi Casamino 11 g, 55 mg adenina solfato, 55 mg tirosina, 60 mg e 60 mg leucina triptofano per volume di 1 L.
- Culture trasformato lievito a 30 ° C fino a 600 raggiunge 1,8 in 1 L di supporti SD-URA integrato con 0,5% (w / v) di glucosio.
- Indurre l'espressione della proteina aggiungendo 2,8% (w / v) galattosio alla cultura e continuare l'incubazione per ulteriori 18 ore a 30 ° C.
- Raccogliere la sospensione di lievito per centrifugazione a 3.800 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante.A questo punto, sia immagazzinare il pellet cellulare a -20 ° C o utilizzare immediatamente per la purificazione della proteina.
- Purificazione della proteina EFL1
NOTA: Tutti i passaggi cromatografici sono eseguite utilizzando un sistema FPLC o una pompa peristaltica. Ni 2+ -affinity cromatografia utilizza una colonna flusso veloce 5 ml ad un flusso di 3 ml / min. esclusione dimensioni cromatografia utilizza una colonna di 125 ml di pre-compresso con Superdex 200 in resina ad un flusso di 1 ml / min.- Risospendere le cellule in 50 ml di EFL1 Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo, 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo) supplementato con 1 mM PMSF e 1 mM benzamidine e disturbare le cellule attrito su un battitore tallone utilizzando perle di vetro (Ø = 0,5 mm) per un tempo totale di 6 min con cicli di 2 min oN e OFF 15 min, a 4 ° C.
- Centrifugare il campione a 9000 xg per 50 min a 4 ° C.
- Tenere il surnatante e scartare il pellet per rimuovere i detriti cellulari. Equilibrare la colonna affinità Ni 2+ con 3 CV di EFL1 Lysis buffer e inserire tutte le surnatante chiarificato sulla colonna.
- Rimuovere proteina non legata mediante lavaggio con 3 CV di EFL1 Lysis buffer ed eluire con 3 CV di tampone EFL1 eluizione (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo, 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo).
- Equilibrare la colonna esclusione dimensionale con 1,5 CV di tampone Anisotropia (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo, 5 mM β-mercaptoetanolo).
- Concentrato a 1 ml della proteina EFL1 eluito dalla colonna di affinità Ni 2+ con dispositivi di ultrafiltrazione per centrifugazione a 3.800 xg al volume desiderato. Introdurre il campione sulla colonna delle dimensioni dell'esclusione.
- Raccogliere la proteina eluita e concentrare per ultrafiltrazione ad una concentrazione finale di circa 30 micron. Flash congelare la proteina in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino all'utilizzo. Verifica °e la purezza della proteina mediante analisi SDS-PAGE e colorazione Coomassie 20.
3. Etichettatura di SBDS-flash con il flash colorante fluorescente 4 ', 5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina
- Mescolare 3 nmol della proteina SBDS-flash con 3 nmol di 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina in 5 volumi microlitri di tampone Anisotropia.
- Lasciate che la reazione di proseguire per 8 ore a 4 ° C. Dializzare il campione contro il buffer di anisotropia durante la notte per rimuovere il colorante libero.
- Utilizzare la legge di Lambert-Beer per quantificare la% di proteina marcata. Misurare l'assorbanza a 280 nm e 508 nm in uno spettrofotometro utilizzando una cuvetta di quarzo di volume adeguato. NOTA: Considerare i seguenti coefficienti di assorbimento molari (M -1 cm -1):
- Calcolare la concentrazione di proteina etichettata SBDS-flash utilizzando Equazione 2.
- Calcolare la concentrazione di proteine totali SBDS usando Equazione 3 sostituendo il calcolato C SBDS-Flash da precedente passaggio.
- Calcolare la percentuale di proteina marcata usando l'equazione 4.
4. Esperimenti anisotropia di fluorescenza
NOTA: esperimenti anisotropia sono state fatte in un spettrofluorimetro attrezzato con una collezione di polarizzazione strumenti e dati è stata effettuata utilizzando il programma anisotropia fornita nel software dell'apparecchio. La lunghezza d'onda di eccitazione è stata fissata a 494 nm con una banda spettrale di 8 nm e l'emissione è stato registrato utilizzando un filtro passa-banda di 530 ± 25 nm. Le misurazioni sono state effettuate a 25 ° C in una cuvetta 200 microlitri con un 5 mm di traiettoria 10.
- In una vaschetta di fluorescenza, mettere 200 ml di 30 nm SBDS-Flash nel buffer di anisotropia e titolare di 2 ml di 30 micron EFL1. Mescolare accuratamente e lasciar riposare la reazione per 3 minuti prima di misurare il valore di anisotropia.
- È stato aggiunto Ripetere il punto 4.1 fino ad un volume totale di 40 microlitri di EFL1.
Analisi 5. I dati
- Montare i dati al modello di rilegatura appropriato utilizzando un algoritmo non lineare almeno quadrati di regressione. Equazioni per i modelli di attacchi più comuni sono riportati in Tabella 1.
- Valutare il miglior modello che descrive l'interazione tra le proteine ispezionando residui della misura 23. Sostenere il modello scelto con ulteriori esperimenti.
Tabella 1. Modelli di legame interazioni proteina-proteina comune e le equazioni matematiche che li descrivono.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella. 
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Representative Results
Per eseguire qualsiasi esperimento anisotropia è importante escludere grandi variazioni dell'intensità di fluorescenza del fluoroforo poiché l'anisotropia osservata di una miscela di specie è rappresentata dall'equazione 5:
dove F i rappresenta la fluorescenza frazionata di ogni componente e r i è corrispondente anisotropia. La fluorescenza frazionata di ogni componente dipende sia, la sua concentrazione e la sua fluorescenza relativa, che è definito dall'equazione 6:
dove X i rappresenta la frazione molare di the i-esima specie e Ø i è la resa quantica della i esima specie.
Così, se l'intensità di fluorescenza cambia drasticamente lungo la titolazione è meglio, sia misurare la formazione del complesso in funzione della variazione del segnale di fluorescenza e non del segnale anisotropia, o correggere il valore anisotropia osservato inserendo sia l'intensità di fluorescenza e l'anisotropia dati. La fluorescenza di SBDS-flash non cambiamento non visibile dopo legame a EFL1 (Figura 2) suggerendo che anisotropia di fluorescenza è adeguata per misurare il legame tra le due proteine.
Figura 2. emissione di fluorescenza di SBDS-Flash Dalla titolazione di concentrazioni crescenti di EFL1. Le variazioni di emissione di fluorescenza del fluoroforo sono negligiblE e casuale lungo la titolazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Un esempio di curva ottenuta nella titolazione di EFL1 per SBDS-FlAsH impegnare la anisotropia di fluorescenza è mostrato in figura 3. Qualitativamente, la forma del grafico mostra chiaramente che le due proteine interagiscono come evidenziato da un aumento del segnale di anisotropia dopo l'aggiunta di EFL1. Inoltre, i valori di anisotropia raggiunto un plateau suggerendo che alla fine della titolazione tutte le proteine SBDS-FlAsH era presente in un complesso con EFL1. E 'possibile quindi, per descrivere quantitativamente l'interazione tra queste proteine e adattare i dati utilizzando i minimi quadrati non lineari di regressione a un modello vincolante presunta e ottenere il corrispondente di dissociazione costante di equilibrio. Montaggio di un modello di sito di legame non ha approtamente descrivere i dati sperimentali (Figura 3A). Questo è evidente non solo dalla traccia raccordo in curva vincolante, ma anche dalle deviazioni dei residui della misura (la differenza tra i dati teorici e sperimentali) che sono apprezzabili e non casuale. Questo concorda bene con il fatto che un unico modello dal sito di legame è descritto matematicamente da una curva iperbolica piuttosto che una curva sigmoidale come quello osservato per i dati sperimentali presentati in Figura 3. D'altra parte, modelli come due identici o due diversi vincolante siti descrivono meglio i dati sperimentali ei residui dello spettacolo in forma nessuna deviazione sistematica sostenere un'associazione modello a due sito (Figura 3B-C). In assenza di altre informazioni sperimentale è difficile stabilire quale dei due modelli corrispondono al meccanismo vincolante tra EFL1 e SBDS. Tuttavia, SBDS e EFL1 sono entrambe le proteine monomeriche, quindi è difficULT prevedere una siti di legame identico modello a due.
. Figura 3. Fluorescenza anisotropia isoterma vincolante dell'interazione tra EFL1 e SBDS-flash La linea continua in ciascuno dei lotti superiori corrisponde alla forma dei dati a diversi modelli di legame: (A) singolo sito, (B) due siti identici e (C) due siti non identici. Trame inferiori rappresentano i residui della forma per il modello corrispondente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Maggior parte degli esperimenti biochimici con proteine richiedono non solo proteina pura, ma anche grandi quantità di loro, indipendentemente dalla tecnica utilizzata. Per questo motivo, le proteine utilizzate per questo tipo di esperimenti sono ottenuti mediante espressione eterologa, come era il caso qui presentato. spettroscopia Florescence richiede la presenza di un fluoroforo nella molecola studiata. residui aromatici costituiscono i fluorofori intrinseci di una proteina, tuttavia, utilizzando il segnale per studiare le interazioni proteina-proteina complica l'analisi dal momento che sono comuni alla maggior parte delle proteine e sarebbe presente in entrambi, la proteina recettore e ligando. Inoltre, la durata del triptofano è troppo breve per gli esperimenti di fluorescenza di anisotropia. Per questo motivo, è comune aggiungere fluorofori estrinseci ad una delle proteine studiate. A tal fine, un fluoroforo stato aggiunto al C-terminale di SBDS tramite un legame di coordinazione tra il colorante 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluorescein con un motivo tetracysteine introdotto nella proteina con l'ingegneria genetica. La scelta del proteina che mette a nudo il fluoroforo non è una questione casuale. A causa delle dimensioni delle proteine studiate here (SBDS 29 kDa e EFL1 127 kDa), si prevede una variazione più grande in anisotropia tra libera etichettato-SBDS e che in complesso con EFL1, rispetto alla variazione prevista tra connessione etichettata-EFL1 e che legato a SBDS. Tenendo questo in mente, un tag flash era introdotto in SBDS piuttosto che EFL1. Un altro parametro importante da considerare quando si imposta un esperimento anisotropia di fluorescenza è l'assorbimento delle soluzioni utilizzate. La densità ottica della soluzione nella cella non deve essere superiore a 0,1 a eccitazione ed emissione di lunghezza d'onda, e deve rimanere costante lungo tutta la titolazione. In caso contrario, l'effetto filtro interno può interferire nella misurazione e deve essere corretta. Nell'esperimento qui presentata, le proteine studiate non assorbono alla lunghezza d'onda di excitationico o emissione del 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina; quindi effetto filtro interno non rappresenta un problema.
Per quanto riguarda la raccolta dei dati, e successivamente per adattarsi correttamente i dati, è necessario disporre di linee di base inferiore e superiore ben definiti con punti diversi di dati attraverso il passaggio lungo la curva di legame. In caso contrario, il montaggio dei dati è imprecisa e le informazioni riguardanti il modo di rilegatura può essere perso. Per descrivere una curva vincolante discreto è necessario che la concentrazione del legante libero differisce di due unità logaritmiche sotto e sopra la costante di dissociazione, tuttavia, sperimentalmente questo può essere difficile da raggiungere. Nel limite inferiore, problemi con la sensibilità dell'apparecchio possono verificarsi in particolare quando l'affinità tra le proteine è molto alta, mentre grandi concentrazioni non si possano ottenere a causa di problemi di solubilità del legante. Questo è stato chiaramente esemplificato quando si verifica l'interazione tra il SBDSS143L malattia mutante e EFL1. Questo mutante interrotto il legame EFL1 a tal punto che non era possibile avere una curva vincolante giusto dato EFL1 può essere concentrato solo fino a 70 mM e la proteina viene diluita ≈ 5 volte durante la titolazione 10. Quindi, è necessario avere una stima approssimativa dell'affinità per ottimizzare lo schema di titolazione e assicurarsi che salta in concentrazione ligando non si verificano in posizioni che causerebbe una misura meno accurata. Ad esempio, mancano i punti iniziale della curva vincolante presentata nella figura 3 farà sembrare un'iperbole indurre in errore il ricercatore verso un unico modello di sito di legame.
Una volta raccolti, i dati sono stati montati un modello vincolante presunta. In confronto a fluorescenza dei dati, i dati di anisotropia può essere utilizzato senza ulteriori manipolazioni e non hanno bisogno di correzione per gli effetti di diluizione. Le equazioni presentati nella tabella 1 ritengono che [L] ≈[L] 0 in ogni punto della titolazione. Questo non può accadere quando l'affinità tra le proteine è molto elevata tale che nei primi punti della deplezione di titolazione ligando verifica. In questo scenario, equazioni di secondo grado più complessi descritti altrove 23 sono necessari per adattarsi ai dati. Nell'esperimento descritto qui, il EFL1 ligando era sempre grande eccesso rispetto alla concentrazione di SBDS-Flash e la variazione della concentrazione EFL1 in ogni punto della titolazione può essere ignorato. Come discusso nella sezione dei risultati, un modello due siti non identico vincolanti meglio descritta i dati sperimentali (Figura 3C). Ulteriori informazioni biochimiche ottenute nel gruppo supporta l'idea che questo è il modello corretto per descrivere l'interazione tra EFL1 e SBDS (dati non mostrati). Questa modalità di interazione è comune nelle proteine multi-dominio, come ad esempio EFL1 e SBDS sono, ed esistono numerosi esempi in letteratura 24-26. Tuttavia, è unLSO importante per escludere una interazione non specifica che può apparire come un modello di interazione di diversi siti di legame con differenti affinità per il loro ligando. A tal fine, una trama Scatchard è molto utile. Rispetto ad altre tecniche, segnale di anisotropia di fluorescenza riporta la quantità di complesso formato e quindi è possibile costruire una trama Scatchard con i dati. Una curva convessa Scatchard suggerisce un modello di due diversi siti di legame con cooperatività negativa o legame non specifico, mentre una trama concava Scatchard implica un modello di due diversi siti di legame con cooperatività positiva o ligando instabilità (Figura 4). Analisi dei dati sperimentali hanno mostrato un diagramma Scatchard con una forma concava sostenere il modello di due siti di legame indipendenti per EFL1 e SBDS (Figura 4D). Inoltre, cooperatività positiva è stata confermata dopo l'esecuzione di un'analisi Hill che ha comportato un valore del coefficiente di Hill di 1,8 ± 0,02 (dati non riportati).
Figura 4. trame Scatchard per i modelli vincolanti diversa proteina-proteina. (A) sito singolo o più siti di legame identici che non interagiscono. (B) più siti di legame diversi con cooperatività negativa o legame non specifico. (C) più siti di legame diversi con cooperatività positiva o instabilità ligando. Plot (D) Scatchard risultante dall'analisi dei dati di anisotropia sperimentali ottenuti nella titolazione di EFL1 a SBDS-Flash. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Anisotropia di fluorescenza è una tecnica vera equilibrio soluzione basata che richiede le molecole studiate per rimanere in soluzione alle condizioni testate. Può essere usato per studiare non sullaly l'interazione tra le proteine integrali ma anche l'interazione tra i domini proteici, proteine mutanti o anche peptidi con modificazioni post-traduzionali. Inoltre, anisotropia di fluorescenza può anche essere usato per misurare il legame di proteine di membrane lipidiche utilizzando fluorescenti membrane sensibili sonde. Questo approccio è stato utilizzato con successo per studiare l'effetto che alfa-sinucleina ha sul confezionamento delle vescicole sinaptiche 27. Uno dei principali vantaggi di anisotropia di fluorescenza è che fornisce informazioni quantitative sul legame delle molecole studiate tali che le vere costanti di dissociazione può essere ottenuta insieme alle informazioni meccanicistica. Sebbene altre tecniche biofisiche possono anche essere utilizzati per ottenere tali informazioni, anisotropia di fluorescenza richiede piccole quantità di campione e può essere effettuata non solo in equilibrio, come presentato qui, ma anche utilizzando cinetica rapida, come fluorimetria stopped flow, per ottenere l'associazione e tasso di dissociazionecostanti (k on e off k rispettivamente) 28. Una tabella comparativa con i vantaggi e gli svantaggi di anisotropia di fluorescenza rispetto ad altre tecniche biofisiche è presentata nella Tabella 2. Tutti i metodi descritti sono tecniche true-equilibrio quanto nessuna di esse includono un processo di separazione meccanica delle frazioni libera e legata. Come menzionato nella sezione risultati, se l'intensità di fluorescenza di a-proteina marcata cambia in gran parte dalla interazione, questa struttura può quindi essere utilizzato per quantificare l'affinità del legame. Tuttavia, cambiamenti di intensità di fluorescenza risultante dall'interazione suggeriscono una possibile interferenza del fluoroforo estrinseca sull'interazione molecolare stessa; cioè una possibile alterazione del valore costante di dissociazione (Kd) delle corrispondenti proteine non etichettati. Come tale, anisotropia di fluorescenza può essere considerata una tecnica meno invasiva chAnges a fluorescenza in quanto la prima dovrebbe essere applicato quando l'intensità della fluorescenza non cambia in seguito all'interazione. In questo senso, se sono necessarie grandi quantità di proteina, Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) può fornire un vero valore K d dell'interazione molecolare poiché è un metodo libero etichetta. D'altra parte, le informazioni meccanicistica non è ottenuta perché differenze di calore solamente per l'entalpia del processo e non la quantità di complesso formato 29.
In confronto, metodi in vivo come saggi lievito doppio ibrido o un frammento di complementazione non richiedono proteine purificate ma forniscono solo informazioni semi-quantitativa sulla modalità di legame. Nonostante il fatto che nel lievito tecnica del doppio ibrido è possibile esprimere la forza delle unità utilizzando Miller vincolanti, questo non è un equilibrio reale costanti e molti fuori del controllo del ricercatore può cambiarlo.
Tabella 2. Vantaggi e svantaggi delle tecniche biofisiche utilizzate comunemente usati per studiare le interazioni proteina-proteina. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa tabella. 
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | Ultra pure |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | This kit contains the dye to label a FlAsH tag |
| Ampiciline | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Formedium | GLU03 | |
| D(+)-Galactose | Formedium | GAL03 | |
| L-Leucine | Formedium | DOC0157 | |
| L-Tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Sodium Chloride |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Magnesium Chloride |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Potassium phosphate dibasic |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Sodium phosphate monobasic |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Yeast extract | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Filtration units | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Membrane Filter | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain |
| Ni2+ affinity column | QIAGEN | 30760 | Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl cation exchanger column | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Size Exclusion column | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Fluorescence cell | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Spectrophotometer | Agilent Technologies | G6860AA | Cary 60 UV-Vis |
| Shaker | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Discontinued | FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction |
| Spectrofluorometer | Olis | No applicable | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
References
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