Summary
Proteininteraktioner är kärnan i en cell funktion. Kalorimetriska och spektroskopiska tekniker används ofta för att karakterisera dem. Här beskriver vi fluorescensanisotropi som ett verktyg för att studera interaktionen mellan proteinet muterat i Shwachman-Diamond syndrom (SBD) och förlängningsfaktor liknande ett GTPas (EFL1).
Abstract
Protein-proteininteraktioner spelar en viktig roll i funktionen av en levande organism. När en interaktion har identifierats och validerats är det nödvändigt att karakterisera det på strukturella och mekanistiska nivå. Flera biokemiska och biofysikaliska metoder finns för detta ändamål. Bland dem är fluorescensanisotropi en kraftfull teknik används i synnerhet när fluorescensintensiteten för en fluorofor-märkt protein förblir konstant vid protein-proteininteraktion. I denna teknik är en fluorofor-märkt protein exciteras med vertikalt polariserat ljus av en lämplig våglängd som selektivt exciterar en delmängd av fluoroforema enligt deras relativa orientering med den inkommande strålen. Den resulterande utsläpp har också en rikt vars förhållande i de vertikala och horisontella plan definierar anisotropi (r) enligt följande: r = (I VV -I VH) / (I VV + 2I VH), där jag vv och jag
Introduction
Celler innehåller en mångfald av biomakromolekyler som ständigt interagerar med varandra. Denna förening ger upphov till komplex som deltar i de cellulära vägar som ansvarar för deras funktion i signalöverföring, reglering av genuttryck och cell migration bland andra. Alla protein-proteininteraktioner som sker i en cell innefattar ett nätverk som kallas interactome. I Saccharomyces cerevisiae har visats mer än 70% av dess proteiner för att ha interagerande partners 1. Förstå interactome av en cell och deras funktioner ger relevant information på komplexiteten och mångfalden av levande organismer. Flera metoder har beskrivits för att identifiera och karakterisera protein-proteininteraktioner. Olika hög genomströmningshastighet metoder såsom jäst två-hybrid-2, proteinfragmentkompletteringsanalyser 3, affinitetsrening 4 kopplad till masspektrometri och protein microarrays används för att identifiera en interaktion 5,6. När detta har skett, är det nödvändigt att bekräfta det och kan variera från fall till fall. Normalt är dessa experiment involverar att störa interaktionen sig på samma nivå som de enskilda medlemmarna i samspelet paret, t ex genom gendeletion eller överuttryck av ett av proteinerna, och sedan letar efter förändringar i egenskaper eller funktion hos andra medlem på cellnivå. Därefter biofysiska tekniker 7 används för att karakterisera interaktion protein-protein på molekylnivå. För detta ändamål, är strukturen av proteinkomplex bestämdes genom röntgenkristallografi, kärnmagnetisk resonans och Cryo-elektronmikroskopi medan kalorimetri och fluorescensspektroskopi används för att kvantitativt och mekanistiskt beskriva dem.
I detta arbete, var fluorescensanisotropi används som en teknik för att karakterisera interaktionen mellan GTPas EFL1 och SBDS-proteinet. Dessa proteiner deltar i syntesen av ribosomer genom att främja frisättningen av eukaryota inledande faktor 6 från ytan av 60S ribosomala subenheten 8. Den SBD-protein är muterat i en sjukdom som är känd som den Shwachman-Diamond syndrom 9 och fungerar som en guaninnukleotidutbytesfaktor för EFL1 minska dess affinitet för Guanosindifosfat 10,11. Sjukdoms mutationer i SBD avskaffa interaktionen med EFL1 och därmed förhindra dess aktivering.
Fluorescensanisotropi används allmänt i biologiska tillämpningar för att studera protein-peptid eller protein-nukleinsyra-interaktioner. Den bygger på principen att en fluorofor exciteras med polariserat ljus resulterar i en delvis polariserad emission. Fluorescensanisotropi definieras av ekvation 1:
där jag Vv och jag VH ärfluorescensintensiteter av vertikalt (VV) och horisontellt (VH) polariserad emission när provet exciteras med vertikalt polariserat ljus 12. Fluorescensanisotropi är känslig för faktorer som påverkar graden av rotations diffusion av fluoroforen och sålunda beror på temperaturen, viskositeten hos lösningen och den synbara molekylstorleken av fluoroforen. Den skenbara storleken av ett protein innehållande en fluorofor ökar när det interagerar med ett annat protein och en sådan förändring kan därefter utvärderas som en ändring i anisotropi. Mer specifikt kommer en fluorofor som roterar långsamt i lösning i förhållande till dess fluorescerande livslängd har en stor jag VV värde och liten jag VH värde och därför kommer att uppvisa en relativt stor anisotropi. För fluoroforer som tumlar snabbt i förhållande till deras fluorescerande livstid, jag vv och jag VH kommer att likna och deras anisotropi värdet kommer att vara liten 12 (Figur 1). Dessutom, för en god anisotropi signalbrusmätning, är det nödvändigt att ha en fluorofor med en fluorescenslivstid liknar rotationskorrelationstiden av molekylen av intresse. Annars är det inte möjligt att på ett korrekt skillnaden i anisotropi mellan fritt protein och att i komplexet. Till exempel, är anisotropin hos en fluorescerande sond med en livstid nära 4 nsek såsom fluorescein eller rodamin bundna till en lågmolekylär förening med 100 Da 0,05. Bindning till en molekyl av 160 kDa kommer att öka sin anisotropi värde till 0,29; en skillnad som kan mätas noggrant. Däremot kommer samma fluorescerande prob involverad i en bindningsreaktion, vars ökning i molekylstorleken varierar från 65 till 1.000 kDa endast resultera i en anisotropi förändring av 0,28 till 0,3, vilket är för liten för att mätas noggrant. I detta scenario skulle en sond med en livslängd på 400 ns vara lämpligare 12.
Figur 1. Schematisk representation av den utrustning som används för att mäta fluorescens anisotropi och proceduren. Schematisk representation av den utrustning som används för att utföra en protein-proteininteraktion experiment mätning av fluorescens anisotropi. Fluoroforer som tumlar snabbt display liten anisotropi som ökar vid bindning till en interaktion partner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Fluorescensapplikationer kräver närvaro av en fluorofor i någon av molekylerna som studerats. För att studera protein-proteininteraktioner finns tre typer av fluoroforer: 1) de tryptofanrester närvarande i proteinerna, 2) kemiskt bundna fluoroforer och 3) fluorescerande fusionspartners såsom grönt fluorescerande protein (GFP) och dess Derivahavare. De flesta proteiner har tryptofanrester på dess struktur, således det enklaste sättet att mäta en interaktion är genom att övervaka förändringarna i den motsvarande fluorescensspektra eller genom övervakning av förändringar i fluorescensintensiteten hos de tryptofanrester. Emellertid kan tryptofangrupper vara närvarande i båda proteinerna komplicerar analysen. Å andra sidan, för en fluorofor att ändra sina fluorescerande egenskaper beroende på en interaktion den behöver för att vara placerad på eller i närheten av bindningsstället och det kan störa interaktionen självt. Detta kräver särskild uppmärksamhet vid användning av skrymmande fluoroforer såsom GFP. Om ingen av dessa fluoroforer kan användas för bindningsstudier är det nödvändigt, då att införa yttre fluoroforer till ett av de proteiner som är inblandade. Många kemiskt syntetiserade fluoroforer existerar och kan fästas kovalent till proteiner via deras reaktiva grupper såsom amingrupper (sidokedjan i lysiner eller N-terminalen) och tiolgrupperna i cystein. Fluorophore derivat med isotiocyanat och succinimidylestrar reagerar med amidgrupper medan jodacetamid och maleimid är tiol-reaktiva grupper 13. De vanligaste färgämnen som används i fluorescensapplikationer är derivat av fluorescein och rodamin gröna färgämnen, kumariner, BODIPY fluoroforer och Alexa Fluor färgämnen. En detaljerad lista över kommersiellt tillgängliga fluoroforer och deras användning kan hittas i referenser 14,15. För framgångsrik märkning, måste den reaktiva gruppen att exponeras på ytan av proteinet, men på grund av det stora antalet reaktiva funktionella grupper som vanligen är närvarande i polypeptider är det mycket svårt att få platsspecifik modifiering. Proteinet av intresse i denna studie, SBD innehåller 5 fria cysteiner och 33 lysiner som kan resultera i flera plats märkning. Icke-enhetlig märkning kan påverka bindningen och kommer att försvåra dataanalys som olika fluoroforen molekyler kan framkalla olika fluorescerande intensitetssignaler vid bindning. att overcome detta problem använde vi Flash fluorofor, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein till plats direkt etikett SBD-protein. Detta är en arsenoxide färgämne med en hög affinitet för fyra åtskilda cysteiner i ett motiv vet som Flash-tag som består av sekvensen CCXXCC där X är vilken aminosyra som helst annan än cystein 16,17. Denna tetracysteine motiv sättes till N- eller C-terminalen av proteinet med genteknik tillsammans med en lämplig linker för att förhindra störningar av den totala vikningen av proteinet. Paret som består av flash-färgämne och FLASH-tagg var ursprungligen avsedd att platsspecifika etikett proteiner i levande celler 17 men det kan också användas för att märka renade proteiner in vitro såsom den exemplifieras här. Dessutom har enzymatiska strategier också utvecklats för att göra det möjligt för platsspecifik funktionalisering av proteiner 18.
I detta manuskript beskriver vi nyttan av fluorescens anisotropi ensa verktyg för att studera protein-proteininteraktioner. kan bedömas genom enkel inspektion av bindande kurvform bindande medan kvantitativ information kan erhållas från passningen av experimentella data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SBD-Flash tagg Protein Expression and Purification
OBS: För anisotropin experimenten, en flash-taggen som överensstämmer med sekvensen Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys sattes till C-änden av de humana SBD-kodande sekvensen genom PCR. Denna konstruktion subklonades in i expressionsvektorn pRSET-A och transformerades in i Escherichia coli-C41-celler för att uttrycka ett protein som kodar för en N-terminal hexahistidin-tagg (His-tag), de humana SBD-kodande sekvens och en C-terminal Flash tagg 10.
- SBD-FLASH proteinuttryck
- Transformera kompetent E. coli C41-celler med plasmiden pRSET-HisSBDS-FLASH med en vanlig värmechock protokoll 19. Plate cellerna i fasta Luria-Bertani (LB) medium kompletterat med 100 mikrogram / ml ampicillin. LB fasta medier sammansättning består av 10 g NaCl, 5 g jästextrakt, 10 g trypton och 20 g agar för en L volym.
- Odlingstransformerade bakterier vid 37 ° C tillsabsorbans vid 600 nm (A 600) når 0,5-0,7 i 1 liter LB flytande medium kompletterat med 100 | j, g / ml ampicillin.
- Inducera proteinexpression genom tillsats av 0,5 mM isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid till odlingen och fortsätt inkuberingen för ytterligare 5 timmar.
- Samla in den bakteriella suspensionen genom centrifugering vid 3800 xg under 10 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten. Vid denna punkt, antingen lagra cellpelleten vid -20 ° C eller användas direkt för proteinrening.
- SBD-FLASH proteinrening
NOTERA: Alla kromatografiska steg utförs med en snabb protein-vätskekromatografi (FPLC) system eller en peristaltisk pump. Ni 2+ -affinity kromatografi använder en 5 ml Fast Flow-kolonn. Anjonbyteskromatografi använder en 5 ml stark sulfopropyl katjonbytare kolonn. En flödeshastighet av 3 ml / min användes för alla de kromatografiska stegen.- Resuspendera cellerna i 35 ml SBD Lysis bUffer (50 mM fosfatbuffert pH 7,5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol) kompletterat med 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) och lyserar genom sonikering under en total tid av 4 min med användning av cykler av 10 sek PÅ och 30 sek FRÅN, vid 4 ° C.
- Centrifugera provet vid 9000 xg under 50 min vid 4 ° C.
- Hålla supernatanten och kasta pelleten för att avlägsna cellrester.
- Jämvikta Ni2 + affinitetskolonn med 3 kolonnvolymer (CV) av SBD Lysbuffert och införa hela klarnade supernatanten på kolonnen.
- Avlägsna obundet protein genom tvättning med 3 CV av SBD Lysis-buffert och eluera med 3 CV av SBD elueringsbuffert (50 mM fosfatbuffert pH 7,5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol).
- Späd det eluerade proteinet 6-faldigt med 50 mM fosfatbuffert pH 6,5 och avlägsna eventuella aggregat genom filtrering genom ett 0,22 | j, m cellulosamembran.
- Utjämna sulfopropyl katjonbytaren kolonn med 3 CV av låg salthalt S-kolonnbuffert (50 mM fosfatbuffert pH 6,5, 50 mM NaCl) och införa proteinprovet från föregående steg.
- Tvätt obundet material med 3 CV av låg salthalt S kolonnbuffert och eluera proteinet i ett steg med 50 mM fosfatbuffert pH 6,5, 1 M NaCl.
- Späd det eluerade proteinet 3,3-faldigt med 50 mM fosfatbuffert pH 6,5. Koncentrera proteinet med ultrafiltreringsanordningar genom centrifugering vid 3800 xg under 15 min. Flash frysa proteinet i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C tills vidare användning.
- Kontrollera renheten av proteinet genom SDS-PAGE-analys och Coomassie-färgning 20.
2. EFL1 Protein Expression and Purification
OBS: EFL1 uttrycktes under reglering av Gal 1/10 divergenta promotorn 21 och Saccharomyces cerevisiae MAT A 3'UTR i vektorn pRS426. Det rekombinanta proteinet kodar för det humana EFL1 isoform en fusionerad till en tobaks Etch Virus proteas (TEV) igenkänningsställe och en hexahistidin-markör vid C-terminalen.
- EFL1 proteinuttryck
- Transformera S. cerevisiae BCY123 celler med plasmiden pRS426-EFL1TevHis med en vanlig litiumacetat protokoll 22. Plate alla de transformerade cellerna i syntetisk droppe ut medier utan uracil (SD-URA) kompletterat med 2% (vikt / volym) glukos. Sammansättningen av SD-URA media består av 8 g jästkvävebas utan aminosyror, 11 g kasaminosyror, 55 mg adenin sulfat, 55 mg tyrosin, 60 mg leucin och 60 mg tryptofan för en L volym.
- Kultur transformerad jäst vid 30 ° C tills en 600 når 1,8 i 1 L av SD-URA-medium kompletterat med 0,5% (vikt / volym) glukos.
- Inducera proteinexpression genom tillsats av 2,8% (vikt / volym) galaktos till odlingen och fortsätt inkuberingen för ytterligare 18 h vid 30 ° C.
- Samla jästsuspensionen genom centrifugering vid 3800 xg under 10 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten.Vid denna punkt, antingen lagra cellpelleten vid -20 ° C eller användas direkt för proteinrening.
- EFL1 proteinrening
NOTERA: Alla kromatografiska steg utförs med användning av ett FPLC-system eller en peristaltisk pump. Ni2 + -affinity kromatografi använder en 5 ml Fast Flow-kolonn vid en flödeshastighet av 3 ml / min. Storlekssorterande kromatografi använder en 125 ml kolonn för-packad med Superdex 200-harts vid en flödeshastighet av 1 ml / min.- Resuspendera cellerna i 50 ml EFL1 Lysis-buffert (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, 5 mM MgCl2, 10% glycerol) kompletterat med 1 mM PMSF och 1 mM bensamidin och sönderdela cellerna genom friktion på en vulst slagbom användning av glaspärlor (o = 0,5 mm) under en total tid av 6 min med användning av cykler av 2 min tILL och 15 min fRÅN, vid 4 ° C.
- Centrifugera provet vid 9000 xg under 50 min vid 4 ° C.
- Hålla supernatanten och kasta pelleten för att avlägsna cellrester. Jämvikta Ni2 + affinitetskolonn med 3 CV av EFL1 Lysbuffert och införa all den klarnade supernatanten på kolonnen.
- Avlägsna obundet protein genom tvättning med 3 CV av EFL1 Lysis-buffert och eluera med 3 CV av EFL1 elueringsbuffert (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, 5 mM MgCl2, 10% glycerol).
- Jämvikta storleksuteslutningskolonn med 1,5 CV av Anisotropy-buffert (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 5 mM β-merkaptoetanol).
- Koncentrera till 1 ml av EFL1 protein eluerat från Ni 2+ affinitetskolonnen med ultrafiltreringsanordningar genom centrifugering vid 3800 xg för att den önskade volymen. Införa provet på storleksuteslutningskolonn.
- Samla in det eluerade proteinet och koncentrera genom ultrafiltrering till en slutlig koncentration av ca 30 ^ M. Flash frysa proteinet i flytande kväve och förvara vid -80 ° C tills vidare användning. verifiera the renheten av proteinet genom SDS-PAGE-analys och Coomassie-färgning 20.
3. Märkning av SBD-FLASH med Flash fluorescerande färgämne 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) Fluorescein
- Blanda 3 nmol av SBD-FLASH-proteinet med 3 nmol av 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein färgämne i 5 | j, l volym av Anisotropy buffert.
- Låt reaktionen fortgå under 8 h vid 4 ° C. Dialysera provet mot Anisotropy buffert över natten för att avlägsna fritt färgämne.
- Använda Lambert-Beers lag för att kvantifiera% av märkt protein. Mät absorbansen vid 280 nm och 508 nm i en spektrofotometer med användning av en kvartskyvett av lämplig volym. OBS: Tänk på följande molära absorptionskoefficienter (M -1 cm -1):
- Beräkna koncentrationen av märkt SBD-FLASH protein med hjälp av ekvation 2.
- Beräkna koncentrationen av total SBD-protein med hjälp av ekvation 3 genom att ersätta den beräknade C SBD-FLASH från föregående steg.
- Beräkna procentandelen märkta proteinet med hjälp av ekvation 4.
4. Fluorescensanisotropi Experiment
OBS: anisotropi experiment utfördes i en spektrofluorometer utrustad med en polarisering verktygslåda och datainsamling utfördes med användning av anisotropi programmet tillhandahålls i mjukvaran av utrustningen. Excitationsvåglängden inställdes på 494 nm med en spektral bandbredd på 8 nm och emissions registrerades med användning av ett bandpassfilter av 530 ± 25 nm. Mätningar gjordes vid 25 ° C i en 200 ^ kyvett med en 5 mm banlängd 10.
- I en fluorescens kyvett, placera 200 ul av 30 nM SBD-blixt i anisotropi buffert och titrera 2 pl 30 pM EFL1. Blanda väl och låt reaktionen stå under 3 min före mätning av anisotropivärde.
- Upprepa steg 4,1 tills en total volym av 40 | il av EFL1 har lagts till.
5. Dataanalys
- Passar data till en lämplig bindnings modell med en icke-linjär minsta kvadratregressionsalgoritm. Ekvationer för de vanligaste bindningsmodeller presenteras i tabell 1.
- Utvärdera den bästa modellen som beskriver interaktionen mellan proteinerna genom att inspektera de rester av passformen 23. Stötta den valda modellen med ytterligare experiment.
Tabell 1. Gemensamma protein-proteininteraktion bindande modeller och de matematiska ekvationer som beskriver dem.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna tabell. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att utföra någon anisotropi experiment är det viktigt att utesluta stora förändringar i fluorescensintensiteten hos fluoroforen eftersom den observerade anisotropi av en blandning av arter representeras av ekvation 5:
där F i representerar den fraktionella fluorescensen av varje komponent och ri är motsvarande anisotropi. Fraktionerad fluorescens av varje komponent beror på båda, dess koncentration och dess relativa fluorescens, som definieras av ekvation 6:
där X i representerar molfraktionen av thei th specie och Ö I är kvantutbytet av den i: te arten.
Således, det är bättre om fluorescensintensiteten ändras dramatiskt längs titrering till, antingen mäta komplexbildning som en funktion av förändringen i fluorescenssignal och inte av anisotropin signalen, eller korrigera den observerade anisotropivärde genom att montera både fluorescensintensitet och anisotropin data. Fluorescensen hos SBD-Flash har inte märkbara förändringen vid bindning till EFL1 (figur 2) vilket antyder att fluorescensanisotropi är adekvat för att mäta bindningen mellan de två proteinerna.
Figur 2. Fluorescens emission av SBD-flash efter titrering av ökande koncentrationer av EFL1. Förändringar i fluorescensemission av fluoroforen är negligible och slumpmässigt längs titreringen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ett exempel på fluorescensanisotropi bindningskurva erhållen från titreringen av EFL1 till SBD-FLASH visas i figur 3. Kvalitativt visar formen på grafen tydligt att de två proteinerna interagerar vilket bevisas av en ökning i anisotropi signalen vid tillsats av EFL1. Vidare anisotropi värden nått en platå vilket tyder på att vid slutet av titreringen alla SBD-flash-proteinet var närvarande i ett komplex med EFL1. Det är möjligt då, att kvantitativt beskriva samspelet mellan dessa proteiner och montera data med hjälp av icke-linjär minsta kvadratregression till en förmodad bindande modell och få motsvarande dissociation jämvikt konstant. Montering på en bindningsställe modell inte lämpbart beskriva de experimentella data (figur 3a). Detta framgår inte bara av den passande spår i bindningskurva utan också från avvikelserna för de rester av passformen (skillnaden mellan de teoretiska och experimentella data) som är märkbar och icke-slumpvis. Detta stämmer väl överens med det faktum att en enda bindningsställe modell beskrivs matematiskt genom en hyperbolisk kurva i stället för en sigmoidal kurva som den som observerades för de experimentella data som presenteras i Figur 3. Å andra sidan, modeller, såsom två identiska eller två olika bindande platser beskriver bättre experimentella data och rester av passformen visar ingen systematisk avvikelse som stöder en två-site förening modell (Figur 3B-C). I avsaknad av andra experimentella uppgifter är svårt att fastställa vilken av de två modellerna motsvarar bindningsmekanismen mellan EFL1 och SBD. Ändå SBD och EFL1 är båda mono proteiner, så det är difficult att tänka sig en två identiska bindningsställen modell.
. Figur 3. Fluorescensanisotropi bindande isotermen av interaktionen mellan EFL1 och SBD-FLASH Den heldragna linjen i var och en av de övre tomter motsvarar passningen av data till olika bindnings modeller: (A) enda plats, (B) två identiska platser och (C) två icke-identiska ställen. Lägre tomter representerar rester av passformen till motsvarande modell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De flesta biokemiska experiment med proteiner kräver inte bara rent protein utan också stora mängder av dem, oberoende av vilken teknik som används. Av denna anledning är de proteiner som används för denna typ av experiment som erhållits genom heterologt uttryck, som det var fallet som presenteras här. Blomningstid spektroskopi kräver närvaro av en fluorofor i den studerade molekylen. Aromatiska rester utgör inneboende fluoroforer av ett protein, men med hjälp av sin signal för att studera protein-proteininteraktioner komplicerar analysen eftersom de är gemensamma för de flesta proteiner och skulle vara närvarande i både receptorproteinet och liganden. Dessutom är livslängden för tryptofan för kort för fluorescensanisotropi experiment. Av denna anledning är det vanligt att tillsätta exogena fluoroforer till ett av de studerade proteinerna. För detta ändamål har en fluorofor adderas till C-terminalen hos SBD genom en koordinationsbindning mellan färgämnet 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein med en tetracysteine motiv introduceras i proteinet med genteknik. Välja protein som blottar fluoroforen är inte ett slumpmässigt fråga. På grund av storleken på proteinerna studeras här (SBD 29 kDa och EFL1 127 kDa), vi förväntade oss en större förändring i anisotropi mellan fri märkt-SBD och att i komplex med EFL1, jämfört med förändringen beräknas mellan fri märkt-EFL1 och att bunden till SBD. Med detta i åtanke var en Flash tagg infördes i SBD snarare än till EFL1. En annan parameter viktigt att tänka på när du ställer in en fluorescensanisotropi experiment är absorptionen av de lösningar som används. Den optiska densiteten hos lösningen i kyvetten skall inte vara större än 0,1 vid excitations- och emissionsvåglängden, och bör vara konstant längs hela titreringen. Annars kan inre filtereffekt ingripa i mätningen och måste korrigeras för. I experimentet som presenteras här, proteinerna studerades inte absorberar vid våglängden excitatjon eller emission av 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein färgämne; sålunda inre filtereffekten inte utgör ett problem.
När det gäller insamling av uppgifter, och att därefter ordentligt passa data, är det nödvändigt att ha väldefinierade undre och övre baslinjer med flera datapunkter genom övergången längs bindningskurva. Annars, montering av uppgifterna är felaktiga och information om bindningsläget kan gå förlorad. För att beskriva en hygglig bindningskurva är det nödvändigt att koncentrationen av fri ligand skiljer sig med två logaritmiska enheter under respektive över de dissociationskonstant emellertid experimentellt detta kan vara svårt att uppnå. I den nedre gränsen, kan problem med Utrustningens känslighet uppstår speciellt när affiniteten mellan proteinerna är mycket hög, medan stora koncentrationer kanske inte uppnås på grund av problem i liganden löslighetsegenskaper. Detta var klart exempel när man testar samspelet mellan SBDS143L sjukdom mutanten och EFL1. Denna mutant störde bindningen till EFL1 i en sådan utsträckning att det inte var möjligt att erhålla en riktig bindningskurva sedan EFL1 endast kan koncentreras upp till 70 ^ M och proteinet blir utspätt ≈ 5 faldigt under titreringen 10. Således är det nödvändigt att ha en grov uppskattning av affiniteten för att optimera titreringsschema och se till att hopp i ligandkoncentration inte förekommer vid positioner som skulle orsaka en mindre exakt passning. Till exempel, kommer saknade de första punkterna i bindningskurva presenteras i Figur 3 att det ser ut som en hyperbel vilseledande forskaren mot ett enstaka bindningsplatsmodell.
När samlas in, var data som monteras på en förmodad bindande modell. I jämförelse med fluorescens data kan anisotropi data användas utan ytterligare manipulation och inte behöver korrektion för utspädningseffekter. Ekvationerna som presenteras i tabell 1 finner att [L] ≈[L] 0 vid varje punkt av titreringen. Detta kan inte hända när affiniteten mellan proteinerna är mycket hög, så att de första punkterna titreringsresultat liganden utarmning inträffar. I detta scenario beskrivs mer komplexa andragradsekvationer någon annanstans 23 behövs för att passa data. I experimentet som beskrivs här, var liganden EFL1 alltid i stort överskott jämfört med koncentrationen av SBD-FLASH och förändringen i EFL1 koncentrationen vid varje punkt av titreringen kan ignoreras. Såsom diskuteras i resultatdelen, en två icke-identiska bindningsställen modell som beskrivs bäst i experimentdata (fig 3C). Ytterligare biokemisk information som erhållits i grupp stöder tanken att det är rätt modell för att beskriva växelverkan mellan EFL1 och SBD (data visas ej). Detta läge av interaktion är vanligt i flerdomänproteiner, såsom EFL1 och SBD är, och flera exempel existerar inom litteraturen 24-26. Det är emellertid enLSO viktigt att utesluta en icke-specifik interaktion som kan framstå som en modell för samverkan av olika bindningsställen med olika affiniteter för deras ligand. För detta ändamål är en Scatchard-plot mycket användbar. Jämfört med andra tekniker, rapporterar fluorescensanisotropi signalen mängden komplex bildat och det är således möjligt att bygga en Scatchard-plot med data. En konvex Scatchard-kurvan antyder en två olika bindningsställen modell med negativ kooperativitet eller icke-specifik bindning, medan en konkav Scatchard-diagram innebär en två olika bindningsställen modell med positiv kooperativitet eller ligand instabilitet (Figur 4). Analys av experimentella data visade en Scatchard-plot med en konkav form som stöder en modell av två oberoende bindningsställen för EFL1 och SBD (Figur 4D). Vidare positiva samverkans bekräftades efter att ha utfört en Hill-analys som resulterade i en Hill-koefficient värde av 1,8 ± 0,02 (data visas ej).
Figur 4. Scatchard-diagram för olika protein-proteinbindnings modeller. (A) Single bindningsställe eller flera identiska platser som inte interagerar. (B) Flera olika bindningsställen med negativt kooperativitet eller icke-specifik bindning. (C) Flera olika bindningsställen med positiva samverkans eller ligand instabilitet. (D) Scatchard plot till följd av analys av de experimentella anisotropi data som erhållits från titreringen av EFL1 till SBD-Flash. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Fluorescensanisotropi är en lösningsbaserad, verklighetsjämviktsteknik som kräver de studerade molekylerna att förbli i lösning vid de betingelser som testats. Det kan användas för att studera inte påly interaktionen mellan fullängdsproteiner utan också interaktionen mellan proteindomäner, mutantproteiner eller till och med peptider med posttranslationella modifieringar. Dessutom kan fluorescensanisotropi också användas för att mäta bindning av proteiner till lipidmembran som använder fluorescerande känsliga membran prober. Detta tillvägagångssätt har med framgång använts för att studera effekten att a-synuklein har på synaptiska vesikler packning 27. En av de största fördelarna med fluorescens anisotropi är att det ger kvantitativ information om bindningen av de studerade molekylerna sådana som kan erhållas sanna dissociationskonstanter tillsammans med mekanistisk information. Även om andra biofysiska tekniker kan också användas för att erhålla sådan information, kräver fluorescensanisotropi små mängder prov och kan utföras inte bara i jämvikt, som presenteras här, men också med hjälp av snabb kinetik, såsom stoppat flöde fluorometri, för att erhålla föreningen och dissociationshastighetkonstanter (k den och koff, respektive) 28. En jämförelsetabell med de fördelar och nackdelar med fluorescensanisotropi med avseende på andra biofysiska tekniker presenteras i tabell 2. Alla de metoder som beskrivs är sanna jämvikts tekniker, eftersom ingen av dem omfattar en process av mekanisk separation av de fria och bundna fraktioner. Såsom nämns i resultatdelen, om fluorescensintensiteten hos ett märkt-protein ändrar till stor del på växelverkan, den här egenskapen kan sedan användas för att kvantifiera affiniteten för bindning. Men förändringar i fluorescensintensiteten till följd av interaktion tyder på en möjlig störning av den yttre fluoroforen på molekylär interaktion själv; nämligen en möjlig förändring av dissociationskonstanten (Kd) värdet på motsvarande icke-märkta proteinerna. Som sådan kan fluorescensanisotropi anses vara en mindre invasiv teknik än chAnges i fluorescensintensitet eftersom de förstnämnda bör tillämpas när fluorescensintensiteten inte ändras vid interaktion. I denna mening, även om stora mängder av proteinet krävs kan Isotermiska Titrering Calorimetry (ITC) ge en riktig Kd värdet av molekylär interaktion, eftersom det är en etikett fri metod. Å andra sidan, är mekanistisk information som inte erhålls på grund skillnader i värme rapportera endast på entalpin för processen och inte mängden komplex bildat 29.
I jämförelse, in vivo-metoder såsom jäst två-hybrid eller fragment komplemente analyser inte kräver renade proteiner, men de ger endast semi-kvantitativ information om läget av bindning. Trots det faktum att i jästen två-hybridtekniken är möjligt att uttrycka styrkan hos de bindande använder Miller-enheter, detta är inte en verklig jämviktskonstanta och många faktorer av kontroll av forskaren kan förändra den.
Tabell 2. Fördelar och nackdelar av vanliga biofysiska tekniker som används för att studera protein-proteininteraktioner. Klicka här för att se en större version av denna tabell. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | Ultra pure |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | This kit contains the dye to label a FlAsH tag |
| Ampiciline | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Formedium | GLU03 | |
| D(+)-Galactose | Formedium | GAL03 | |
| L-Leucine | Formedium | DOC0157 | |
| L-Tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Sodium Chloride |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Magnesium Chloride |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Potassium phosphate dibasic |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Sodium phosphate monobasic |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Yeast extract | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Filtration units | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Membrane Filter | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain |
| Ni2+ affinity column | QIAGEN | 30760 | Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl cation exchanger column | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Size Exclusion column | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Fluorescence cell | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Spectrophotometer | Agilent Technologies | G6860AA | Cary 60 UV-Vis |
| Shaker | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Discontinued | FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction |
| Spectrofluorometer | Olis | No applicable | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
References
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).
- Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11 (12), 848 (2015).
- Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
- Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).
- Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).
- Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).
- Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Third, Springer US. (2010).
- Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
- Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
- Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , Wiley. (2015).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
- Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
- Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).
- Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).
- Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).
- Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
- Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
- Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).
