Summary
interacciones de proteínas están en el corazón de la función de la célula. técnicas calorimétricas y espectroscópicas son comúnmente utilizados para caracterizarlos. Aquí describimos anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar la interacción entre la proteína mutada en el síndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) y el factor de elongación 1 similar GTPasa (EFL1).
Abstract
Las interacciones proteína-proteína desempeñan un papel esencial en la función de un organismo vivo. Una vez que una interacción ha sido identificado y validado es necesario caracterizar en el nivel estructural y mecánica. Existen varios métodos bioquímicos y biofísicos para tal fin. Entre ellos, anisotropía de fluorescencia es una técnica poderosa particularmente cuando se utiliza la intensidad de fluorescencia de una proteína marcada con fluoróforo permanece constante tras la interacción proteína-proteína. En esta técnica, una proteína marcada con fluoróforo se excita con luz polarizada verticalmente de una longitud de onda apropiada que excita selectivamente un subconjunto de los fluoróforos en función de su orientación relativa con el haz entrante. La emisión resultante también tiene una direccionalidad cuya relación en los planos vertical y horizontal define la anisotropía (r) como sigue: r = (I VV -I VH) / (I + 2I VV VH), donde I VV y yo
Introduction
Las células contienen una multitud de biomacromoléculas que interactúan constantemente entre sí. Esta asociación da lugar a complejos que participan en las vías celulares responsables de su funcionamiento en la transducción de señales, regulación de la expresión génica y la migración celular entre otros. Todas las interacciones proteína-proteína que se producen en una célula comprenden una red conocida como el interactome. En Saccharomyces cerevisiae más de 70% de sus proteínas se ha demostrado que tiene que interactúan socios 1. La comprensión de la interactoma de una célula y sus funciones proporcionar información relevante sobre la complejidad y la diversidad de los organismos vivos. Varios métodos han sido descritos para identificar y caracterizar las interacciones proteína-proteína. Diferentes alta a través de métodos tales como poner dos híbridos de levadura 2, ensayos de complementación de proteínas fragmento 3, 4 purificación por afinidad acoplada a espectrometría de masas y microarra proteínasys se utilizan para identificar una interacción 5,6. Una vez identificados, es necesario para validar y esto puede variar sobre una base de caso por caso. Típicamente, estos experimentos implican la interrupción de la interacción en sí misma en el nivel de los miembros individuales de la pareja de interacción, por ejemplo, por deleción del gen o la sobreexpresión de una de las proteínas y, a continuación en busca de cambios en las propiedades o la función del otro miembro en el nivel celular. Posteriormente, técnicas biofísicas 7 se utilizan para caracterizar la interacción proteína-proteína en el nivel molecular. Con este fin, la estructura de los complejos de proteínas se determinó por cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear y crio-microscopía electrónica mientras calorimetría y espectroscopía de fluorescencia se utilizan para describir cuantitativamente y de manera mecánica.
En este trabajo, la anisotropía de fluorescencia se usó como una técnica para caracterizar la interacción entre la GTPasa EFL1 y el SBDproteína S. Estas proteínas participan en la síntesis de los ribosomas mediante la promoción de la liberación del factor de iniciación eucariótico 6 de la superficie de las subunidad 60S ribosomal 8. La proteína SBDS está mutado en una enfermedad conocida como el síndrome de Shwachman-Diamond 9 y actúa como un factor de intercambio de nucleótidos de guanina para EFL1 disminuyendo su afinidad por difosfato de guanosina 10,11. mutaciones de la enfermedad en SBDS abolir la interacción con EFL1 de materiales, evitando su activación.
La anisotropía de fluorescencia se utiliza comúnmente en aplicaciones biológicas para estudiar la proteína-péptido o interacciones proteína-ácido nucleico. Se basa en el principio de que un fluoróforo excitado con los resultados de luz polarizada en una emisión parcialmente polarizada. La anisotropía de fluorescencia se define por la Ecuación 1:
donde VV y VH son laintensidades de fluorescencia de la vertical (VV) y horizontalmente (VH) de emisión polarizadas cuando la muestra se excita con luz polarizada verticalmente 12. La anisotropía de fluorescencia es sensible a los factores que afectan a la tasa de la difusión rotacional del fluoróforo y por lo tanto depende de la temperatura, la viscosidad de la solución y el tamaño molecular aparente del fluoróforo. El tamaño aparente de una proteína que contiene un fluoróforo aumenta cuando interactúa con otra proteína y tal cambio, entonces se puede evaluar como un cambio en la anisotropía. Más específicamente, un fluoróforo que gira lentamente en solución con respecto a su tiempo de vida fluorescente tendrá un valor grande I VV y valor pequeño I VH y por lo tanto exhibirá un relativamente grande anisotropía. Para fluoróforos que caen rápidamente en relación a su tiempo de vida fluorescente, me VV y VH será similar y su valor será pequeña anisotropía 12 (Figura 1). Además, para una buena señal de anisotropía para la medición del ruido, es necesario disponer de un fluoróforo con una vida de fluorescencia similar al tiempo de correlación rotacional de la molécula de interés. De lo contrario, no es posible registrar con precisión la diferencia de anisotropía entre la proteína libre y que en el complejo. Por ejemplo, la anisotropía de una sonda fluorescente con una vida útil cerca de 4 nseg tales como fluoresceína o rodamina unidos a un compuesto de bajo peso molecular de 100 Da es 0,05. La unión a una molécula de 160 kDa aumentará su valor de anisotropía a 0,29; una diferencia que se puede medir con precisión. Por el contrario, la misma sonda fluorescente que participan en una reacción de unión cuyo aumento en el tamaño molecular varía de 65 a 1000 kDa sólo resultará en un cambio de anisotropía de 0,28 hasta 0,3, que es demasiado pequeña para ser medida con precisión. En este escenario, una sonda con un tiempo de vida de 400 nseg sería más adecuado 12.
Figura 1. Representación esquemática del equipo utilizado para medir la anisotropía de fluorescencia y el procedimiento. Representación esquemática del equipo utilizado para realizar una medición de anisotropía de fluorescencia proteína-proteína experimento interacción. Fluoróforos que caen rápido pantalla pequeña anisotropía que aumenta tras la unión a un compañero de interacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
aplicaciones de fluorescencia requieren la presencia de un fluoróforo en cualquiera de las moléculas estudiadas. Para el estudio de las interacciones proteína-proteína hay tres tipos de fluoróforos: 1) los residuos de triptófano presentes en las proteínas, 2) fluoróforos unidos químicamente y 3) parejas de fusión fluorescentes tales como proteína verde fluorescente (GFP) y su derivatantes. La mayoría de las proteínas tienen residuos de triptófano en su estructura, por tanto, la manera más fácil de medir una interacción es mediante el control de los cambios en los espectros de fluorescencia correspondiente o mediante el control de los cambios en la intensidad de fluorescencia de los residuos de triptófano. Sin embargo, los residuos de triptófano pueden estar presentes en ambas proteínas que complican el análisis. Por otra parte, por un fluoróforo para cambiar sus propiedades fluorescentes debido a una interacción que tiene que estar situado en o cerca del sitio de unión y que podría interferir con la interacción en sí misma. Esto necesita una atención especial cuando se utiliza fluoróforos voluminosos tales como GFP. Si ninguno de estos fluoróforos se puede utilizar para estudios de unión es necesario, entonces, para introducir fluoróforos extrínsecas a la de las proteínas implicadas. Existen muchos fluoróforos sintetizados químicamente y pueden ser unidos covalentemente a las proteínas a través de sus grupos reactivos tales como los grupos amina (cadena lateral de lisinas o N-terminal) y los grupos tiol en cisteína. Fderivados luorophore con ésteres de isotiocianato y succinimidilo reaccionan con grupos amida mientras yodoacetamida y maleimida son grupos reactivos con tiol 13. Los colorantes más comunes utilizados en aplicaciones de fluorescencia son derivados de la fluoresceína y los colorantes rodamina verde, cumarinas, fluoróforos BODIPY y colorantes Alexa Fluor. Una lista detallada de fluoróforos disponibles en el mercado y su uso se puede encontrar en las referencias 14,15. Para el etiquetado de éxito, el grupo reactivo debe ser expuesto en la superficie de la proteína, pero debido a la gran cantidad de grupos funcionales reactivos típicamente presentes en polipéptidos que es muy difícil de conseguir la modificación específica de sitio. La proteína de interés en este estudio, SBDS, contiene 5 cisteínas libres y 33 lisinas que pueden resultar en el etiquetado de múltiples sitios. etiquetado no uniforme puede afectar a la unión y complicará el análisis de datos como diferentes moléculas de fluoróforo pueden provocar diferentes señales de intensidad de fluorescencia tras la unión. para overcome este problema, hemos utilizado el fluoróforo flash, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína a la etiqueta sitio directa la proteína SBDS. Este es un colorante de arsenóxido con una alta afinidad por cuatro cisteínas espaciadas en un motivo de saber como Flash-tag consiste en la secuencia CCXXCC donde X es cualquier aminoácido distinto de cisteína 16,17. Este motivo de tetracisteína se añade a la N- o C-terminal de la proteína por ingeniería genética junto con un enlazador adecuado para evitar la interrupción del pliegue general de la proteína. La pareja que consiste en FLASH tinte y Flash-tag fue diseñado originalmente para las proteínas de etiquetas específicas del lugar en las células 17 que vivían, pero también puede ser utilizada para etiquetar proteínas purificadas in vitro como se ejemplifica aquí. Además, las estrategias enzimáticos también se han desarrollado para permitir la funcionalización específica de sitio de proteínas 18.
En este manuscrito se describe la utilidad de anisotropía de fluorescencia de unaherramienta sa para estudiar las interacciones proteína-proteína. La unión puede evaluarse por simple inspección de la forma de la curva de unión mientras que la información cuantitativa puede obtenerse a partir del ajuste de los datos experimentales.
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Protocol
1. SBDS-flash expresión de la proteína Tag y Purificación
NOTA: Para los experimentos de anisotropía, una etiqueta de flash correspondiente a la secuencia de-Pro-Cys-Cys-Cys Gly Cys se añadió a la C-terminal de la secuencia de codificación SBDS humanos por PCR. Este constructo se subclonó en el vector de expresión pRSET-A y se transformó en células C41 Escherichia coli para expresar una proteína que codifica una etiqueta de hexahistidina N-terminal (His-tag), los SBDS humanos secuencia y un C-terminal etiqueta FLASH 10 de codificación.
- Expresión de la proteína SBDS-Flash
- Transformar E. competente células de E. coli C41 con el plásmido pRSET-HisSBDS-flash utilizando un protocolo estándar de choque térmico 19. Placa de las células en medios sólidos Luria-Bertani (LB) suplementado con ampicilina 100 mg / ml. LB composición medios sólidos se compone de 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura, 10 g de triptona y 20 g de agar para el volumen de 1 L.
- bacterias transformadas cultivo a 37 ° C hastaabsorbancia a 600 nm (A 600) alcanza 0,5 a 0,7 en 1 L de medio líquido LB suplementado con 100 g de ampicilina / ml.
- Inducir la expresión de la proteína mediante la adición de 0,5 mM isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido a la cultura y continuar la incubación durante más de 5 horas.
- Recoger la suspensión bacteriana por centrifugación a 3.800 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. En este punto, ya sea almacenar el sedimento celular a -20 ° C o utilizar inmediatamente para la purificación de proteínas.
- La purificación de proteínas SBDS-Flash
NOTA: Todas las etapas cromatográficas se realizan usando un sistema de cromatografía líquida (FPLC) de proteínas rápida o una bomba peristáltica. Cromatografía de Ni 2+ -affinity utiliza una columna de flujo rápido de 5 ml. cromatografía de intercambio aniónico utiliza una columna de intercambio de sulfopropilo catiónico fuerte 5 ml. Una velocidad de flujo de 3 ml / min fue utilizado para todas las etapas cromatográficas.- Resuspender las células en 35 ml de SBDS lisis bUffer (50 mM tampón de fosfato pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) y se lisan por sonicación durante un tiempo total de 4 min usando ciclos de 10 seg ON y 30 seg OFF, en 4 DO.
- Centrifugar la muestra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C.
- Mantenga el sobrenadante y desechar el sedimento para eliminar los restos celulares.
- Equilibrar la columna de afinidad de Ni 2+ con 3 volúmenes de columna (CV) de tampón de lisis SBDS e introducir el conjunto sobrenadante clarificado en la columna.
- Eliminar la proteína no unida mediante lavado con 3 CV de tampón de lisis SBDS y se eluye con 3 CV de tampón de elución SBDS (tampón fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM).
- Diluir la proteína 6 veces se eluyó con tampón fosfato 50 mM pH 6,5 y eliminar los posibles agregados por filtración a través de una membrana de 0,22 micras de celulosa.
- Equilibrar la columna de intercambiador de cationes de sulfopropilo con 3 CV de falta de sal columna Stampón (tampón fosfato 50 mM pH 6,5, NaCl 50 mM) e introducir la muestra de proteína de la etapa anterior.
- el material no unido de lavado con 3 CV de baja sal S tampón de columna y se eluye la proteína en un solo paso con tampón fosfato 50 mM pH 6,5, 1 M NaCl.
- Diluir la proteína 3,3 veces eluida con 50 mM de tampón de fosfato de pH 6,5. Se concentra la proteína con dispositivos de ultrafiltración por centrifugación a 3800 xg durante 15 min. Flash congelar la proteína en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C hasta su uso posterior.
- Verificar la pureza de la proteína por análisis de SDS-PAGE y tinción de Coomassie 20.
2. EFL1 Expresión y Purificación de Proteínas
NOTA: EFL1 se expresó bajo la regulación del promotor Gal 1/10 divergentes 21 y el Saccharomyces cerevisiae MAT Un 3'UTR en el vector pRS426. La proteína recombinante codifica la isoforma humana EFL1 1 fusionado a una proteasa de virus del grabado del tabaco (TEV) sitio de reconocimiento y una etiqueta de hexahistidina en el extremo C-terminal.
- Expresión de la proteína EFL1
- Transformar S. células cerevisiae BCY123 con el plásmido pRS426-EFL1TevHis usando un protocolo de acetato de litio estándar 22. Placa de todas las células transformadas en caída sintético a cabo los medios de comunicación sin uracilo (SD-URA) suplementado con 2% (w / v) de glucosa. Composición de los medios de comunicación SD-URA consiste en 8 g de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 11 g de casaminoácidos, 55 mg de sulfato de adenina, 55 mg de tirosina, 60 mg de leucina y 60 mg de triptófano para el volumen de 1 L.
- Cultivo transformado levadura a 30 ° C hasta 600 A llega a 1,8 en 1 l de medio SD-ura suplementado con 0,5% (w / v) de glucosa.
- Inducir la expresión de proteína mediante la adición de 2,8% de galactosa (v / w) al cultivo y continuar la incubación durante otras 18 horas a 30 ° C.
- Recoger la suspensión de levadura por centrifugación a 3800 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.En este punto, ya sea almacenar el sedimento celular a -20 ° C o utilizar inmediatamente para la purificación de proteínas.
- La purificación de proteínas EFL1
NOTA: Todas las etapas cromatográficas se realizan usando un sistema FPLC o una bomba peristáltica. Cromatografía de Ni 2+ -affinity utiliza una columna de flujo rápido de 5 ml a un caudal de 3 ml / min. cromatografía de exclusión por tamaños utiliza una columna de 125 ml pre-empaquetada con resina Superdex 200 a una velocidad de flujo de 1 ml / min.- Resuspender las células en 50 ml de EFL1 tampón de lisis (Tris-HCl 50 pH 8, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, 5 mM MgCl 2, 10% de glicerol) suplementado con PMSF 1 mM y benzamidina 1 mM y romper las células por la fricción en un batidor de bolas usando perlas de vidrio (Ø = 0,5 mm) para un tiempo total de 6 min utilizando ciclos de 2 min ON y OFF 15 min, a 4 ° C.
- Centrifugar la muestra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C.
- Mantenga el sobrenadante y desechar el sedimento para eliminar los restos celulares. Equilibrar la columna de afinidad de Ni 2+ con 3 CV de tampón de lisis EFL1 e introducir todo el sobrenadante clarificado en la columna.
- Eliminar la proteína no unida mediante lavado con 3 CV de tampón de lisis EFL1 y se eluye con 3 CV de tampón de elución EFL1 (50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, 5 mM MgCl 2, 10% de glicerol).
- Equilibrar la columna de exclusión de tamaño con 1,5 CV de tampón de Anisotropía (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, 5 mM MgCl 2, 10% de glicerol, 5 mM β-mercaptoetanol).
- Se concentra a 1 ml de la proteína EFL1 eluida de la columna de afinidad de Ni 2+ con dispositivos de ultrafiltración por centrifugación a 3.800 xg hasta el volumen deseado. Introducir la muestra en la columna de exclusión de tamaño.
- Recoger la proteína eluida y se concentra por ultrafiltración a una concentración final de aproximadamente 30 mM. Flash congelar la proteína en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C hasta su uso posterior. verificar THe pureza de la proteína por análisis de SDS-PAGE y tinción de Coomassie 20.
3. El etiquetado de SBDS-flash con el flash colorante fluorescente 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína
- Mezclar 3 nmol de la proteína SBDS-flash con 3 nmol de la 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína en un volumen de 5 l de tampón de anisotropía.
- Deje que la reacción transcurra durante 8 horas a 4 ° C. Se dializa la muestra frente a tampón de anisotropía durante la noche para eliminar el colorante libre.
- Usar la ley de Lambert-Beer para cuantificar el% de proteína marcada. Medir la absorbancia a 280 nm y 508 nm en un espectrofotómetro usando una cubeta de cuarzo de volumen apropiado. NOTA: Tenga en cuenta los siguientes coeficientes de absorción molar (M -1 cm -1):
- Calcular la concentración de proteína SBDS-flash marcada usando la ecuación 2.
- Calcular la concentración de proteína total SBDS utilizando la Ecuación 3, sustituyendo el calculado C SBDS-flash de la etapa anterior.
- Calcular el porcentaje de proteína marcada utilizando la ecuación 4.
4. Experimentos de anisotropía de fluorescencia
NOTA: los experimentos de anisotropía se realizaron en un espectrofluorómetro equipado con una caja de herramientas de recogida de polarización y los datos se realizó utilizando el programa de anisotropía proporcionada en el software del equipo. La longitud de onda de excitación se fijó a 494 nm con un ancho de banda espectral de 8 nm y la emisión se registró usando un filtro de paso de banda de 530 ± 25 nm. Las mediciones se realizaron a 25 ° C en una cubeta de 200 l con una longitud de la trayectoria 5 mm 10.
- En una cubeta de fluorescencia, colocar 200 l de 30 nm SBDS intermitencias en tampón de anisotropía y se valora 2 l de EFL1 30 mM. Mezclar bien y dejar reposar la reacción durante 3 minutos antes de medir el valor de anisotropía.
- Repita el paso 4.1 hasta un volumen total de 40 l de EFL1 se ha añadido.
Análisis 5. Datos
- Ajustar los datos al modelo de unión apropiada usando un algoritmo de regresión de mínimos cuadrados no lineal. Las ecuaciones para los modelos de unión más comunes se presentan en la Tabla 1.
- Evaluar el mejor modelo que describe la interacción entre las proteínas mediante la inspección de los residuos de la forma 23. Apoyar el modelo elegido con experimentos adicionales.
Tabla 1. Modelos de unión común la interacción proteína-proteína y las ecuaciones matemáticas que los describen.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla. 
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Representative Results
Para llevar a cabo cualquier experimento anisotropía es importante para descartar grandes cambios en la intensidad de fluorescencia del fluoróforo ya que la anisotropía observada de una mezcla de especies está representada por la Ecuación 5:
donde F i representa la fluorescencia fraccional de cada componente y r i es la anisotropía correspondiente. La fluorescencia fraccional de cada componente depende tanto, su concentración y su fluorescencia relativa, que se define por la ecuación 6:
donde X i representa la fracción molar de THe i ª especie y Ø i es el rendimiento cuántico de la i-ésima especie.
Por lo tanto, si la intensidad de fluorescencia cambia dramáticamente a lo largo de la titulación es mejor, ya sea medir la formación del complejo como una función del cambio en la señal de fluorescencia y no de la señal de anisotropía, o corregir el valor de anisotropía observada por el ajuste tanto de la intensidad de fluorescencia y la anisotropía datos. La fluorescencia de SBDS-flash hace el cambio no es perceptible tras la unión a EFL1 (Figura 2) lo que sugiere que anisotropía de fluorescencia es adecuado para medir la unión entre las dos proteínas.
Figura 2. La fluorescencia emisión de SBDS-flash al hacer la valoración de concentraciones crecientes de EFL1. Los cambios en la emisión de fluorescencia del fluoróforo son negligible y al azar a lo largo de la titulación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Un ejemplo de la curva obtenida a partir de la valoración de EFL1 a SBDS-Flash de unión anisotropía de fluorescencia se muestra en la Figura 3. Cualitativamente, la forma de la gráfica muestra claramente que las dos proteínas interactúan como se evidencia por un aumento en la señal de anisotropía tras la adición de EFL1. Por otra parte, los valores de anisotropía alcanzaron una meseta que sugiere que al final de la titulación toda la proteína SBDS-flash estaba presente en un complejo con EFL1. Es posible, entonces, para describir cuantitativamente la interacción entre estas proteínas y ajustar los datos usando regresión no lineal de mínimos cuadrados a un modelo de unión presunta y obtener la disociación correspondiente constante de equilibrio. Montaje de un modelo de un sitio de unión no hizo appropritamente describir los datos experimentales (Figura 3A). Esto es evidente no sólo desde el rastro de ajuste en la curva de unión, sino también de las desviaciones de los residuos de la forma (la diferencia entre los datos teóricos y experimentales) que son apreciables y no aleatoria. Esto concuerda bien con el hecho de que un único modelo de sitio de unión se describe matemáticamente mediante una curva hiperbólica en lugar de una curva sigmoidal como la observada para los datos experimentales presentados en la Figura 3. Por otra parte, los modelos tales como dos idénticos o dos diferentes de unión sitios describen mejor los datos experimentales y los residuos de la serie sin ajuste de desviación sistemática el apoyo a un modelo de asociación de dos sitios (Figura 3B-C). En ausencia de cualquier otra información experimental es difícil establecer cuál de los dos modelos se corresponde con el mecanismo de unión entre EFL1 y SBDS. Sin embargo, SBDS y EFL1 son dos proteínas monoméricas, por lo que es difficULT prever una idéntica modelo de dos sitios de unión.
. Figura 3. anisotropía de fluorescencia isoterma de unión de la interacción entre EFL1 y SBDS-flash La línea continua en cada una de las parcelas superiores corresponde al ajuste de los datos a diferentes modelos de fijaciones: (A) solo sitio, (B) dos sitios idénticos y (C) dos sitios no idénticos. Parcelas inferiores representan los residuos del ajuste al modelo correspondiente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La mayoría de los experimentos bioquímicos con proteínas requieren no sólo proteína pura, sino también grandes cantidades de ellos, independientemente de la técnica utilizada. Por esta razón, las proteínas utilizadas para este tipo de experimentos se obtienen mediante la expresión heteróloga, como era el caso que aquí se presenta. espectroscopia Florescence requiere la presencia de un fluoróforo en la molécula estudiada. residuos aromáticos constituyen los fluoróforos intrínsecos de una proteína, sin embargo, el uso de su señal para estudiar las interacciones proteína-proteína complica el análisis ya que son comunes a la mayoría de las proteínas y estarían presentes en ambos, la proteína receptora y el ligando. Además, la vida útil de triptófano es demasiado corto para los experimentos de anisotropía de fluorescencia. Por esta razón, es común añadir fluoróforos extrínsecos a una de las proteínas estudiadas. Con este fin, se añadió un fluoróforo al extremo C-terminal de SBDS a través de un enlace de coordinación entre el colorante 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluorescein con un motivo de tetracisteína introducido en la proteína por ingeniería genética. La elección de la proteína que desnuda el fluoróforo no es una cuestión aleatoria. Debido al tamaño de las proteínas estudiadas aquí (SBDS 29 kDa y EFL1 127 kDa), que esperábamos un cambio mayor en la anisotropía entre el libre marcado con SBDS y que en el complejo con EFL1, en comparación con el cambio esperado entre el libre marcado con EFL1 y que unido a SBDS. Teniendo esto en cuenta, una etiqueta de Flash se introdujo en SBDS en lugar de EFL1. Otro parámetro importante a tener en cuenta al configurar un experimento de anisotropía de fluorescencia es la absorción de las soluciones utilizadas. La densidad óptica de la solución en la cubeta no debe ser mayor que 0,1 en la longitud de onda de excitación y emisión, y debe permanecer constante a lo largo de toda la titulación. De lo contrario, el efecto de filtro interno puede interferir en la medición y debe ser corregido para. En el experimento que aquí se presenta, las proteínas estudiadas no absorben a la longitud de onda de excitation o emisión de la 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) colorante de fluoresceína; por lo tanto el efecto de filtro interno no supone un problema.
En cuanto a la recogida de datos, y para encajar posteriormente correctamente los datos, es necesario tener líneas de base inferior y superior bien definidas con varios puntos de datos a través de la transición a lo largo de la curva de unión. De lo contrario, ajuste de los datos es inexacta e información sobre el modo de unión se puede perder. Para describir una curva de unión decente es necesario que la concentración de ligando libre se diferencia por dos unidades logarítmicas debajo y por encima de la constante de disociación, sin embargo, experimentalmente que esto puede ser difícil de lograr. En el límite inferior, problemas con la sensibilidad del equipo pueden surgir en particular cuando la afinidad entre las proteínas es muy alta, mientras que las grandes concentraciones pueden no ser alcanzables debido a problemas de solubilidad del ligando. Esto fue ejemplificado claramente cuando se prueba la interacción entre el SBDSS143L mutante de la enfermedad y EFL1. Este mutante interrumpe la unión a EFL1 hasta tal punto que no era posible obtener una curva de unión adecuada desde EFL1 solamente se puede concentrar hasta 70 mM y la proteína se diluye ≈ 5 veces durante la valoración 10. Por lo tanto, es necesario disponer de una estimación aproximada de la afinidad para optimizar el esquema de titulación y asegúrese de que salta en la concentración de ligando no se producen en las posiciones que podría causar un ajuste menos preciso. Por ejemplo, faltan los puntos iniciales de la curva de unión presenta en la Figura 3 hará que se vea como una hipérbola engañar al investigador hacia un modelo único sitio de unión.
Una vez recogidos, los datos se ajustaron a un modelo de unión presunta. En comparación a la fluorescencia de datos, datos de anisotropía se pueden utilizar sin manipulación adicional y no necesitan corrección para efectos de dilución. Las ecuaciones que se presentan en la Tabla 1 consideran que [L] ≈[L] 0 en cada punto de la valoración. Esto no puede suceder cuando la afinidad entre las proteínas es muy alta de tal manera que en los primeros puntos de la depleción de ligando de valoración se produce. En este escenario, ecuaciones de segundo grado más complejas describen en otra parte 23 se necesitan para ajustar los datos. En el experimento descrito aquí, el EFL1 ligando estaba siempre en gran exceso en comparación con la concentración de SBDS-Flash y el cambio en la concentración EFL1 en cada punto de la titulación puede no tomarse en cuenta. Como se discutió en la sección de resultados, un modelo de dos sitios de unión no idénticos describe mejor los datos experimentales (Figura 3C). información bioquímica adicional obtenido en el grupo apoya la idea de que este es el modelo correcto para describir la interacción entre EFL1 y SBDS (datos no mostrados). Este modo de interacción es común en las proteínas multi-dominio, como EFL1 y SBDS son, y existen varios ejemplos en la literatura 24-26. Sin embargo, es unalso importante descartar una interacción no específica que puede aparecer como un modelo de interacción de los distintos sitios de unión con diferentes afinidades por su ligando. Con este fin, una representación de Scatchard es muy útil. En comparación con otras técnicas, la señal de anisotropía de fluorescencia informa de la cantidad de complejo formado y por lo tanto es posible construir una representación de Scatchard con los datos. Una curva convexa Scatchard sugiere un modelo de dos sitios de unión diferentes con cooperatividad negativa o la unión no específica, mientras que una trama cóncava Scatchard implica un modelo de dos sitios de unión diferentes con cooperatividad positiva o inestabilidad ligando (Figura 4). El análisis de los datos experimentales mostraron una representación de Scatchard con una forma cóncava de soporte el modelo de dos sitios de unión independientes para EFL1 y SBDS (Figura 4D). Además, la cooperatividad positiva se confirmó después de realizar un análisis de la colina que resultó en un valor coeficiente de Hill de 1,8 ± 0,02 (datos no mostrados).
Figura 4. representaciones de Scatchard para modelos diferentes de unión proteína-proteína. (A) sitio de unión únicas o múltiples sitios idénticos que no interactúan. (B) los sitios de unión diferentes múltiples con cooperatividad negativa o la unión no específica. (C) los sitios de unión diferentes múltiples con cooperatividad positiva o inestabilidad ligando. Plot (D) resultante de Scatchard análisis de los datos de anisotropía experimentales obtenidos a partir de la valoración de EFL1 a SBDS-Flash. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La anisotropía de fluorescencia es una técnica cierto equilibrio basado en la solución que requiere las moléculas estudiadas a permanecer en solución en las condiciones ensayadas. Se puede utilizar para estudiar no enly la interacción entre proteínas de longitud completa, sino también a la interacción entre los dominios de proteínas, proteínas mutantes o incluso péptidos con modificaciones post-traduccionales. Además, la anisotropía de fluorescencia también se puede utilizar para medir la unión de las proteínas a las membranas de lípidos utilizando sondas fluorescentes membranas sensibles. Este enfoque ha sido utilizado con éxito para estudiar el efecto que alfa-sinucleína tiene en vesículas sinápticas de embalaje 27. Una de las principales ventajas de la anisotropía de fluorescencia es que proporciona información cuantitativa sobre la unión de las moléculas estudiadas tales que los verdaderos constantes de disociación se pueden obtener junto con la información mecanicista. Aunque otras técnicas biofísicas también pueden ser utilizados para obtener dicha información, anisotropía de fluorescencia requiere pequeñas cantidades de muestra y se puede realizar no sólo en equilibrio, como se presenta aquí, sino también el uso de cinética rápida, tales como fluorometría de flujo detenido, para obtener la asociación y la velocidad de disociaciónconstantes (k encendido y apagado k, respectivamente) 28. Un cuadro comparativo con las ventajas y desventajas de anisotropía de fluorescencia con respecto a otras técnicas biofísicas se presenta en la Tabla 2. Todos los métodos descritos son técnicas verdadero equilibrio, ya que ninguno de ellos incluye un proceso de separación mecánica de las fracciones libre y unida. Como se mencionó en la sección de resultados, si la intensidad de fluorescencia de una proteína marcada cambia en gran medida de la interacción, esta propiedad puede entonces ser utilizada para cuantificar la afinidad de la unión. Sin embargo, los cambios en la intensidad de fluorescencia resultantes de la interacción sugieren una posible interferencia del fluoróforo extrínseco en la interacción molecular en sí; a saber, una posible alteración del valor de constante de disociación (K d) de las correspondientes proteínas no marcadas. Como tal, la anisotropía de fluorescencia se puede considerar una técnica menos invasiva que la changes en la intensidad de fluorescencia ya que el primero se debe aplicar cuando la intensidad de la fluorescencia no cambia tras la interacción. En este sentido, aunque se requieren grandes cantidades de la proteína, calorimetría de titulación isotérmica (ITC) puede proporcionar un verdadero valor Kd de la interacción molecular, ya que es un método libre de etiquetas. Por otro lado, la información mecanicista no se obtiene debido a las diferencias en el calor solamente informan sobre la entalpía del proceso y no la cantidad de complejo formado 29.
En comparación, en métodos in vivo, tales como la levadura de dos híbridos o de complementación fragmento ensayos no requieren proteínas purificadas, pero que sólo proporcionan información semi-cuantitativa sobre el modo de unión. A pesar de que en la levadura técnica de dos híbridos es posible expresar la fuerza de los que utilizan unidades Miller de unión, esto no es un verdadero equilibrio factores constantes y muchos fuera del control del investigador puede alterarlo.
Tabla 2. Ventajas y desventajas de las técnicas biofísicas utilizados comúnmente utilizados para estudiar las interacciones proteína-proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla. 
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | Ultra pure |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | This kit contains the dye to label a FlAsH tag |
| Ampiciline | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Formedium | GLU03 | |
| D(+)-Galactose | Formedium | GAL03 | |
| L-Leucine | Formedium | DOC0157 | |
| L-Tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Sodium Chloride |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Magnesium Chloride |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Potassium phosphate dibasic |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Sodium phosphate monobasic |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Yeast extract | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Filtration units | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Membrane Filter | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain |
| Ni2+ affinity column | QIAGEN | 30760 | Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl cation exchanger column | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Size Exclusion column | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Fluorescence cell | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Spectrophotometer | Agilent Technologies | G6860AA | Cary 60 UV-Vis |
| Shaker | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Discontinued | FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction |
| Spectrofluorometer | Olis | No applicable | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
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