Summary
Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD'ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.
Abstract
Protein-protein etkileşimi, bir canlı organizmanın işlevinde önemli bir rol oynamaktadır. bir etkileşim tespit ve doğrulandıktan sonra yapısal ve mekanik düzeyde bunu karakterize etmek gereklidir. Çeşitli biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemler bu amaçla mevcut. Bir fluoroforla işaretlenmiş proteinin floresans yoğunluğu, protein-protein etkileşimi üzerine sabit kaldığı durumlarda Bunlar arasında floresan anizotropi, özellikle kullanılan güçlü bir tekniktir. Bu teknikte, bir florofor ile işaretlenmiş proteinin seçici gelen ışın ile göreceli yönelimine göre florofor bir alt kümesi uyaran bir uygun dalga boyunda dikey olarak kutuplanmış ışık eksite edilir. Ortaya çıkan emisyon ayrıca, dikey ve yatay düzlemlerde ilişki anizotropi (r) tanımlayan bir yönü vardır: r (I VV -I VH) / (I VV + 2I VH), ben VV ve ben = nerede
Introduction
Hücreler sürekli birbirleri ile etkileşim biomacromolecules çok sayıda içerir. Bu ilişki, sinyal iletimi, gen ifadesi ve diğerleri arasında, hücre göçünün düzenlenmesinde işleyişi sorumlu hücre yoluna katılabilir kompleksleri yol açar. bir hücrede meydana gelen tüm protein-protein etkileşimleri interaktom bilinen bir ağ ihtiva eder. Saccharomyces cerevisiae'de de proteinlerin% 70'den fazla etkileşim ortakları 1 sahip olduğu gösterilmiştir. Bir hücrenin interaktom anlamak ve fonksiyonları karmaşıklığı ve canlıların çeşitliliği ilgili bilgileri sağlar. Çeşitli metodolojiler, protein-protein etkileşimlerini belirlemek ve tanımlamak için tarif edilmiştir. Bu tür maya iki-hibrid 2, protein fragmanı tamamlama deneyleri 3, kütle spektrometrisi ve protein microarra bağlanmış afinite saflaştırma 4 olarak koyun yöntemlerle yüksek Farklıys bir etkileşim 5,6 tanımlamak için kullanılır. tespit kez, bunu doğrulamak için gerekli olan ve bu bir vaka ile ayrı ayrı değişebilir. Tipik haliyle, bu deneyler, gen silinmesi veya proteinlerin bir aşırı ifadesi ile etkileşim çifti, örneğin, tek tek üyelerin seviyesinde, etkileşim kendisini kesintiye içerir, ve daha sonra diğer üyesinin özelliklerindeki değişiklik ya da işlev için ideal hücresel düzeyde. Daha sonra, biyo-fiziksel teknikler 7 moleküler düzeyde protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için kullanılır. kalorimetri ve floresan spektroskopi nicelik ve mekanik olarak bunları tarif etmek için kullanılır ise, bu amaca yönelik olarak, protein kompleksleri yapısı X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans ve kriyo-elektron mikroskobu ile tespit edilir.
Bu çalışmada, floresan anizotropi GTPaz EFL1 ve SBD arasındaki etkileşimi karakterize etmek için bir teknik olarak kullanılanS proteini. Bu proteinler, 60S ribozomal alt birim 8 yüzeyinden ökaryotik başlatma faktörünün 6 salınmasını teşvik ederek ribozomların sentezine katılmadığını. SBDS proteini EFL1 guanosin difosfata 10,11 için afiniteye azaltılması için bir guanin nükleotid değişim faktörü olarak Shwachman-Diamond sendromu, 9 ve hareket olarak bilinen bir hastalık mutasyona uğrar. SBD'ler Hastalık mutasyonlar EFL1 ile etkileşimi ortadan kaldırmak ve böylece aktivasyonunu engeller.
Floresans anisotropi yaygın protein peptid veya protein, nükleik asit etkileşimleri incelemek için biyolojik uygulamalarda kullanılır. Bir fluorofor kısmen polarize emisyon polarize ışık sonuçları ile heyecanlı olduğu ilkesine dayanmaktadır. Floresans anisotropi Denklem 1 ile tanımlanır:
Ben VV ve VH nerededikey 12 ışık polarize ile örnek heyecanlı olduğunda dikey olarak (VV) ve yatay (VH) floresan yoğunlukları emisyonu polarize. Floresans anisotropi fluorofor dönme difüzyon hızını etkileyen faktörlere karşı duyarlıdır ve bu nedenle sıcaklık, çözelti viskozitesi ve fluorofor görünür molekül büyüklüğüne bağlıdır. başka protein ve böyle bir değişiklik ile etkileşime girdiğinde bir florofor artar içeren bir proteinin bariz boyutu daha sonra anizotropide bir değişiklik olarak değerlendirilebilir. Daha spesifik olarak, kendi floresan ömrü çözüm göreceli yavaş dönen bir fluorofor nispeten büyük bir anizotropi sergileyecek bu nedenle büyük bir ben VV değeri ve küçük ben VH değerine sahip olacak ve. Onların floresan ömrü hızla göreceli takla fluorophores için, VV ve VH benzer olacaktır ve bunların anizotropi değeri küçük olacaktır 12 (Şekil 1). Buna ek olarak, gürültü ölçümü için iyi bir anizotropi sinyali için, ilgili molekülün dönme korelasyon zaman benzer bir floresan ömrü olan bir flüorofor olması gereklidir. Aksi takdirde, doğru bir kompleks serbest protein arasında ve anizotropi farkı kayıt yapmak mümkün değildir. Örneğin, 100 da düşük molekül ağırlıklı bir bileşiğin bağlanmış örneğin flöresin ve rodamin edildiği gibi 4 nsaniye yakın bir ömür süresi olan bir flüoresan probun anizotropi 0.05. kDa 0.29 olan anizotropi değerini artırır 160 bir moleküle bağlanması; doğru ölçülebilir bir fark. Bunun aksine, olan bir artış, moleküler boyut olarak değişmektedir 65 1.000 kDa bir bağlama reaksiyonda yer kişi aynı flüoresan prob sadece doğru bir şekilde ölçülmesi için çok küçük olan 0,3 0.28 bir anisotropi değişikliği ile sonuçlanacaktır. Bu senaryoda, 400 nsaniye bir ömür boyu bir prob 12 daha uygun olacaktır.
Floresan anizotropi ve prosedürü ölçmek için kullanılan ekipmanın 1. şematik gösterimi Şekil. Bir protein-protein etkileşim deneyi ölçüm floresan anizotropi gerçekleştirmek için kullanılan ekipman şematik gösterimi. Bir etkileşim ortağı bağlanması üzerine artar hızlı ekran küçük anizotropi takla flüoroforlan. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Floresan uygulamaları ele moleküllerin herhangi bir fluorofor varlığını gerektirir. florofor üç türü vardır, protein-protein etkileşimleri incelemek için: 1) proteinleri içinde mevcut triptofan kalıntısı, 2), yeşil flüoresan protein (GFP) ve deriva gibi kimyasal bağlanmış fluorophores ve 3) flüoresan füzyon partnerleritives. Çoğu protein, yapısı bir etkileşimi ölçmek için en kolay yol, ilgili floresans spektrumları değişiklikleri izleyerek veya triptofan artıklarının floresan yoğunluğu değişiklikleri izleyerek, triptofanı kalıntılarına sahip olacak şekilde. Bununla birlikte, triptofan artıklarının analizi karmaşıklaştıran iki protein içinde mevcut olabilir. Bir fluorofor nedeniyle bir etkileşim onun floresan özelliklerini değiştirmek için Öte yandan, bu ya da bağlanma yeri yakınında bulunan gerekiyor ve bu etkileşim kendisi müdahale olabilir. GFP gibi hacimli fluorophores kullanıldığında bu özel dikkat gerektirir. Bu florofor hiçbiri bağlanma çalışmaları için kullanılabilir, bu süreden sonra katılan proteinlerin birine dışsal fluorophores tanıtmak gereklidir. Birçok kimyasal olarak sentezlenmiş fluorophores biri kovalent gibi amin grupları (bir lisin ya da N-terminal yan zincir) ve sistein tiyol grupları olarak reaktif gruplar yoluyla proteinlere bağlanabilir. Fiodoasetamid ve maleimid tiol-reaktif gruplar, 13 ise izotiyosiyanat ve süksinimidil esterlerin ile luorophore türevleri amid grubu ile reaksiyona girer. Floresan uygulamalarda en yaygın olarak kullanılan boya fluoresein türevleri ve rodamin, yeşil boya, kumarinler, BODIPY fluorophores ve Alexa Fluor boyalardır. Piyasada mevcut fluorophores ve bunların kullanımı ayrıntılı bir listesi referanslar 14,15 bulunabilir. Başarılı bir etiketleme için, reaktif grup proteinin yüzeyi ile açık olmalıdır, fakat polipeptidler tipik olarak reaktif işlevsel grupların çok sayıda, mevkiye-özgü modifikasyonu almak çok zordur. Bu çalışmada, ilgili protein, SBDS, birden fazla site etiketleme ile sonuçlanabilir 5 serbest sistein ve 33 lisin bulunmaktadır. Sigara üniforma etiketleme bağlama etkileyebilir ve farklı fluorofor molekülleri bağlanması üzerine farklı floresan yoğunluğu sinyallerini ortaya çıkarabilir olarak veri analizi zorlaştıracaktır. ove içinBu sorunu rcome biz FLASH florofor, 4 'site doğrudan etiket, 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) floresein SBDS proteini kullanılır. Bu motifi X sistein 16,17 dışında herhangi bir amino asit olduğu sekansı CCXXCC oluşan flaş etiketi olarak bilmek dört aralıklı sistein için büyük bir benzerliği olan bir arsenoxide boyadır. Bu Tetracysteine motifi birlikte proteinin genel kat bozulmasını önlemek için, uygun bir bağlayıcı ile genetik mühendisliği ile N- veya proteinin C-terminaline ilave edilmiştir. FLASH boya ve FLASH etiketinin oluşan bir çift ilk hücreler 17 oturma yeri belirli etiket protein için tasarlanmıştır, ancak, aynı zamanda, burada örnek olarak olduğu gibi, in vitro olarak, saflaştırılmış proteinleri etiketlemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, enzimatik stratejiler aynı zamanda, proteinlerin 18 site-spesifik işlevselleştirilmesini sağlamak için geliştirilmiştir.
Bu yazıda floresan anizotropi a yararlılığını açıklarsa aracı protein-protein etkileşimleri incelemek için. niceliksel bilgi deneysel verilerin uyum elde edilebilir ise ciltleme eğri şeklinin basit bir muayene ile değerlendirilebilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SBDS-Flash etiket Protein Ekspresyonu ve Saflaştırılması
Not: anizotropi deneyler için, bir flaş-eklentisi Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, PCR ile kodlama sekansı, insan SBD'ler C-terminaline ilave edilmiştir sekansına karşılık gelir. Bu konstrukt, sentezleme vektörü pRSET-A alt klonlandı ve N-terminali hekzahistidin etiketi (His-tag) kodlayan bir proteini ifade etmek üzere E. coli C41 hücrelerine transforme edildi, sekansı ve bir C-terminus Flash etiket 10 kodlama insan SBDS.
- SBDS-Flaş protein ifadesi
- Yetkili E. Transform Standart bir ısı şok protokolü 19 kullanılarak plazmid pRSET-HisSBDS-Flash ile coli C41 hücreleri. 100 ug / ml ampisilin ile desteklenmiş bir katı Luria-Bertani (LB) ortamı içinde, hücreler plaka. LB katı ortam bileşimin 10 g NaCI, 5 g maya ekstresi, 10 g tripton, 1 L hacminde 20 g agar oluşur.
- 37 ° C 'de kültür dönüştürülmüş bakteriler kadar600 nm'de (600) absorbans 100 ug / ml ampisilin ile desteklenmiş LB sıvı ortam 1 L 0.5-0.7 ulaşır.
- kültüre 0.5 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid eklenerek proteinin ifadesini uyarmak ve tekrar 5 saat boyunca inkübasyona devam edin.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3800 x g'de santrifüj ile bakteriyel bir süspansiyon toplayın. süpernatantı. Bu noktada, -20 ° C'de hücre pelletini depolamak ya da protein saflaştırma için hemen kullanın.
- SBDS-Flaş protein saflaştırma
Not: tüm kromatografi adımları hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) sistemi veya bir peristaltik pompa kullanılarak gerçekleştirilir. Ni2 + -affinity kromatografisi 5 ml hızlı akış kolonu kullanır. Anyonik değiştirme kromatografisi, 5 mi, güçlü sülfopropil katyon değiştirici kolon kullanılmıştır. 3 ml / dakika akış hızı, tüm kromatografi adımları için kullanıldı.- SBDS Lizis B 35 ml hücrelerin tekrarUffer 4 dk 10 saniye ve 30 saniye arasında çevrimleri kullanılarak bir toplam süre için sonikasyon ile 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve parçalanmasıyla ile takviye (50 mM fosfat tamponu pH 7.5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol), 4, ° C.
- 4 ° C'de 50 dakika boyunca 9000 x g'de santrifüjleyin.
- süpernatant tutun ve hücresel enkaz kaldırmak için pelet atın.
- SBDS Lizis tamponunun 3 sütun hacmi (CV) ile Ni 2+ afinite sütunu dengelenmesi ve kolona süpernatan açıklık bütün getirmektedir.
- SBDS lizis tamponu 3 CV ile yıkanarak bağlanmamış protein çıkarın ve SBDS elüsyon tamponu 3 CV (50 mM fosfat tamponu pH 7.5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol) ile elüte.
- 50 mM fosfat tampon maddesi pH 6.5 ile elüt edilmiştir Protein 6 kat seyreltilir ve 0.22 um selüloz zar içerisinden filtre edilerek mümkün olan agrega kaldırmak.
- Düşük bir tuzu S sütunun 3 CV sülfopropil katyon değiştirme sütunu dengeyetampon maddesi (50 mM fosfat tampon maddesi, pH 6.5, 50 mM NaCI) ve önceki adımda elde edilen protein örnek getirmektedir.
- Yıkama ilişkisiz düşük tuz S kolon tamponu 3 CV malzeme ve 50 mM fosfat tamponu pH 6.5, 1 M NaCI ile tek bir adımda proteinini ayrıştırmak.
- 50 mM fosfat tampon maddesi pH 6.5 ile elüt edilmiştir, protein 3.3 kat seyreltilir. 15 dakika boyunca 3800 x g'de santrifüj ile ultrafiltrasyon cihazları ile protein konsantre edilir. Sıvı nitrojen içinde protein dondurma ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
- SDS-PAGE analizi ve Coomassie boyama ile 20 proteinin saflığını teyit.
2. EFL1 Protein Expression and Purification
NOT: EFL1 Gal 1/10 farklı promotör 21 ve vektör pRS426 içinde Saccharomyces cerevisiae MAT A 3'UTR'sinden düzenlemesi altında ifade edildi. Rekombinant protein, bir Tütün Etch Virüsü proteaz birleştirilmiş insan EFL1 izoformunu 1 (kodlarTEV) tanıma alanı, ve C-terminalinde bir hekzahistidin etiketi.
- EFL1 protein ekspresyonu
- S. Transform Standart bir lityum asetat ile protokolü 22 kullanılarak plazmid pRS426-EFL1TevHis ile cerevisiae BCY123 hücreleri. % 2 (a / h) glukoz ile desteklenmiş urasil (SD-Ura) olmadan ortam üzerinden sentetik damla tüm dönüştürülmüş hücreler plaka. SD-ura oluşan kompozisyon, amino asitler olmadan 8 g maya nitrojen bazı, 11 g kasamino asitleri, 55 g adenin sülfat, 55 g tirosin, 60 mg lösin ve 1 L hacminde 60 mg triptofan içerir.
- 600% 0.5 (a / h) glukoz ile desteklenmiş SD-ura 1.8 1 L ulaşıncaya kadar Kültür, 30 ° C 'de maya dönüştürdü.
- kültüre galaktoz (ağ / hac)% 2.8 eklenerek proteinin ifadesini uyarmak ve 30 ° C de 18 saat inkübasyona devam edin.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3800 x g'de santrifüjleme ile, maya süspansiyonu toplanır. süpernatantı.Bu noktada, -20 ° C'de hücre pelletini depolamak ya da protein saflaştırma için hemen kullanın.
- EFL1 protein saflaştırma
Not: tüm kromatografi adımları bir FPLC sistemi veya peristaltik bir pompa kullanılarak gerçekleştirilir. Ni2 + -affinity kromatografisi / dakika 3 ml bir akış oranında bir 5 ml hızlı akış kolonu kullanır. Ebat eksklüzyon kromatografisi 125 ml kolon, 1 ml / dk'lık bir akış oranında Superdex 200 reçinesi ile önceden paketlenmiş kullanır.- , 1 mM PMSF ve 1 mM benzamidin ile takviye EFL1 lisiz tamponu (50 mM Tris-HCI, pH 8, 300 mM NaCI, 20 mM imidazol, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol), 50 ml hücrelerin tekrar tarafından hücrelerin bozulması 4 ° C'de, 2 dak ve KAPALI 15 dakika için 6 dakika ile döngü, toplam zaman cam boncuk (çap = 0.5 mm) kullanılarak bir kordon çırpıcı sürtünme.
- 4 ° C'de 50 dakika boyunca 9000 x g'de santrifüjleyin.
- süpernatant tutun ve hücresel enkaz kaldırmak için pelet atın. EFL1 lizis tamponu 3 CV Ni2 + afinite sütunu dengeye ve sütun üzerine tüm berrak yüzer getirmektedir.
- EFL1 lizis tamponu 3 CV ile yıkanarak bağlanmamış protein çıkarın ve EFL1 elüsyon tamponu 3 CV (50 mM Tris-HCI pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol) ile elüte.
- Anizotropi tamponu 1.5 CV (50 mM Tris-HCI pH 7.5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol, 5 mM β-merkaptoetanol) ile ebat eksklüzyon kolonu dengelenmesi.
- 1 ml istenen hacme 3,800 x g'de santrifüj ile ultrafiltrasyon cihazları ile Ni2 + afinite sütunundan elüt EFL1 proteini için konsantre edilir. Boyut dışlama kolonundan ilgili örnek tanıtılması.
- Tasfiye edilen proteini toplamak ve yaklaşık 30 uM'lik nihai bir konsantrasyona kadar ultrafiltrasyon yoluyla konsantre edilir. Flaş sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza protein dondurma. th doğrulayınSDS-PAGE analizi ve Coomassie boyama ile 20 protein e saflık.
Flaş Floresan Boya 4 ', 5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) Floresein ile SBDS-FLASH 3. Etiketleme
- , 4 '3 nmol olan 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) Anizotropi tamponu, 5 ul hacminde Floresein boyası SBDS-Flash proteininin 3 nmol karıştırın.
- Reaksiyon, 4 ° C 'de 8 saat boyunca sürmesine izin verin. ücretsiz boya kaldırmak için gece boyunca anizotropi tampona karşı örnek dialyze.
- etiketli proteinin% ölçmek için Lambert-Beer yasası kullanın. 280 nm ve uygun hacimde bir kuartz küvet kullanarak bir spektrofotometre ile 508 nm'de absorbansı ölçülür. NOT: Aşağıdaki molar soğurma katsayıları (M -1 cm -1) düşünün:
- Denklem 2 kullanılarak etiketli SBDS-FLASH protein konsantrasyonu hesaplayın.
- Önceki adımdaki hesaplanan C SBDS-Flaş ikame ederek Denklem 3 kullanılarak toplam SBDS protein konsantrasyonu hesaplayın.
- Denklem 4 kullanılarak etiketli protein yüzdesini hesaplayın.
4. Floresan Anizotropi Deneyleri
Not: Anizotropi deneyleri, bir polarizasyon araç kutusu ve veri toplama aracı arasında yazılım Resim anizotropi programı kullanılarak yapıldı ile donatılmış bir spektrofotometreyi yapıldı. Eksitasyon dalga boyu 8 nm spektral bant genişliği ile 494 nm'de ve emisyon 530 ± 25 nm bant-geçiş filtresi kullanılarak kaydedildi. Ölçümler, 5 mm yol uzunluğu 10 ile 200 ul küvet içinde, 25 ° C de yapıldı.
- Bir floresan küvet içinde, anizotropi tamponunda 30 nM SBDS-FLASH 200 ul koyun ve 30 uM EFL1 2 ul titre. İyice karıştırın ve reaksiyon anizotropi değerinin ölçülmesi önce 3 dakika bekletin.
- EFL1 40 ul toplam hacme kadar adımı tekrar 4.1 eklenmiştir.
5. Veri Analizi
- Bir doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon algoritması kullanılarak uygun bağlanma modeline veri monte edin. En yaygın bağlayıcı modelleri için denklemleri Tablo 1'de sunulmuştur.
- Uygun 23 artıklar inceleyerek proteinler arasındaki etkileşimi açıklar iyi modeli değerlendirin. Ek deneyler ile seçilen modelini desteklemektedir.
Tablo 1. Ortak protein-protein etkileşim bağlayıcı modelleri ve onları tanımlayan matematiksel denklemler.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Herhangi bir anizotropi deneyi gerçekleştirmek için türlerin bir karışımı gözlenen anizotropi Denklem 5 ile temsil edilir çünkü fluorofor floresan yoğunluğu büyük değişiklikler ekarte etmek önemlidir:
F i her bir bileşenin ve r fraksiyonel floresan temsil nereye i gelen anizotropi olduğunu. Her bileşenin fraksiyonel floresans, hem de bağlı Denklem 6 tarafından tanımlanan konsantrasyonu ve nispi floresan:
X i th mol fraksiyonu temsil edere i madenî inci i kuantum verimi türünden ve Ø inci.
Floresan yoğunluğu titrasyonu boyunca büyük ölçüde değişir Böylece, olup anizotropi sinyalinin flüoresan sinyalinde değişiklik bir fonksiyonu olarak kompleks oluşumunu ölçer veya flüoresan yoğunluğu ve anizotropi hem oturtulmasıyla gözlenen anizotropi değeri düzeltmek için, ya daha da veri. SBDS-Flash floresan o floresan anizotropi iki protein arasındaki bağlanmayı ölçmek için yeterli olduğunu düşündüren (Şekil 2) EFL1 bağlandıktan sonra değil gözle görülür bir değişiklik yok.
EFL1 artan konsantrasyonlarının titrasyonu üzerine SBDS-FLASH Şekil 2. Floresans emisyon. Fluorofor floresan emisyon değişiklikler negligibl olanE ve titrasyon boyunca rastgele. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
SBDS-Flash için EFL1 titrasyonu elde edilen bağlanma eğrisi flüoresan anizotropi bir örneği Şekil 3'te gösterilmektedir. Kalitatif olarak, grafik şekil açık bir şekilde eklenmesi üzerine anizotropi sınyalındekı bir artışla kanıtlandığı gibi, iki proteinin etkileşim olduğunu göstermektedir EFL1. Ayrıca, anizotropi değerleri titrasyon sonunda tüm SBDS-FLASH proteini EFL1 ile bir kompleks içinde mevcut olduğunu düşündüren bir platoya ulaştı. Bu kantitatif bu proteinler arasındakı etkileşimi tarif ve varsayılan bir bağlanma modeline doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon verilerine uyacak ve ilgili ayrışma sabiti denge elde etmek için, mümkün olmaktadır. bir bağlama sahası modeline takılması ödenek değildiulaştırılması Deneysel veriler (Şekil 3A) tarif eder. Bu bağlayıcı eğri uydurma iz değil, aynı zamanda kayda değer ve rastgele olmayan olan uyum (teorik ve deneysel veriler arasındaki fark) ve artıklarının sapmalar değil sadece açıktır. Bu, tek bir bağlama sahası modeline hiperbolik bir eğri yerine, Şekil 3'te sunulan deneysel verileri için gözlenenin bir çift kıvrımlı bir eğri matematiksel olarak tarif edilmektedir gerçeği ile de kabul eder. Diğer taraftan, modeller, aynı iki ya da iki farklı bağlanma olarak siteler deneysel veriler ve fit göstermek artıklar iki site dernek modeli (Şekil 3B-C) destekleyen hiçbir sistematik sapma daha iyi açıklar. başka bir deney bilgi yokluğunda EFL1 ve SBD'ler arasında bağlayıcı mekanizmaya karşılık gelen iki model, hangi koymak güçtür. Bununla birlikte, SBDS ve EFL1 hem monomerik proteinlerdir, yani diffic olduğuULT iki özdeş bağlanma yerleri modeli tasavvur etmek.
. (A) tek bir site, (B) iki özdeş siteler: EFL1 ve SBDS-FLASH arasındaki etkileşimin Şekil 3. Floresan anizotropi bağlayıcı izoterm üst parsellerin her sürekli hat farklı bağlama modelleri verilerin uyum tekabül ve (C) olmayan iki özdeş siteleri. Alt araziler, ilgili modele uyum artıklar temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
proteinleri ile en biyokimyasal deneyler kullanılan tekniğe bakılmaksızın, saf protein değil, aynı zamanda onların büyük miktarlarda sadece gerektirir. Burada sunulan olduğu gibi, bu nedenle, bu deney türü için kullanılan proteinler, heterolog ekspresyonu ile elde edilir. Floresans spektroskopisi çalışılan molekül içinde bir florofor varlığını gerektirmektedir. en çok protein için ortak olan ve her ikisi de mevcut olacağından aromatik artıklar, protein-protein etkileşimleri incelemek için analiz, sinyal zorlaştırmaktadır kullanılarak, ancak, bir proteinin yapısal fluorophores oluşturan reseptör proteini ve ligand. Buna ek olarak, triptofan süresi flüoresan anizotropi deneyleri için çok kısadır. Bu nedenle, çalışılan protein birine dışsal florofor ilave etmek yaygın uygulamadır. Bu amaçla, bir florofor boya 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) f arasında bir koordinasyon bağı vasıtasıyla SBD'ler C-terminaline ilave edilmiştirgenetik mühendisliği yoluyla protein tanıtılan bir Tetracysteine motifli luorescein. fluorofor bares protein seçimi rastgele meselesi değildir. Nedeniyle (SBDS 29 kDa ve EFL1 127 kDa) bu çalışmada protein boyutuna, serbest etiketli-EFL1 ile beklenen değişikliğe göre, EFL1 ile kompleks daha büyük bir serbest-etiketli SBDS ile anizotropide değişim ve beklenen SBDS bağlandı. Bu düşünceden hareketle, bir Flash etiket SBD'ler içine ziyade EFL1 tanıtıldı. Bir floresan anizotropi denemesi kurma kullanılan çözümlerin emme olduğunda önemli başka bir parametre dikkate. küvet içinde çözeltinin optik yoğunluğu eksitasyon ve emisyon dalga boyunda 0.1'den daha büyük olmamalıdır ve tüm titrasyon boyunca sabit kalmalıdır. Aksi takdirde, iç filtre efekti ölçümünde etkileyebilir ve için düzeltilmesi gerekir. Burada sunulan deneyde, çalışılan proteinler excitat bir dalga boyunda absorbe yokiyon ya da 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il), fluoresein boyası emisyon; böylece iç filtre efekti bir sorun teşkil etmez.
veri toplama ile ilgili olarak, ve daha sonra düzgün veri sığdırmak için, bağlayıcı eğri boyunca geçiş yoluyla çeşitli veri noktaları ile iyi tanımlanmış alt ve üst taban olması gereklidir. Aksi takdirde, veri uydurma yanlış ve bağlanma modunu ilişkin bilgiler kaybolmuş olabilir. serbest ligandın konsantrasyonu altındaki iki logaritmik birimler ve ayrışma sabiti üzerinde farklı olması gereklidir iyi bir bağlanma eğrisini tanımlamak için, ancak, deneysel olarak, bu elde etmek zor olabilir. proteinler arasındaki afinite çok yüksek olduğunda büyük konsantrasyonları nedeniyle ligand çözünürlük sorunları ulaşılabilir olmayabilir iken alt limit olarak, ekipman duyarlılığı ile sorunlar, özellikle ortaya çıkabilir. SBDS arasındaki etkileşimi test, bu açık bir şekilde örneklenmiştirS143L hastalığı mutantı ve EFL1. Bu mutant EFL1 sadece 70 uM kadar konsantre edilebilir ve protein titrasyon 10 sırasında 5 kat ≈ seyreltilmiş alır çünkü uygun bir bağlanma eğrisi elde etmek mümkün değildi bir düzeye kadar EFL1 bağlanma bozulur. Bu nedenle, titrasyon düzeni optimize etmek ve daha doğru bir uyum neden olacak konumlarda oluşmaz ligand konsantrasyonu atlar olduğundan emin olmak için bir yakınlık kaba bir tahmin yapmak gereklidir. Örneğin, Şekil 3'te sunulan bağlama eğrisinin ilk noktaları eksik tek bir bağlanma yeri modeline doğru araştırmacı yanıltıcı bir hiperbol gibi görünmesini sağlayacaktır.
Toplanan sonra, verilerin bir tahmin bağlanma modeline monte edildi. veri floresan karşılaştırıldığında, anizotropi veriler başka işlemler olmadan kullanılabilir ve seyreltme etkilerinin düzeltilmesi gerek yoktur. Tablo 1 'de sunulmaktadır denklemler düşünün [L] ≈Titrasyon her noktada [L] 0. proteinler arasındaki afinite titrasyon ligand tükenmesi ilk noktalarında meydana böyle çok yüksek olduğunda bu durum olmayabilir. Bu senaryoda, daha karmaşık karesel denklemler başka 23 verileri uygun olarak gerekli olan tarif edilen. Burada tarif edilen deney, ligand EFL1 göz ardı edilebilir SBDS-Flash konsantrasyonu ve titrasyon her noktada EFL1 konsantrasyon değişikliği ile karşılaştırıldığında daha büyük miktarda zaman olmuştur. Sonuçlar bölümünde belirtildiği gibi, bir, iki özdeş olmayan bağlanma yerleri modeli en iyi deneysel veriler (Şekil 3C) uygulanır. grubunda elde Ek biyokimyasal bilgiler bu EFL1 ve SBD'ler arasındaki etkileşimi tanımlamak için doğru bir model olduğu fikrini desteklemektedir (veriler gösterilmemiştir). Etkileşim Bu mod EFL1 ve SBD'ler olarak çok etki alanı proteinler vardır yaygındır ve çeşitli örnekler literatürde 24-26 var. Bununla birlikte, bironların ligand için farklı afinite ile farklı bağlanma sitelerinin etkileşim modeli olarak görünebilir bir non-spesifik bir etkileşim ekarte etmek için LSO önemli. Bu amaçla, bir Scatchard taslak çok yararlıdır. diğer tekniklere göre, floresan anizotropi sinyali oluşturduğu kompleks miktarını belirler ve bu nedenle veri ile Scatchard çizimi oluşturmak mümkündür. Içbükey Scatchard çizimi pozitif bir birliktelik veya ligand instabilite (Şekil 4) ile birlikte, bir, iki farklı bağlanma yerleri modeli ima ederken Dışbükey Scatchard eğrisi negatif işbirliğinden veya spesifik olmayan bir, iki farklı bağlanma yerleri modeli göstermektedir. Deneysel verilerin analizi EFL1 ve SBD'ler (Şekil 4D) için iki bağımsız bağlanma sitelerinin modeli destekleyen bir içbükey şekilli bir Scatchard çizimi göstermektedir. Ayrıca, pozitif bir birliktelik 1.8 ± 0.02 Hill katsayısı değeri sonucunda Tepesi analizi işleminden sonra doğrulanmıştır (veriler gösterilmemiştir).
Farklı protein-protein bağlanma modelleri için Şekil 4. Scatchard çizimleri. (A) Tek bağlanma yeri veya etkileşim yok birden fazla özdeş siteleri. (B) negatif işbirliğinden veya spesifik olmayan bağlanma ile birden çok farklı bağlanma siteleri. (C) pozitif işbirliğinden veya ligand istikrarsızlık ile birden çok farklı bağlama siteleri. SBDS-Flash To EFL1 titrasyonu elde edilen deneysel anizotropi verilerinin analizinden elde edilen (D) Scatchard çizimi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Floresans anisotropi test koşullarında çözelti içinde kalmasını incelenen molekülleri gerektiren bir solüsyon bazlı, gerçek denge tekniktir. Değil üzerinde çalışmak için kullanılabilirly tam uzunlukta proteinler, aynı zamanda post-translasyonel modifikasyonlar protein alanları, mutant proteinlerin ya da peptidlerin arasındaki etkileşim arasındaki etkileşim. Ayrıca, flüoresan anizotropi, flüoresan hassas membran problar kullanılarak lipid zarlar proteinlerin bağlanmayı ölçmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım başarılı a-sinüklein sinaptik vezikül 27 paketleme üzerindeki etkisini incelemek için kullanılır olmuştur. floresan anizotropi önemli avantajlarından biri gerçek ayrılma sabitleri mekanistik bilgilerle birlikte elde edilebilir şekilde çalışılan moleküllerin bağlanma ile ilgili nicel bilgiler sağlamasıdır. Diğer biyo-fiziksel teknikler de bu bilgileri elde etmek için kullanılabilir, ancak flüoresan anizotropi numunenin küçük miktarlarda gerektirir ve burada verilen gibi sadece dengede olmayan yapılabilir, ama aynı zamanda bir ilişki elde edilir, bu durdu akış fluorometri gibi hızlı kinetik kullanılarak ve ayrılma oranısabit (sırasıyla, kon ve koff) 28. Yararları ve diğer biyofizik tekniklere göre floresan anizotropi dezavantajları karşılaştırmalı tablo Tablo 2'de sunulmuştur. Açıklanan tüm yöntemler gerçek denge teknikleri bunların hiçbiri serbest ve bağlı fraksiyonların mekanik ayrılık süreci içerir çünkü. Sonuçlar bölümünde belirtildiği gibi, bir işaretlenmiş proteinin floresan yoğunluğu büyük ölçüde etkileşimi üzerine değişirse, bu tesis, daha sonra bağlanma afinitesini ölçmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, etkileşimden kaynaklanan flüoresan yoğunluğundaki değişimlerle moleküler etkileşim kendisinde dışsal floroforun olası parazit göstermektedir; yani karşılık gelen etiketli olmayan proteinlerin ayrılma sabiti (Kd) değeri olası bir değişiklik. Bu şekilde, floresans anisotropi CH göre daha az yıkıcı bir teknik olarak kabul edilebilirFloresan yoğunluğu etkileşimi üzerine değişmez zaman, eski uygulanmalıdır çünkü floresan anges. Protein büyük miktarlarda gerekli olsa bir etiket içermeyen bir yöntemdir çünkü bu anlamda, İzotermal Titrasyon Kalorimetre (ITC) moleküler etkileşim gerçek bir Kd değeri sağlayabilir. Isı farklılıkları, sadece sürecin entalpi rapor ve karmaşık değil miktarı 29 oluşmuş çünkü Öte yandan, mekanik bilgi elde edilemez.
Karşılaştırma olarak, bu tür saflaştırılmış proteinler ama sadece bağlanma modu yarı kantitatif olarak gerektirmeyen maya iki-hibrid veya fragman tamamlama deneyleri gibi in vivo yöntemlerinde kullanılabilir. maya iki hibrit tekniğinde bağlayıcı kullanılarak Miller birimlerinin gücünü ifade etmek mümkün olmasına rağmen, bu araştırmacının kontrolü dışında sürekli ve birçok faktör bunu değiştirebilir gerçek bir denge değil.
Tablo 2. Avantajları ve protein-protein etkileşimleri incelemek için kullanılan yaygın olarak kullanılan biyofiziksel tekniklerin dezavantajları. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | Ultra pure |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | This kit contains the dye to label a FlAsH tag |
| Ampiciline | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Formedium | GLU03 | |
| D(+)-Galactose | Formedium | GAL03 | |
| L-Leucine | Formedium | DOC0157 | |
| L-Tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Sodium Chloride |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Magnesium Chloride |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Potassium phosphate dibasic |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Sodium phosphate monobasic |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Yeast extract | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Filtration units | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Membrane Filter | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain |
| Ni2+ affinity column | QIAGEN | 30760 | Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl cation exchanger column | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Size Exclusion column | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Fluorescence cell | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Spectrophotometer | Agilent Technologies | G6860AA | Cary 60 UV-Vis |
| Shaker | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Discontinued | FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction |
| Spectrofluorometer | Olis | No applicable | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
References
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).
- Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11 (12), 848 (2015).
- Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
- Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).
- Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).
- Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).
- Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Third, Springer US. (2010).
- Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
- Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
- Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , Wiley. (2015).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
- Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
- Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).
- Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).
- Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).
- Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
- Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
- Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).
