Summary
تفاعلات البروتين هي في صميم وظيفة الخلية. وتستخدم تقنيات مقياس الكالوري والطيفية عادة لوصف لهم. نحن هنا وصف تباين مضان كأداة لدراسة التفاعل بين البروتين تحور في متلازمة شوان دايموند (SBDS) والاستطالة عامل مثل 1 GTPase (EFL1).
Abstract
تفاعلات البروتين البروتين دورا أساسيا في وظيفة الكائن الحي. مرة واحدة تم التعرف على التفاعل والتحقق من صحتها من الضروري أن نصنفها على المستوى الهيكلي والميكانيكي. وتوجد العديد من الطرق الحيوية والفيزيائية الحيوية لهذا الغرض. من بينها، مضان تباين هي تقنية قوية تستخدم بشكل خاص عندما تبقى كثافة مضان من البروتين المسمى fluorophore ثابتة على التفاعل البروتين البروتين. في هذه التقنية، وهو بروتين المسمى fluorophore هو متحمس مع الضوء المستقطب عموديا من الطول الموجي المناسب أن يثير انتقائي مجموعة فرعية من fluorophores وفقا لتوجه النسبي مع شعاع واردة. لديه الانبعاثات الناتجة أيضا الاتجاهية التي تعرف تباين (ص) العلاقة في الطائرات العمودية والأفقية على النحو التالي: ص = (أنا VV -I VH) / (أنا VV + 2I VH)، حيث كنت VV وأنا
Introduction
الخلايا تحتوي على العديد من الجزيئات الكبيرة التي تتفاعل باستمرار مع بعضها البعض. هذا الارتباط يثير المجمعات التي تشارك في مسارات الخلوية المسؤولة عن عملها في نقل الإشارة، وتنظيم التعبير الجيني وهجرة الخلايا وغيرها. تشمل جميع التفاعلات البروتين البروتين التي تحدث في خلية شبكة تعرف باسم interactome. في خميرة الخباز وقد تبين أن أكثر من 70٪ من البروتينات لدينا شركاء التفاعل 1. فهم interactome من خلية وتوفير وظائف لهم المعلومات ذات الصلة على مدى تعقيد وتنوع الكائنات الحية. وقد وصفت عدة منهجيات لتحديد وتوصيف التفاعلات البروتين البروتين. تختلف عالية من خلال طرق وضع مثل الخميرة اثنين الهجين 2، البروتين جزء المقايسات تكامل 3، تقارب تنقية 4 بالإضافة إلى قياس الطيف الكتلي وmicroarra البروتينتستخدم يس لتحديد التفاعل 5،6. وبمجرد تحديدها، فمن الضروري التحقق من صحة ذلك، وهذا قد تختلف على أساس كل حالة على حدة. عادة، هذه التجارب تنطوي على تعطيل التفاعل نفسه في مستوى أفراد الزوج التفاعل، على سبيل المثال، عن طريق حذف الجينات أو overexpression من واحد من البروتينات، وبعد ذلك تبحث عن التغيرات في خصائص أو وظيفة عضو آخر في المستوى الخلوي. وفي وقت لاحق، وتستخدم التقنيات الفيزيائية الحيوية 7 لوصف التفاعل البروتين البروتين على المستوى الجزيئي. تحقيقا لهذه الغاية، ويتم تحديد بنية البروتين المجمعات التي كتبها البلورات بالأشعة السينية، الرنين المغناطيسي النووي والفحص المجهري البرد الإلكترون في حين تستخدم الكالوري ومضان الطيفي لكميا وميكانيكيا وصفها.
في هذا العمل، وقد استخدم مضان تباين كأسلوب لوصف التفاعل بين GTPase EFL1 وSBDS البروتين. تشارك هذه البروتينات في تركيب الريبوسومات من خلال تشجيع إطلاق سراح حقيقية النواة عامل بدء 6 من سطح 60S الوحيدات الريباسي 8. وتحور البروتين SBDS في المرض المعروف باسم Shwachman الماس متلازمة 9 و بمثابة عامل الصرف جوانين النوكليوتيدات لEFL1 انخفاض تقارب من أجل غوانوزين ثنائي فسفات 10،11. الطفرات المرض في SBDS تلغي التفاعل مع EFL1 وبالتالي تمنع تفعيله.
يستخدم مضان تباين شيوعا في التطبيقات البيولوجية لدراسة بروتين الببتيد أو تفاعلات حمض البروتين النووي. لأنه يقوم على مبدأ أن fluorophore منتهى السعادة لعودته وكانت النتائج الضوء المستقطب في انبعاث الاستقطاب جزئيا. ويعرف تباين مضان من المعادلة 1:
حيث أنا VV وأنا VH هيشدة مضان من عموديا (VV) وأفقيا (VH) الاستقطاب الانبعاثات عند العينة هو متحمس مع الاستقطاب عموديا ضوء 12. مضان تباين حساسة للعوامل التي تؤثر على معدل انتشار التناوب من fluorophore ويعتمد على درجة الحرارة، واللزوجة من الحل وحجم الجزيئي واضح من fluorophore الآن. حجم واضح من البروتين تحتوي على زيادات fluorophore عندما يتفاعل مع بروتين آخر وهذا التغيير ومن ثم يمكن تقييمها على أنها تغير في الخواص المتباينة. وبشكل أكثر تحديدا، فإن fluorophore التي تدور ببطء في حل قريب لعمر الفلورسنت التي يكون لها قيمة أنا VV الكبيرة والصغيرة القيمة أنا VH وبالتالي ستعرض على تباين واسع نسبيا. لfluorophores أن تعثر بسرعة بالنسبة لحياتهم الفلورسنت، وأنا VV وأنا VH تكون مشابهة وسوف قيمة تباين على أن تكون صغيرة 12 > (الشكل 1). وبالإضافة إلى ذلك، إشارة تباين جيدة لقياس الضوضاء، فمن الضروري أن يكون هناك fluorophore مع عمر مضان مماثل للوقت ارتباط التناوب للجزيء من الفائدة. خلاف ذلك، فإنه ليس من الممكن أن يسجل بدقة الفرق في تباين بين البروتين مجانا وأنه في المجمع. على سبيل المثال، وتباين في تحقيق الفلورسنت مع عمر قريب من 4 NSEC مثل فلوريسئين أو رودامين تعلق على انخفاض الوزن الجزيئي مجمع 100 دا هو 0.05. ملزمة لجزيء من 160 كيلو دالتون وزيادة قيمة تباين ل0.29. الفرق التي يمكن قياسها بدقة. في المقابل، فإن نفس التحقيق الفلورسنت تشارك في رد فعل ملزم الذين الزيادة في حجم الجزيئي يختلف من 65 إلى 1000 كيلو دالتون يؤدي إلا إلى تغيير تباين من ،28-،3، التي هي صغيرة جدا بحيث لا يمكن قياسها بدقة. في هذا السيناريو، فإن التحقيق مع عمر من 400 NSEC أن يكون أكثر مناسبة 12.
الطبقة = "jove_content"> 
الشكل 1. تمثيل تخطيطي من المعدات المستخدمة لقياس تباين مضان والإجراء. تمثيل تخطيطي من المعدات المستخدمة لإجراء البروتين البروتين التفاعل التجربة قياس تباين مضان. Fluorophores أن تعثر سريع عرض تباين الصغيرة التي يزيد عليها ملزمة لشريك التفاعل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تتطلب التطبيقات مضان وجود fluorophore في أي من الجزيئات التي شملتها الدراسة. لدراسة تفاعلات البروتين البروتين هناك ثلاثة أنواع من fluorophores: 1) بقايا التربتوفان موجودة في البروتينات، 2) fluorophores تعلق كيميائيا و 3) شركاء الانصهار فلوري مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وderiva لهاالأقارب. معظم البروتينات لها بقايا التربتوفان على هيكلها، وبالتالي فإن أسهل طريقة لقياس التفاعل هو عن طريق رصد التغيرات في أطياف مضان المقابلة أو عن طريق رصد التغيرات في كثافة مضان من بقايا التربتوفان. ومع ذلك، قد تكون بقايا التربتوفان الحالي في كل من البروتينات تعقيد التحليل. من ناحية أخرى، لfluorophore لتغيير خصائص فلوري لها بسبب التفاعل فإنه يحتاج إلى أن يكون موجودا على أو بالقرب من موقع ملزمة وأنها يمكن أن تتداخل مع التفاعل نفسها. هذا يحتاج إلى عناية خاصة عند استخدام fluorophores ضخمة مثل GFP. إذا كان أي من هذه fluorophores يمكن استخدامها لدراسات ملزمة من الضروري، بعد ذلك، إلى إدخال fluorophores خارجي إلى واحد من البروتينات ذات الصلة. وجود العديد من fluorophores تصنيعه كيميائيا ويمكن أن تعلق تساهمي للبروتينات من خلال مجموعاتهم التفاعلية مثل المجموعات أمين (سلسلة من الجانب lysines أو N-محطة) ومجموعة ثيول في السيستين. Fالمشتقات luorophore مع ثيوسيانات وsuccinimidyl استرات تتفاعل مع مجموعة أميد في حين iodoacetamide وmaleimide مجموعات ثيول-رد الفعل (13). الأصباغ الأكثر شيوعا في التطبيقات مضان هي مشتقات من فلوريسئين والأصباغ الخضراء رودامين، الكومارين، fluorophores BODIPY والأصباغ اليكسا فلور. ويمكن الاطلاع على قائمة مفصلة من fluorophores المتاحة تجاريا واستخدامها في المراجع 14،15. لوضع العلامات ناجحة، يجب أن تتعرض لمجموعة رد الفعل على سطح البروتين، ولكن نظرا لوجود عدد كبير من المجموعات الوظيفية على رد الفعل الحالية عادة في البروتينية من الصعب جدا الحصول على تعديل للموقع المحدد. البروتين من الاهتمام في هذه الدراسة، SBDS، ويحتوي على 5 cysteines مجانية و 33 lysines التي قد تؤدي إلى العديد من العلامات الموقع. وضع العلامات غير موحدة قد يؤثر على ملزمة وسيعقد تحليل البيانات والجزيئات fluorophore المختلفة قد تثير مختلفة إشارات كثافة الفلورسنت على ملزمة. لاوفهrcome هذه المشكلة، استخدمنا fluorophore فلاش، 4، 5'مكرر (1،3،2 dithioarsolan-2-YL) فلوريسئين لتسمية المباشر الموقع البروتين SBDS. هذا هو صبغ أرسينوكسيد مع قابلية عالية لمدة أربعة cysteines متباعدة في عزر تعرف باسم فلاش العلامة تتكون من CCXXCC تسلسل حيث X هو أي حمض أميني غير السيستين 16،17. يضاف هذا الحافز tetracysteine إلى N- أو C-محطة من البروتين عن طريق الهندسة الوراثية جنبا إلى جنب مع رابط المناسبة لمنع اختلال أضعاف العام للبروتين. وقد تم تصميم هذا الزوج تتكون من فلاش صبغ وفلاش العلامة أصلا للبروتينات تسمية مواقع محددة في الخلايا الحية 17 ولكن يمكن أيضا أن تستخدم لتسمية تنقية البروتينات في المختبر كما يتجلى ذلك هنا. بالإضافة إلى ذلك، كما تم وضع استراتيجيات الأنزيمية لتمكين functionalization في مواقع محددة من البروتينات 18.
في هذه المخطوطة وصفنا فائدة مضان تباين لأداة سا لدراسة تفاعلات البروتين البروتين. ملزمة يمكن تقييمها عن طريق التفتيش بسيط من شكل منحنى ملزم بينما يمكن الحصول على معلومات كمية من نوبة من البيانات التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SBDS فلاش التعبير علامة البروتين وتنقية
ملاحظة: للحصول على التجارب تباين، ومضة العلامة المقابلة إلى السيستئين برو-الغليسين-السيستئين-السيستئين السيستئين تم إضافتها إلى C-محطة من SBDS البشرية تسلسل الترميز بواسطة PCR التسلسل. وقد subcloned هذا البناء في ناقلات التعبير pRSET-A وتحويلها إلى كولاي الخلايا C41 للتعبير عن بروتين ترميز علامة hexahistidine N-محطة (صاحب العلامة)، وSBDS البشرية تسلسل الترميز وسي صول بطاقة فلاش 10.
- تعبير البروتين SBDS فلاش
- تحويل E. المختصة خلايا القولونية C41 مع البلازميد pRSET-HisSBDS فلاش باستخدام معيار بروتوكول الصدمة الحرارية 19. لوحة الخلايا في لوريا، Bertani (LB) وسائل الاعلام الصلبة تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. يتكون LB تكوين وسائل الاعلام الصلبة من 10 غرام كلوريد الصوديوم، 5 ز خلاصة الخميرة، و 10 غرام تريبتون و 20 غ أجار لحجم 1 لتر.
- البكتيريا تتحول الثقافة عند 37 درجة مئوية حتىالامتصاصية في 600 نانومتر (A 600) يصل 0،5-0،7 في 1 لتر من LB السائلة وسائل الإعلام تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين.
- حمل بروتين تعبير بإضافة 0.5 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside للثقافة والاستمرار في حضانة لمزيد من 5 ساعة.
- جمع تعليق البكتيرية بواسطة الطرد المركزي في 3800 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف. عند هذه النقطة، إما تخزين بيليه خلية في -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لتنقية البروتين.
- تنقية البروتين SBDS فلاش
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الكروماتوغرافي باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة (FPLC) نظام بروتين سريع أو مضخة تحوي. يستخدم ني 2+ -affinity اللوني 5 مل العمود تدفق سريع. يستخدم اللوني الصرف انيوني 5 مل قوي sulfopropyl الموجبة العمود المبادلات. / تم استخدام معدل التدفق من 3 مل دقيقة لكافة الخطوات الكروماتوغرافي.- resuspend الخلايا في 35 مل من SBDS تحلل بuffer (50 ملي الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.5، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 20 ملي ايميدازول) تستكمل مع 1 ملم phenylmethylsulfonyl فلوريد (PMSF) وليز صوتنة لفترة ما مجموعه 4 دقائق باستخدام دورات من 10 ثانية ON و 30 ثانية OFF، في 4 ° C.
- الطرد المركزي العينة في 9000 x ج لمدة 50 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إبقاء طاف وتجاهل بيليه لإزالة الحطام الخلوي.
- تتوازن ني 2+ العمود تقارب مع 3 مجلدات العمود (CV) من SBDS تحلل العازلة وإدخال كله أوضح طاف على العمود.
- إزالة البروتين غير منضم عن طريق الغسيل مع 3 السيرة الذاتية لSBDS تحلل العازلة وأزل مع 3 السيرة الذاتية العازلة SBDS شطف (50 ملي الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.5، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 250 ملي ايميدازول).
- تمييع مزال البروتين 6 أضعاف مع 50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.5 وإزالة الركام الممكنة عن طريق الترشيح من خلال غشاء 0.22 ميكرون السليلوز.
- تتوازن العمود sulfopropyl الموجبة المبادلات مع 3 السيرة الذاتية لمنخفض الملح العمود Sالعازلة (50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.5، 50 ملي كلوريد الصوديوم) وإدخال عينة بروتين من الخطوة السابقة.
- غسل المواد غير منضم مع 3 السيرة الذاتية لمنخفض الملح S عازلة عمود وأزل البروتين في خطوة واحدة مع 50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.5، 1 M كلوريد الصوديوم.
- تمييع مزال البروتين 3.3 أضعاف مع 50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.5. تركيز البروتين مع أجهزة الترشيح الفائق بواسطة الطرد المركزي في 3800 x ج لمدة 15 دقيقة. فلاش تجميد البروتين في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- التحقق من نقاء من البروتين عن طريق تحليل SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ 20.
2. EFL1 التعبير البروتين وتنقية
وأعرب عن EFL1 تحت تنظيم غال 10/01 المروج المتباينة 21 وخميرة الخباز MAT و3'UTR في pRS426 ناقلات: ملاحظة. البروتين المؤتلف بترميز EFL1 الإسوي الإنسان 1 تنصهر لفيروس البروتيني التبغ حفر (TEV) الموقع الاعتراف وعلامة hexahistidine في محطة سي.
- تعبير البروتين EFL1
- تحويل س. خلايا خميرة BCY123 مع البلازميد pRS426-EFL1TevHis باستخدام بروتوكول خلات ليثيوم معيار 22. لوحة كافة الخلايا تحولت في انخفاض الاصطناعية من وسائل الإعلام دون اليوراسيل (SD-URA) تستكمل مع 2٪ (ث / ت) الجلوكوز. تكوين وسائل الإعلام SD-URA تتكون من 8 ز قاعدة الخميرة النيتروجين دون الأحماض الأمينية، الأحماض 11 ز casamino، 55 ملغ الأدينين كبريتات، التيروزين 55 ملغ، ليسين 60 ملغ و 60 ملغ التربتوفان لحجم 1 لتر.
- ثقافة حولت الخميرة في 30 درجة مئوية حتى تصل إلى 600 1.8 في 1 لتر من وسائل الإعلام SD-URA تستكمل مع 0.5٪ (ث / ت) الجلوكوز.
- حمل بروتين تعبير بإضافة 2.8٪ (ث / ت) اللبن للثقافة والاستمرار في حضانة لمزيد من 18 ساعة على 30 درجة مئوية.
- جمع تعليق الخميرة عن طريق الطرد المركزي في 3800 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف.عند هذه النقطة، إما تخزين بيليه خلية في -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لتنقية البروتين.
- تنقية البروتين EFL1
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الكروماتوغرافي باستخدام نظام FPLC أو مضخة تحوي. يستخدم ني 2+ -affinity اللوني 5 مل العمود تدفق سريع في معدل التدفق من 3 مل / دقيقة. يستخدم حجم الإقصاء اللوني عمود 125 مل قبل معبأة مع Superdex 200 الراتنج بمعدل تدفق من 1 مل / دقيقة.- resuspend الخلايا في 50 مل من EFL1 تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 20 ملي إميدازول 5 ملي MgCl 2، 10٪ الجلسرين) تستكمل مع 1 ملم PMSF و 1 ملي benzamidine وتعطيل الخلايا الاحتكاك على الخافق حبة باستخدام الخرز الزجاجي (ط = 0.5 ملم) لفترة ما مجموعه 6 دقيقة باستخدام دورات 2 دقيقة على و 15 دقيقة OFF، في 4 درجات مئوية.
- الطرد المركزي العينة في 9000 x ج لمدة 50 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إبقاء طاف وتجاهل بيليه لإزالة الحطام الخلوي. تتوازن العمود تقارب ني 2+ مع 3 السيرة الذاتية لEFL1 تحلل العازلة وإدخال جميع طاف أوضح على العمود.
- إزالة البروتين غير منضم عن طريق الغسيل مع 3 السيرة الذاتية لEFL1 تحلل العازلة وأزل مع 3 السيرة الذاتية العازلة EFL1 شطف (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 250 ملي إميدازول 5 ملي MgCl 2، 10٪ الجلسرين).
- تتوازن العمود حجم الإقصاء مع 1.5 السيرة الذاتية العازلة تباين الخواص (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي MgCl 2، 10٪ الجلسرين، 5 ملي β-المركابتويثانول).
- التركيز إلى 1 مل البروتين EFL1 مزال من العمود تقارب ني 2+ مع أجهزة الترشيح الفائق بواسطة الطرد المركزي في 3800 x ج لحجم المطلوب. إدخال العينة على العمود حجم الإقصاء.
- جمع بروتين مزال والتركيز من قبل الفائق إلى تركيز النهائي من ما يقرب من 30 ميكرومتر. فلاش تجميد البروتين في النيتروجين السائل ومخزن في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. تحقق من عشرالبريد نقاء من البروتين عن طريق تحليل SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ 20.
3. صفها من SBDS فلاش مع فلاش صبغ نيون 4 "، 5'البس (1،3،2 dithioarsolan-2-YL) فلوريسئين
- مزيج 3 نانومول من البروتين SBDS فلاش مع 3 نانومول من 4، 5'مكرر (1،3،2 dithioarsolan-2-YL) صبغة فلوريسئين في حجم 5 ميكرولتر من العازلة تباين الخواص.
- دع رد فعل المضي قدما لمدة 8 ساعات في 4 درجات مئوية. Dialyze العينة ضد عازلة تباين الخواص أكثر من ليلة لإزالة الصبغة الحرة.
- استخدام القانون لامبرت-البيرة لقياس٪ من البروتين المسمى. قياس الامتصاصية في 280 نانومتر و 508 نانومتر في معمل باستخدام كوفيت الكوارتز من حجم مناسب. ملاحظة: النظر في معاملات امتصاص المولي التالية (M -1 سم -1):
- حساب تركيز البروتين المسمى SBDS فلاش باستخدام المعادلة 2.
- حساب تركيز البروتين الكلي SBDS باستخدام المعادلة 3 عن طريق استبدال المحسوب C SBDS فلاش من الخطوة السابقة.
- حساب نسبة البروتين المسمى باستخدام المعادلة (4).
4. التجارب الإسفار تباين الخواص
ملاحظة: تم القيام به التجارب تباين الخواص في الطيفي مجهزة تم تنفيذ مجموعة الأدوات الاستقطاب وبيانات باستخدام برنامج تباين المقدمة في البرنامج من المعدات. تم تعيين الطول الموجي الإثارة في 494 نانومتر مع عرض النطاق الترددي الطيفي لل8 نانومتر و تم تسجيل الانبعاثات باستخدام فلتر الفرقة تمريرة من 530 ± 25 نانومتر. وقد أجريت القياسات عند 25 درجة مئوية في كوفيت 200 ميكرولتر مع 5 ملم طول الطريق 10.
- في كفيت مضان، وضع 200 ميكرولتر من 30 نانومتر SBDS فلاش العازلة في تباين ويعاير 2 ميكرولتر من EFL1 30 ميكرومتر. تخلط جيدا وترك رد فعل الوقوف لمدة 3 دقائق قبل قياس قيمة تباين.
- تمت إضافة كرر الخطوة 4.1 حتى الحجم الكلي لل40 ميكرولتر من EFL1.
تحليل 5. البيانات
- احتواء البيانات للنموذج ملزم المناسب باستخدام غير الخطية أقل خوارزمية الساحات الانحدار. وتعرض المعادلات لنماذج ملزمة الأكثر شيوعا في الجدول 1.
- تقييم أفضل نموذج يصف التفاعل بين البروتينات عن طريق فحص المخلفات لائقا 23. دعم النموذج المختار مع تجارب إضافية.
الجدول 1. نماذج المشترك تفاعل البروتين البروتين ملزمة والمعادلات الرياضية التي تصف لهم.0 / 54640table1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إجراء أية تجربة تباين من المهم استبعاد تغييرات كبيرة في كثافة مضان من fluorophore منذ يتم تمثيل تباين الملحوظ من خليط من الأنواع من المعادلة 5:
حيث F ط يمثل مضان كسور كل مكون و r i هو تباين المقابلة. مضان كسور كل مكون يعتمد على كل والتركيز ومضان النسبي، الذي تم تعريفه من قبل المعادلة 6:
حيث X ط يمثل الكسر المولي من اله ط ث مسكوكة وØ i هو العائد الكم من أنا مسكوكة عشر.
وبالتالي، إذا تغير كثافة مضان بشكل كبير على طول المعايرة فمن الأفضل ل، إما قياس تشكيل معقد بوصفها وظيفة من تغيير في إشارة مضان وليس للإشارة تباين، أو تصحيح قيمة تباين التي لاحظها تركيب كل من كثافة مضان وتباين البيانات. مضان من SBDS فلاش لا تغيير لا يمكن ملاحظتها على ملزم لEFL1 (الشكل 2) مما يدل على أن تباين مضان كافية لقياس الربط بين اثنين من البروتينات.
الشكل 2. الانبعاثات مضان من SBDS فلاش على المعايرة زيادة تركيزات EFL1 التغيرات في الانبعاثات مضان من fluorophore هي negligiblه وعشوائي على طول المعايرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويرد مثال على تباين مضان منحنى تم الحصول عليها من معايرة EFL1 إلى SBDS فلاش الملزمة في الشكل (3). نوعيا، شكل رسم بياني يبين بوضوح أن اثنين من البروتينات تتفاعل كما يتضح من زيادة في إشارة تباين على إضافة EFL1. وعلاوة على ذلك، بلغت قيم تباين هضبة مما يشير إلى أنه في نهاية المعايرة كان كل بروتين SBDS فلاش الحالي في مجمع مع EFL1. ومن الممكن بعد ذلك، لوصف كمي التفاعل بين هذه البروتينات واحتواء البيانات باستخدام غير الخطية المربعات الانحدار إلى نموذج ملزم المفترضة والحصول على التفكك المقابلة التوازن المستمر. تركيب لنموذج موقع ملزم واحد لم appropri¢ الأمر وصف البيانات التجريبية (الشكل 3A). وهذا واضح ليس فقط من التتبع المناسب في منحنى ملزم ولكن أيضا من الانحرافات من مخلفات تناسب (الفرق بين البيانات النظرية والتجريبية) التي هي ملموس واعشوائي. هذا يتفق تماما مع حقيقة أن نموذج موقع ملزم واحد يوصف رياضيا منحنى القطعي بدلا من منحنى السيني كما لوحظ للبيانات التجريبية المعروضة في الشكل (3). من ناحية أخرى، ونماذج مثل اثنين متطابقة أو مختلفين ملزمة مواقع تصف أفضل البيانات التجريبية والمخلفات من مناسبة لا تظهر أي انحراف منهجي دعم الموقع اثنين نموذج جمعية (الشكل 3B-C). في حالة عدم وجود أي معلومات تجريبية أخرى يصعب تحديد أي من النموذجين تتوافق مع آلية ملزمة بين EFL1 وSBDS. ومع ذلك، SBDS وEFL1 كلاهما البروتينات أحادى، ولذلك فمن difficالموج تصور اثنين متطابقة مواقع الربط نموذج.
. الشكل 3. الإسفار تباين الأيسوثرم ملزمة للتفاعل بين EFL1 وSBDS فلاش الخط المستمر في كل من المؤامرات العليا يتوافق مع نوبة من البيانات إلى نماذج ملزمة مختلفة: (أ) موقع واحد، (ب) موقعين متطابقة و (C) موقعين غير متطابقة. قطع أقل وتمثل المخلفات من يصلح لهذا النموذج المطابق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معظم التجارب الكيميائية الحيوية مع البروتينات تتطلب ليس فقط من البروتين النقي ولكن أيضا على كميات كبيرة منها، بغض النظر عن التقنية المستخدمة. لهذا السبب، يتم الحصول على البروتينات المستخدمة لهذا النوع من التجارب التي كتبها تعبير مغايرة، كما كان الحال المقدمة هنا. تنوير الطيفي يتطلب وجود fluorophore في جزيء درس. بقايا العطرية تشكل fluorophores الجوهرية للبروتين، ولكن، وذلك باستخدام إشارة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين يعقد التحليل، إذ أنها شائعة في معظم البروتينات، وسوف يكون حاضرا في كل ومستقبلات البروتين ويجند. بالإضافة إلى ذلك، عمر التربتوفان قصيرة جدا للتجارب مضان تباين. لهذا السبب، فإنه من الشائع إضافة fluorophores خارجي إلى واحد من البروتينات التي شملتها الدراسة. ولهذه الغاية، تم إضافة fluorophore إلى C-محطة من SBDS من خلال السندات التنسيق بين الصبغة 4 "، 5'مكرر (1،3،2 dithioarsolan-2-YL) وluorescein مع عزر tetracysteine قدم في البروتين عن طريق الهندسة الوراثية. اختيار البروتين الذي سميت على fluorophore ليست مسألة عشوائية. نظرا لحجم البروتينات درس هنا (SBDS 29 كيلو دالتون وEFL1 127 كيلو دالتون)، وكنا نتوقع تغييرا أكبر في تباين بين خالية المسمى SBDS وذلك في مجمع مع EFL1، مقارنة مع التغيير المتوقع بين مجانا المسمى EFL1 وأن بد أن SBDS. ومع وضع هذا في الاعتبار، وقدم علامة فلاش في SBDS بدلا من EFL1. مقياس آخر مهم في الاعتبار عند إعداد تجربة مضان تباين هو امتصاص الحلول المستخدمة. الكثافة البصرية من الحل في كفيت لا ينبغي أن يكون أكبر من 0.1 في الإثارة وانبعاث الطول الموجي، ويجب أن تظل ثابتة على طول المعايرة بأكملها. خلاف ذلك، يمكن أن تأثير فلتر داخلي التدخل في قياس ويجب تصحيحه ل. في التجربة المعروضة هنا، البروتينات درس لا تمتص في الطول الموجي للexcitatأيون أو انبعاث 4 "، 5'مكرر (1،3،2 dithioarsolan-2-YL) صبغة فلوريسئين. وبالتالي تأثير فلتر الداخلي لا يشكل مشكلة.
فيما يتعلق بجمع البيانات، وبعد ذلك بشكل صحيح احتواء البيانات، فمن الضروري أن يكون واضحة المعالم خطوط الأساس السفلي والعلوي مع نقاط عدة بيانات من خلال الانتقال على طول منحنى ملزم. خلاف ذلك، من المناسب للبيانات غير دقيقة ويمكن أن تضيع المعلومات بشأن وضع ملزم. لوصف منحنى لائق ملزم فمن الضروري أن تركيز يجند مجانا يختلف من وحدتين لوغاريتمي تحت وفوق التفكك المستمر، ومع ذلك، تجريبيا هذا قد يكون من الصعب تحقيقه. في الحد الأدنى، قد تنشأ مشاكل مع حساسية للمعدات خاصة عندما تقارب بين البروتينات عالية جدا، في حين أن تركيزات كبيرة قد لا يمكن تحقيقه بسبب مشاكل ذوبان يجند. وقد اتضح ذلك بشكل واضح عند اختبار التفاعل بين SBDSS143L متحولة المرض وEFL1. عطل هذا المسخ الربط إلى EFL1 إلى حد أنه لم يكن من الممكن الحصول على منحنى ملزم السليم منذ EFL1 لا يمكن إلا أن تتركز تصل إلى 70 ميكرومتر ويقل تأثير البروتين ≈ 5 أضعاف خلال المعايرة 10. وبالتالي، فمن الضروري أن يكون هناك تقدير تقريبي للتقارب لتحسين نظام المعايرة والتأكد من أن يقفز في تركيز يجند لا تحدث في المواقف التي من شأنها أن تسبب نوبة أقل دقة. على سبيل المثال، في عداد المفقودين النقاط الأولية للمنحنى ملزم المعروضة في الشكل (3) وجعلها تبدو وكأنها قطع زائد تضليل الباحث نحو نموذج موقع ملزم واحد.
مرة واحدة تم جمعها، تم تركيب البيانات إلى نموذج ملزم يفترض. بالمقارنة مع مضان البيانات، وتباين ويمكن استخدامها دون مزيد من التلاعب ولا تحتاج تصحيح آثار التخفيف. المعادلات الواردة في الجدول 1 ضع في اعتبارك أن [L] ≈[L] 0 في كل نقطة من المعايرة. قد لا يحدث هذا عندما تقارب بين البروتينات عالية جدا بحيث في النقاط الأولى من استنزاف المعايرة يجند يحدث. في هذا السيناريو، وصفت المعادلات التربيعية أكثر تعقيدا في أماكن أخرى هناك حاجة إلى 23 لاحتواء البيانات. في التجربة الموصوفة هنا، كان EFL1 يجند دائما في فائض كبير بالمقارنة مع تركيز SBDS فلاش والتغير في تركيز EFL1 في كل نقطة من المعايرة يمكن تجاهلها. كما نوقش في قسم النتائج، وهذا نموذج موقعين غير متطابقة ملزمة أفضل وصف البيانات التجريبية (الشكل 3C). معلومات إضافية البيوكيميائية التي تم الحصول عليها في المجموعة تدعم فكرة أن هذا هو النموذج الصحيح لوصف التفاعل بين EFL1 وSBDS (لا تظهر البيانات). هذا النمط من التفاعل هو شائع في البروتينات متعددة المجالات، مثل EFL1 وSBDS هي، وتوجد عدة أمثلة في الأدب 24-26. ومع ذلك، فإنه هو المهم يسوتو استبعاد التفاعل غير محددة التي يمكن أن تظهر على أنها نموذج التفاعل من مواقع الربط متميزة مع الانتماءات المختلفة ليجند بها. تحقيقا لهذه الغاية، مؤامرة سكاتشارد أمر مفيد للغاية. بالمقارنة مع غيرها من التقنيات، إشارة مضان تباين تقارير مبلغ مجمع شكلت وبالتالي فمن الممكن لبناء مؤامرة سكاتشارد مع البيانات. ويشير منحنى محدب سكاتشارد نموذجا موقعين ملزمة مختلفة مع cooperativity السلبية أو غير محددة وملزمة، في حين أن مؤامرة مقعرة سكاتشارد ينطوي على نموذج موقعين ملزمة مختلفة مع cooperativity الإيجابية أو عدم الاستقرار يجند (الشكل 4). وأظهر تحليل البيانات التجريبية مؤامرة سكاتشارد مع شكل مقعر دعم نموذج من موقعين ملزمة مستقلة لEFL1 وSBDS (الشكل 4D). وعلاوة على ذلك، تم تأكيد cooperativity إيجابية بعد إجراء تحليل هيل التي أسفرت عن قيمة هيل معامل 1.8 ± 0.02 (لا تظهر البيانات).
SS = "jove_content"> 
الشكل 4. المؤامرات سكاتشارد لنماذج مختلفة ملزمة البروتين البروتين. (A) موقع ملزم واحد أو مواقع متعددة متطابقة أن لا تتفاعل. (ب) مواقع الربط مختلفة متعددة مع cooperativity السلبية أو غير محددة وملزمة. (C) مواقع الربط مختلفة متعددة مع cooperativity الإيجابية أو عدم الاستقرار يجند. مؤامرة (D) سكاتشارد الناتجة من تحليل البيانات تباين التجريبية تم الحصول عليها من معايرة EFL1 إلى SBDS فلاش. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
مضان تباين عبارة عن تقنية صحيح-التوازن القائم على الحل الذي يتطلب جزيئات مدروسة للبقاء في حل في الظروف المختبرة. ويمكن استخدامه لدراسة وليس علىلاي التفاعل بين البروتينات بالطول ولكن أيضا التفاعل بين المجالات البروتين والبروتينات متحولة أو حتى الببتيدات مع بعض التعديلات بعد متعدية. وعلاوة على ذلك، مضان تباين ويمكن أيضا أن تستخدم لقياس الربط من البروتينات الأغشية الدهنية باستخدام الفلورسنت أغشية حساسة تحقيقات. وقد استخدم هذا النهج بنجاح لدراسة التأثير الذي ألفا synuclein له في الحويصلة متشابك التعبئة والتغليف (27). واحدة من المزايا الرئيسية لتباين مضان هو أنه يوفر معلومات كمية عن الربط من جزيئات درس بحيث ثوابت التفكك الحقيقية ويمكن الحصول على جنبا إلى جنب مع المعلومات الآلية. على الرغم من أن التقنيات الفيزيائية الحيوية الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا للحصول على هذه المعلومات، مضان تباين يتطلب كميات صغيرة من العينة، ويمكن أن يؤديها ليس فقط في حالة توازن، كما وردت هنا، ولكن أيضا باستخدام حركية السريعة، مثل التألق توقف تدفق، للحصول على جمعية ومعدل التفككالثوابت (ك على وك قبالة، على التوالي) 28. ويرد جدول مقارن مع فوائد ومساوئ تباين مضان فيما يتعلق بتقنيات الفيزيائية الحيوية الأخرى في الجدول 2. جميع الأساليب المذكورة هي تقنيات صحيح-التوازن لأن أيا منهم تشمل عملية الفصل الميكانيكي من الكسور الحرة والمرتبطة. كما ذكر في قسم النتائج، إذا تغير كثافة مضان من البروتين المسمى إلى حد كبير على التفاعل، هذا العقار يمكن بعد ذلك أن تستخدم لتحديد تقارب من الربط. ومع ذلك، والتغيرات في كثافة مضان الناتجة عن التفاعل تشير إلى تدخل محتمل من fluorophore خارجي على التفاعل الجزيئي نفسها. ألا وهي تغيير محتمل لالمستمرة قيمة التفكك (K د) من البروتينات غير المسمى المقابلة. على هذا النحو، مضان تباين يمكن اعتبار تقنية أقل الغازية من الفصلفي نفس الفئة في كثافة مضان منذ الأول ينبغي أن تطبق عندما لا تتغير كثافة مضان على التفاعل. في هذا المعنى، على الرغم من حاجة الى كميات كبيرة من البروتين، متساوي الكالوري المعايرة (ITC) يمكن أن توفر قيمة K د الحقيقية للتفاعل الجزيئي لأنها وسيلة مجانية التسمية. من ناحية أخرى، لا يتم الحصول على معلومات الميكانيكية بسبب الاختلافات في الحرارة إلا عن المحتوى الحراري للعملية وليس كمية مجمع شكلت 29.
في المقارنة، في طرق الحي مثل الخميرة الهجين اثنين أو تكامل جزء المقايسات لا تتطلب تنقية البروتينات ولكنها توفر سوى معلومات شبه الكمية على طريقة ملزمة. على الرغم من حقيقة أنه في الخميرة تقنية يومين الهجين هو ممكن للتعبير عن قوة باستخدام وحدات ميلر ملزمة، وهذا ليس التوازن الحقيقي عوامل ثابتة والعديد من السيطرة على الباحث يمكن أن يغير ذلك.
الجدول 2. مزايا وعيوب التقنيات الفيزيائية الحيوية المستخدمة عادة تستخدم لدراسة التفاعلات البروتين البروتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | Ultra pure |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | This kit contains the dye to label a FlAsH tag |
| Ampiciline | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Formedium | GLU03 | |
| D(+)-Galactose | Formedium | GAL03 | |
| L-Leucine | Formedium | DOC0157 | |
| L-Tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Sodium Chloride |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Magnesium Chloride |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Potassium phosphate dibasic |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Sodium phosphate monobasic |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Yeast extract | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Filtration units | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Membrane Filter | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain |
| Ni2+ affinity column | QIAGEN | 30760 | Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl cation exchanger column | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Size Exclusion column | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Fluorescence cell | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Spectrophotometer | Agilent Technologies | G6860AA | Cary 60 UV-Vis |
| Shaker | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Discontinued | FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction |
| Spectrofluorometer | Olis | No applicable | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
References
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).
- Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11 (12), 848 (2015).
- Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
- Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).
- Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).
- Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).
- Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Third, Springer US. (2010).
- Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
- Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
- Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , Wiley. (2015).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
- Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
- Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).
- Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).
- Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).
- Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
- Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
- Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).
