Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

एक उपकरण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के रूप में प्रतिदीप्ति एनिसोट्रॉपिक

Published: October 21, 2016 doi: 10.3791/54640
Automatic Translation
1, 2, 1
1Departamento de Química de Biomacromoléculas, Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

प्रोटीन बातचीत एक सेल के समारोह के दिल में हैं। Calorimetric और स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक आमतौर पर उन्हें चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। यहाँ हम प्रोटीन Shwachman-डायमंड सिंड्रोम (SBDS) में उत्परिवर्तित और बढ़ाव कारक की तरह 1 GTPase (EFL1) के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में प्रतिदीप्ति anisotropy का वर्णन है।

Abstract

प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत एक जीवित जीव के समारोह में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। एक बार एक बातचीत पहचान की गई है और मान्य यह संरचनात्मक और यंत्रवत स्तर पर यह चिह्नित करने के लिए आवश्यक है। कई जैव रासायनिक और biophysical तरीकों ऐसे प्रयोजन के लिए मौजूद हैं। उनमें से, प्रतिदीप्ति anisotropy एक शक्तिशाली तकनीक विशेष रूप से इस्तेमाल किया जाता है जब एक fluorophore लेबल प्रोटीन की प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर लगातार बना रहता है। इस तकनीक में, एक fluorophore लेबल प्रोटीन एक उपयुक्त तरंग दैर्ध्य है कि चुनिंदा भेजे किरण के साथ उनके रिश्तेदार उन्मुखीकरण के अनुसार fluorophores की एक सबसेट उत्तेजित की खड़ी ध्रुवीकरण प्रकाश के साथ उत्साहित है। इस प्रकार के रूप में जिसके परिणामस्वरूप उत्सर्जन भी एक दिशात्मकता जिसका क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर विमानों में संबंधों को परिभाषित करता anisotropy (आर) है: आर = (मैं वी.वी. -मैं VH) / (मैं वी.वी. + 2I VH) है, जहां मैं वी.वी. और मैं

Introduction

प्रकोष्ठों Biomacromolecules कि लगातार एक दूसरे के साथ बातचीत के एक भीड़ में होते हैं। इस संस्था परिसरों कि संकेत पारगमन, जीन अभिव्यक्ति और अन्य लोगों के बीच सेल प्रवास के नियमन में उनके कामकाज के लिए जिम्मेदार सेलुलर रास्ते में भाग लेने के लिए जन्म देता है। सभी प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत है कि एक सेल में घटित एक नेटवर्क interactome के रूप में जाना शामिल हैं। Saccharomyces cerevisiae में इसकी प्रोटीन की 70% से अधिक बातचीत भागीदारों 1 है दिखाया गया है। एक सेल के interactome को समझना और उनके कार्यों जटिलता और रहने वाले जीवों की विविधता पर प्रासंगिक जानकारी प्रदान करते हैं। कई तरीके की पहचान करने और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को चिह्नित करने वर्णित किया गया है। ऐसे खमीर दो संकर 2, प्रोटीन-टुकड़ा पूरक assays 3, आत्मीयता शुद्धि 4 मास स्पेक्ट्रोमेट्री और प्रोटीन microarra के लिए युग्मित के रूप में डाल तरीकों के माध्यम से विभिन्न उच्चवाईएस एक बातचीत 5,6 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। एक बार की पहचान, यह यह मान्य करने के लिए आवश्यक है और यह एक मामला-दर-मामला आधार पर भिन्न हो सकते हैं। आमतौर पर, इन प्रयोगों बातचीत जोड़ी, जैसे के व्यक्तिगत सदस्यों के स्तर पर बातचीत से ही खलल न डालें, जीन विलोपन या प्रोटीन में से एक की overexpression से शामिल है, और फिर कम से गुणों में परिवर्तन या अन्य सदस्य के समारोह के लिए तलाश सेलुलर स्तर। बाद में, biophysical तकनीक 7 आण्विक स्तर पर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। यह अंत करने के लिए, प्रोटीन परिसरों की संरचना एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद और क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित कर रहे हैं, जबकि उष्मामिति और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी मात्रात्मक और mechanistically उन्हें का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

इस काम में, प्रतिदीप्ति anisotropy GTPase EFL1 और SBD के बीच बातचीत को चिह्नित करने के लिए एक तकनीक के रूप में इस्तेमाल किया गया थाएस प्रोटीन। ये प्रोटीन 60 ribosomal सबयूनिट 8 की सतह से यूकेरियोटिक दीक्षा कारक है 6 की रिहाई को बढ़ावा देने से राइबोसोम के संश्लेषण में भाग लेते हैं। SBDS प्रोटीन एक बीमारी EFL1 guanosine diphosphate 10,11 के लिए अपने संबंध को कम करने के लिए एक गुआनिन न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारक के रूप में Shwachman-डायमंड सिंड्रोम 9 और कृत्यों के रूप में जाना जाता है में उत्परिवर्तित है। SBDS में रोग म्यूटेशन EFL1 के साथ बातचीत को खत्म करने और इस प्रकार अपने सक्रियण को रोकने के।

प्रतिदीप्ति anisotropy सामान्यतः प्रोटीन पेप्टाइड या प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड बातचीत का अध्ययन करने के लिए जैविक अनुप्रयोगों में प्रयोग किया जाता है। यह सिद्धांत है कि एक fluorophore एक आंशिक रूप से ध्रुवीकृत उत्सर्जन में ध्रुवीकृत प्रकाश परिणामों के साथ उत्साहित पर आधारित है। प्रतिदीप्ति anisotropy 1 समीकरण द्वारा परिभाषित किया गया है:

Equation1

मैं वी.वी. और मैं VH रहे हैं, जहांखड़ी (वी.वी.) और क्षैतिज (VH) के प्रतिदीप्ति तीव्रता उत्सर्जन ध्रुवीकरण जब नमूना उत्साहित है खड़ी साथ प्रकाश 12 ध्रुवीकरण। प्रतिदीप्ति anisotropy कारक है कि fluorophore की बारी-बारी से प्रसार की दर को प्रभावित करने के लिए संवेदनशील है और इस तरह के तापमान, समाधान की चिपचिपाहट और fluorophore का स्पष्ट आणविक आकार पर निर्भर करता है। एक प्रोटीन एक fluorophore बढ़ जाती युक्त जब यह एक और प्रोटीन और इस तरह के परिवर्तन के साथ सूचना का आदान प्रदान के स्पष्ट आकार तो anisotropy में बदलाव के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है। अधिक विशेष रूप से, एक fluorophore है कि इसके फ्लोरोसेंट जीवन भर के लिए समाधान के सापेक्ष में धीरे-धीरे घूमता है एक अपेक्षाकृत बड़े anisotropy प्रदर्शन करेंगे एक बड़ा मैं वी.वी. मूल्य और छोटे मैं VH मूल्य नहीं है और इसलिए होगा। Fluorophores कि तेजी से अपने फ्लोरोसेंट जीवन भर के सापेक्ष हुई बात के लिए, मैं वी.वी. और मैं VH समान हो जाएगा और उनके anisotropy मूल्य छोटा हो जाएगा 12 (चित्रा 1)। इसके अलावा, शोर माप के लिए एक अच्छा संकेत anisotropy के लिए, यह आवश्यक है ब्याज की अणु की बारी-बारी से सह-संबंध समय के लिए इसी तरह एक प्रतिदीप्ति जीवन भर के साथ एक fluorophore के लिए है। अन्यथा, यह सही मुक्त प्रोटीन के बीच और कहा कि परिसर में anisotropy में अंतर रिकॉर्ड करने के लिए संभव नहीं है। उदाहरण के लिए, एक जीवन भर के 100 दा का एक कम आणविक भार परिसर से जुड़ी ऐसी fluorescein या rhodamine के रूप में 4 NSEC के पास से एक फ्लोरोसेंट जांच की anisotropy 0.05 है। 160 केडीए 0.29 करने के लिए अपने anisotropy मूल्य में वृद्धि होगी एक अणु के लिए बाइंडिंग; एक अंतर यह है कि सही ढंग से मापा जा सकता है। इसके विपरीत, एक ही फ्लोरोसेंट एक बाध्यकारी प्रतिक्रिया आणविक आकार में वृद्धि जिसका 1,000 केडीए के लिए 65 से भिन्न होता है में शामिल जांच केवल 0.3 करने के लिए 0.28 की एक anisotropy परिवर्तन है, जो बहुत छोटा सही मापा जा रहा है में परिणाम होगा। इस परिदृश्य में, 400 nsec का एक जीवन भर के साथ एक अधिक उपयुक्त जांच 12 होगा।


चित्रा 1. प्रतिदीप्ति anisotropy और प्रक्रिया को मापने के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत प्रयोग मापने प्रतिदीप्ति anisotropy प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। Fluorophores है कि तेजी से प्रदर्शन छोटे anisotropy कि एक बातचीत साथी के लिए बाध्य पर बढ़ जाती हुई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रतिदीप्ति अनुप्रयोगों के अणुओं का अध्ययन से किसी में एक fluorophore की उपस्थिति की आवश्यकता होती है। प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए वहाँ fluorophores के तीन प्रकार हैं: 1) नियासिन प्रोटीन में मौजूद अवशेषों, 2) रासायनिक जुड़ी fluorophores और 3) फ्लोरोसेंट संलयन भागीदारों के ऐसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और उसके Deriva के रूप मेंtives। सबसे अधिक प्रोटीन, एक बातचीत को मापने के लिए सबसे आसान तरीका है इस प्रकार इसी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा में परिवर्तन की निगरानी के द्वारा या tryptophan अवशेषों की प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन की निगरानी कर रहा है इसकी संरचना पर tryptophan अवशेषों की है। हालांकि, नियासिन अवशेषों विश्लेषण उलझी दोनों प्रोटीन में मौजूद हो सकता है। दूसरी ओर, एक fluorophore एक बातचीत के कारण फ्लोरोसेंट गुणों को बदलने के लिए उस पर या बाध्यकारी साइट के पास स्थित होने की जरूरत है और यह बातचीत के साथ ही हस्तक्षेप कर सकता है। यह विशेष ध्यान जब इस तरह के GFP के रूप में भारी fluorophores का उपयोग कर की जरूरत है। इन fluorophores से कोई बाध्यकारी अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यदि ऐसा है तो, शामिल प्रोटीन से एक के लिए बाह्य fluorophores लागू करने के लिए आवश्यक है। कई रासायनिक संश्लेषित fluorophores मौजूद हैं और covalently ऐसे एमाइन समूह (lysines या एन टर्मिनस के पक्ष श्रृंखला) और सिस्टीन में thiol समूहों के रूप में उनके प्रतिक्रियाशील समूहों के माध्यम से प्रोटीन के लिए संलग्न किया जा सकता है। एफआइसोथियोसाइनेट और succinimidyl एस्टर के साथ luorophore डेरिवेटिव एमाइड समूहों के साथ प्रतिक्रिया करते हुए iodoacetamide और maleimide thiol प्रतिक्रियाशील समूहों 13 हैं। सबसे आम प्रतिदीप्ति अनुप्रयोगों में इस्तेमाल रंगों fluorescein के डेरिवेटिव और rhodamine हरे रंग, coumarins, BODIPY fluorophores और एलेक्सा स्त्राव रंगों कर रहे हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध fluorophores और उनके उपयोग की एक विस्तृत सूची संदर्भों 14,15 में पाया जा सकता है। सफल लेबलिंग के लिए, प्रतिक्रियाशील समूह प्रोटीन की सतह पर उजागर किया जाना चाहिए, लेकिन प्रतिक्रियाशील कार्य समूहों को आम तौर पर polypeptides में मौजूद बड़ी संख्या के कारण यह साइट विशेष संशोधन पाने के लिए बहुत मुश्किल है। इस अध्ययन में ब्याज की प्रोटीन, SBDS, 5 मुक्त cysteines और 33 lysines कि कई साइट लेबलिंग में परिणाम हो सकता है शामिल हैं। गैर वर्दी लेबलिंग बाध्यकारी प्रभावित कर सकता है और डेटा विश्लेषण को मुश्किल के रूप में विभिन्न fluorophore अणुओं बाध्यकारी पर विभिन्न फ्लोरोसेंट तीव्रता संकेतों बटोर सकता है। ove करने के लिएइस समस्या rcome, हम फ्लैश fluorophore, 4 ', 5'-बीआईएस (1,3,2 dithioarsolan-2-YL) साइट प्रत्यक्ष लेबल करने के लिए fluorescein SBDS प्रोटीन का इस्तेमाल किया। यह एक मूल भाव अनुक्रम CCXXCC जहां एक्स किसी भी अमीनो सिस्टीन 16,17 के अलावा अन्य एसिड होता है से मिलकर फ्लैश-टैग के रूप में जानते में चार स्थान दिया गया है cysteines के लिए एक उच्च आत्मीयता के साथ एक arsenoxide डाई है। इस tetracysteine ​​मूल भाव एक साथ प्रोटीन की समग्र गुना के विघटन को रोकने के लिए एक उपयुक्त लिंकर साथ एन या प्रोटीन की सी टर्मिनस जेनेटिक इंजीनियरिंग से जोड़ा है। फ्लैश डाई और फ्लैश-टैग से मिलकर जोड़ी मूल कोशिकाओं 17 में रहने वाले साइट विशेष लेबल प्रोटीन के लिए डिजाइन किया गया था, लेकिन यह भी इन विट्रो में शुद्ध प्रोटीन लेबल करने के लिए के रूप में यह यहाँ उदाहरण है इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एंजाइमी रणनीतियों भी प्रोटीन 18 की साइट विशेष functionalization सक्षम करने के लिए विकसित किया गया है।

इस पांडुलिपि में हम प्रतिदीप्ति anisotropy एक की उपयोगिता का वर्णनSA उपकरण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए। बंधन बाध्यकारी वक्र आकार के सरल निरीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जबकि मात्रात्मक जानकारी प्रयोगात्मक डेटा के फिट से प्राप्त किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SBDS-फ़्लैश टैग प्रोटीन अभिव्यक्ति और शोधन

नोट: anisotropy प्रयोगों के लिए, एक फ्लैश-टैग अनुक्रम Cys-Cys-प्रो-Gly-Cys-Cys मानव पीसीआर द्वारा अनुक्रम कोडन SBDS की सी टर्मिनस को जोड़ा गया है के लिए इसी। इस का निर्माण अभिव्यक्ति वेक्टर pRSET-ए में subcloned और एक प्रोटीन एक एन टर्मिनल hexahistidine टैग (उनकी टैग) एन्कोडिंग व्यक्त करने के लिए कोलाई C41 कोशिकाओं में तब्दील हो गया था, मानव SBDS अनुक्रम और एक सी टर्मिनस फ़्लैश टैग 10 कोडिंग।

  1. SBDS फ्लैश प्रोटीन अभिव्यक्ति
    1. सक्षम ई रूपांतरण प्लाज्मिड pRSET-HisSBDS फ्लैश एक मानक गर्मी झटका प्रोटोकॉल 19 उपयोग करने के साथ कोलाई C41 कोशिकाओं। 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक ठोस Luria-Bertani (पौंड) मीडिया में कोशिकाओं थाली। पौंड ठोस मीडिया रचना 10 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 5 ग्राम खमीर निकालने, 10 ग्राम tryptone और 1 एल मात्रा के लिए 20 ग्राम अगर होते हैं।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति तब्दील बैक्टीरिया तक600 एनएम (ए 600) पर absorbance पौंड तरल 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक मीडिया का 1 एल में 0.5-0.7 तक पहुँचता है।
    3. संस्कृति के लिए 0.5 मिमी isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित है और आगे 5 घंटे के लिए ऊष्मायन जारी है।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3800 XG पर centrifugation द्वारा जीवाणु निलंबन लीजिए। सतह पर तैरनेवाला निकालें। इस बिंदु पर, या तो -20 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली दुकान या प्रोटीन शुद्धि के लिए तुरंत उपयोग करें।
  2. SBDS फ्लैश प्रोटीन शुद्धि
    नोट: सभी chromatographic कदम एक तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) प्रणाली या एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं। नी 2 + -affinity क्रोमैटोग्राफी एक 5 मिलीलीटर तेज प्रवाह स्तंभ का उपयोग करता है। Anionic एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी एक 5 मिलीलीटर मजबूत sulfopropyl केशन एक्सचेंजर स्तंभ का उपयोग करता है। 3 मिलीलीटर के प्रवाह की दर / मिनट सभी chromatographic चरणों के लिए इस्तेमाल किया गया था।
    1. SBDS Lysis बी के 35 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspenduffer (50 मिमी फॉस्फेट बफर पीएच 7.5, 300 मिमी NaCl, 20 मिमी imidazole) 4 मिनट 10 सेकंड पर और 30 सेकंड के चक्र बंद का उपयोग कर के कुल समय के लिए sonication द्वारा 1 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) और lyse के साथ पूरक, 4 पर सी।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए 9000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र।
    3. सतह पर तैरनेवाला रखें और सेलुलर मलबे को हटाने के लिए गोली त्यागें।
    4. SBDS lysis बफर के 3 स्तंभ की मात्रा (सीवी) के साथ नी 2 + आत्मीयता के स्तंभ संतुलित करना और पूरे स्तंभ पर स्पष्ट किया सतह पर तैरनेवाला परिचय।
    5. SBDS lysis बफर के 3 सीवी के साथ धोने से अनबाउंड प्रोटीन निकालें और SBDS क्षालन बफर के 3 सीवी (50 मिमी फॉस्फेट बफर पीएच 7.5, 300 मिमी NaCl, 250 मिमी imidazole) के साथ elute।
    6. 50 मिमी फॉस्फेट बफर पीएच 6.5 के साथ eluted प्रोटीन 6 गुना पतला और एक 0.22 माइक्रोन सेल्यूलोज झिल्ली के माध्यम से निस्पंदन द्वारा संभव समुच्चय को हटा दें।
    7. कम नमक एस स्तंभ के 3 सीवी साथ sulfopropyl केशन एक्सचेंजर स्तंभ संतुलित करनाबफर (50 मिमी फॉस्फेट बफर पीएच 6.5, 50 मिमी NaCl) और पिछले चरण से प्रोटीन नमूना परिचय।
    8. कम नमक एस स्तंभ बफर के 3 CV के साथ धो अपार सामग्री और 50 मिमी फॉस्फेट बफर पीएच 6.5, 1 एम NaCl के साथ एक कदम में प्रोटीन elute।
    9. 50 मिमी फॉस्फेट बफर पीएच 6.5 के साथ eluted प्रोटीन 3.3 गुना पतला। 15 मिनट के लिए 3800 XG पर centrifugation द्वारा ultrafiltration उपकरणों के साथ प्रोटीन ध्यान लगाओ। फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में प्रोटीन फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग पर यह दुकान।
    10. एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण और Coomassie धुंधला 20 से प्रोटीन की शुद्धता की जाँच करें।

2. EFL1 प्रोटीन अभिव्यक्ति और शोधन

नोट: EFL1 लड़की 1/10 अलग-अलग प्रमोटर 21 और वेक्टर pRS426 में Saccharomyces cerevisiae चटाई एक 3'UTR के नियमन के तहत व्यक्त की गई थी। पुनः संयोजक प्रोटीन मानव EFL1 isoform 1 एक तंबाकू खोदना वायरस प्रोटीज के लिए जुड़े हुए (encodesTEV) मान्यता साइट और सी टर्मिनस पर एक hexahistidine टैग।

  1. EFL1 प्रोटीन अभिव्यक्ति
    1. एस रूपांतरण प्लाज्मिड pRS426-EFL1TevHis एक मानक लिथियम एसीटेट प्रोटोकॉल 22 उपयोग करने के साथ cerevisiae BCY123 कोशिकाओं। uracil (एसडी URA) 2% (w / v) ग्लूकोज के साथ पूरक बिना मीडिया बाहर सिंथेटिक बूंद में सब बदल कोशिकाओं प्लेट। एसडी URA मीडिया की संरचना अमीनो एसिड के बिना 8 ग्राम खमीर नाइट्रोजन बेस, 11 ग्राम casamino एसिड होता है, 55 मिलीग्राम adenine सल्फेट, 55 मिलीग्राम tyrosine, 60 मिलीग्राम leucine और 1 एल मात्रा के लिए 60 मिलीग्राम tryptophan के होते हैं।
    2. संस्कृति 30 डिग्री सेल्सियस पर खमीर तब्दील जब तक एक 600 तक पहुँच जाता है 0.5% (डब्ल्यू / वी) ग्लूकोज के साथ पूरक के एसडी URA मीडिया 1.8 1 में एल।
    3. संस्कृति के लिए 2.8% जोड़ने (w / v) गैलेक्टोज द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित और 30 डिग्री सेल्सियस पर आगे 18 घंटे के लिए ऊष्मायन जारी है।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3800 XG पर centrifugation द्वारा खमीर निलंबन लीजिए। सतह पर तैरनेवाला निकालें।इस बिंदु पर, या तो -20 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली दुकान या प्रोटीन शुद्धि के लिए तुरंत उपयोग करें।
  2. EFL1 प्रोटीन शुद्धि
    नोट: सभी chromatographic कदम एक FPLC प्रणाली या एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं। नी 2 + -affinity क्रोमैटोग्राफी 3 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर एक 5 मिलीलीटर तेज प्रवाह स्तंभ का उपयोग करता है। आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी एक 125 मिलीलीटर स्तंभ 1 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर Superdex 200 राल के साथ पूर्व पैक का उपयोग करता है।
    1. EFL1 lysis बफर (50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8, 300 मिमी NaCl, 20 मिमी imidazole, 5 मिमी MgCl 2, 10% ग्लिसरॉल) 1 मिमी PMSF और 1 मिमी benzamidine के साथ पूरक की 50 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और द्वारा कोशिकाओं को बाधित , पर 2 मिनट और 15 मिनट के बंद के चक्र का उपयोग कर 6 मिनट की कुल समय के लिए कांच के मोती (o = 0.5 मिमी) का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक मनका डिब्बा पर घर्षण।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए 9000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र।
    3. सतह पर तैरनेवाला रखें और सेलुलर मलबे को हटाने के लिए गोली त्यागें। EFL1 lysis बफर के 3 सीवी के साथ नी 2 + आत्मीयता के स्तंभ संतुलित करना और स्तंभ पर सब स्पष्ट किया सतह पर तैरनेवाला परिचय।
    4. EFL1 lysis बफर के 3 सीवी के साथ धोने से अनबाउंड प्रोटीन निकालें और EFL1 क्षालन बफर के 3 सीवी (50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8, 300 मिमी NaCl, 250 मिमी imidazole, 5 मिमी MgCl 2, 10% ग्लिसरॉल) के साथ elute।
    5. एनिसोट्रॉपिक बफर के 1.5 सीवी (50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5, 300 मिमी NaCl, 5 मिमी MgCl 2, 10% ग्लिसरॉल, 5 मिमी β-mercaptoethanol) के साथ आकार अपवर्जन स्तंभ संतुलित करना।
    6. 1 मिलीलीटर EFL1 प्रोटीन वांछित मात्रा के लिए 3800 XG पर centrifugation द्वारा ultrafiltration उपकरणों के साथ नी 2 + आत्मीयता के स्तंभ से eluted के लिए ध्यान देना। आकार अपवर्जन स्तंभ पर नमूना परिचय।
    7. eluted प्रोटीन लीजिए और लगभग 30 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए ultrafiltration से ध्यान केंद्रित। फ्लैश -80 डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में प्रोटीन फ्रीज। वें सत्यापित करेंएसडीएस पृष्ठ विश्लेषण और Coomassie धुंधला 20 से प्रोटीन की ई पवित्रता।

फ्लैश फ्लोरोसेंट रंजक 4 ', 5'-बीआईएस (1,3,2 dithioarsolan-2-YL) Fluorescein साथ SBDS फ्लैश 3. लेबलिंग

  1. 4 'के 3 nmol साथ SBDS फ्लैश प्रोटीन के 3 nmol मिक्स, 5'-बीआईएस (1,3,2 dithioarsolan-2-YL) एनिसोट्रॉपिक बफर के 5 μl मात्रा में fluorescein डाई।
  2. प्रतिक्रिया 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए आगे बढ़ना। रात खत्म एनिसोट्रॉपिक बफर के खिलाफ नमूना Dialyze मुक्त डाई हटा दें।
  3. लेबल प्रोटीन का% यों तो लैम्बर्ट बीयर कानून का प्रयोग करें। 280 एनएम और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर उचित मात्रा का एक क्वार्ट्ज क्युवेट का उपयोग करने में 508 एनएम पर absorbance के उपाय। नोट: विचार करें दाढ़ अवशोषण गुणांक (एम -1 सेमी -1):
    Equation1B
  4. लेबल SBDS फ्लैश प्रोटीन 2 समीकरण का उपयोग कर की एकाग्रता की गणना।
    Equation2
  5. पिछले चरण से गणना सी SBDS फ्लैश प्रतिस्थापन द्वारा कुल SBDS प्रोटीन 3 समीकरण का उपयोग कर की एकाग्रता की गणना।
    Equation3
  6. लेबल प्रोटीन 4 समीकरण का उपयोग कर के प्रतिशत की गणना।
    Equation4

4. प्रतिदीप्ति एनिसोट्रॉपिक प्रयोगों

नोट: एनिसोट्रॉपिक प्रयोगों के साथ एक ध्रुवीकरण उपकरण बॉक्स और डाटा संग्रह उपकरण के सॉफ्टवेयर में प्रदान की anisotropy प्रोग्राम का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था लैस एक spectrofluorometer में किया गया। उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 8 एनएम के एक वर्णक्रमीय बैंडविड्थ के साथ 494 एनएम पर स्थापित किया गया था और उत्सर्जन 530 ± 25 एनएम के एक बैंड पास फिल्टर का उपयोग कर दर्ज किया गया था। माप एक 5 मिमी पथ की लंबाई 10 के साथ एक 200 μl क्युवेट में 25 डिग्री सेल्सियस पर किया गया।

  1. एक प्रतिदीप्ति क्युवेट में, 30 एनएम anisotropy बफर में SBDS फ्लैश के 200 μl जगह है और 30 माइक्रोन के EFL1 के 2 μl titrate। अच्छी तरह मिक्स और प्रतिक्रिया anisotropy मूल्य मापने के पहले 3 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
  2. EFL1 के 40 μl की कुल मात्रा तक दोहराएँ कदम 4.1 जोड़ा गया है।

5. डेटा विश्लेषण

  1. एक nonlinear कम से कम वर्गों प्रतिगमन एल्गोरिथ्म का उपयोग उचित बाध्यकारी मॉडल के लिए डेटा फिट। सबसे आम बाध्यकारी मॉडल के लिए समीकरण तालिका 1 में प्रस्तुत कर रहे हैं।
  2. सबसे अच्छा मॉडल है कि फिट 23 के बच निरीक्षण से प्रोटीन के बीच बातचीत का वर्णन मूल्यांकन। अतिरिक्त प्रयोगों के साथ चुना मॉडल का समर्थन करें।

तालिका 1. आम प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत बाध्यकारी मॉडल और गणितीय समीकरणों कि उन्हें का वर्णन है।0 / 54640table1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका एक

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

किसी भी anisotropy प्रयोग करने के बाद से यह प्रजाति का एक मिश्रण से मनाया anisotropy 5 समीकरण का प्रतिनिधित्व करती है fluorophore के प्रतिदीप्ति तीव्रता में बड़े परिवर्तन बाहर शासन करने के लिए महत्वपूर्ण है:

Equation5

जहां एफ मैं प्रत्येक घटक और आर के आंशिक प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करता है मैं इसी anisotropy है। प्रत्येक घटक की आंशिक प्रतिदीप्ति, दोनों पर निर्भर करता है अपनी एकाग्रता और उसके रिश्तेदार प्रतिदीप्ति, जो समीकरण 6 से परिभाषित किया गया है:

Equation6

जहां एक्स मैं वीं के तिल अंश का प्रतिनिधित्व करता हैई मैं नकदी और ओ वें मैं मैं वें नकदी की मात्रा उपज है।

इस प्रकार, यदि प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुमापन साथ नाटकीय रूप से बदलता है यह बेहतर है, या तो प्रतिदीप्ति संकेत और anisotropy संकेत के नहीं में परिवर्तन के एक समारोह के रूप में परिसर के गठन को मापने, या फिटिंग दोनों प्रतिदीप्ति तीव्रता और anisotropy से मनाया anisotropy मूल्य सही करने के लिए जानकारी। SBDS फ्लैश के प्रतिदीप्ति (चित्रा 2) का सुझाव है कि प्रतिदीप्ति anisotropy दो प्रोटीन के बीच बाध्यकारी को मापने के लिए पर्याप्त है EFL1 के लिए बाध्य पर नहीं महत्त्वपूर्ण बदलाव करता है।

चित्र 2
EFL1 की सांद्रता में वृद्धि का अनुमापन पर SBDS फ्लैश के चित्रा 2. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन। Fluorophore की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में परिवर्तन negligibl हैंई और अनुमापन साथ यादृच्छिक। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रतिदीप्ति anisotropy बाध्यकारी SBDS-फ्लैश करने के लिए EFL1 का अनुमापन से प्राप्त की अवस्था का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है। गुणात्मक, ग्राफ के आकार स्पष्ट रूप से पता चलता है कि दो प्रोटीन और बातचीत के अलावा पर anisotropy संकेत में वृद्धि हुई है इसका सबूत EFL1। इसके अलावा, anisotropy मूल्यों को एक पठार सुझाव है कि अनुमापन के अंत में सभी SBDS फ्लैश प्रोटीन EFL1 के साथ एक परिसर में मौजूद थे पर पहुंच गया। यह मात्रात्मक इन प्रोटीनों के बीच बातचीत का वर्णन है और एक माना बाध्यकारी मॉडल के लिए nonlinear कम से कम वर्गों प्रतिगमन का उपयोग कर डेटा फिट हैं और प्राप्त इसी हदबंदी निरंतर संतुलन के लिए तो संभव है। एक एक बाध्यकारी साइट मॉडल के लिए फिटिंग appropri नहीं कियाately प्रयोगात्मक डेटा (चित्रा 3 ए) का वर्णन है। यह बाध्यकारी वक्र में फिटिंग का पता लगाने से लेकिन यह भी फिट (सैद्धांतिक और प्रायोगिक डेटा के बीच अंतर) का बच गया है कि प्रशंसनीय और nonrandom हैं के विचलन से न केवल स्पष्ट है। यह सच है कि एक भी बाध्यकारी साइट मॉडल चित्रा 3 में प्रस्तुत प्रयोगात्मक डेटा के लिए मनाया कि के रूप में एक sigmoidal वक्र के बजाय एक अतिशयोक्तिपूर्ण वक्र द्वारा गणितीय वर्णन किया गया है के साथ अच्छी तरह से सहमत हैं। दूसरी ओर, मॉडल इस तरह के दो समान या दो अलग अलग बंधन के रूप में साइटों बेहतर प्रयोगात्मक डेटा और फिट शो का बच कोई व्यवस्थित एक दो साइट एसोसिएशन मॉडल (चित्रा 3 बी-सी) के समर्थन के विचलन का वर्णन है। किसी भी अन्य प्रयोगात्मक जानकारी के अभाव में जो दो मॉडल की EFL1 और SBDS के बीच बाध्यकारी तंत्र के अनुरूप स्थापित करने के लिए मुश्किल है। फिर भी, SBDS और EFL1 दोनों monomeric प्रोटीन होते हैं, तो यह diffic हैULT एक दो समान बाध्यकारी साइटों मॉडल की परिकल्पना की गई है।

चित्र तीन
। (ए) ही साइट, (बी) के दो समान साइटों: चित्रा EFL1 और SBDS फ्लैश के बीच बातचीत का 3. प्रतिदीप्ति anisotropy बाध्यकारी इज़ोटेर्म ऊपरी भूखंडों में से प्रत्येक में सतत लाइन अलग बंधन मॉडल के लिए डेटा के फिट करने के लिए संगत और (ग) दो गैर-समान साइटों। लोअर भूखंडों इसी मॉडल के लिए फिट के बच प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटीन के साथ अधिकांश जैव रासायनिक प्रयोगों न केवल शुद्ध प्रोटीन, लेकिन यह भी उनमें से बड़ी मात्रा में इस्तेमाल तकनीक पर ध्यान दिए बिना की आवश्यकता होती है। इस कारण से, प्रयोगों के इस प्रकार के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन, heterologous अभिव्यक्ति द्वारा प्राप्त कर रहे हैं, क्योंकि यह यहाँ प्रस्तुत मामला था। पुष्पन स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन अणु में एक fluorophore की उपस्थिति की आवश्यकता है। सुगंधित अवशेषों विश्लेषण उनके संकेत का उपयोग कर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए पेचीदा, एक प्रोटीन की आंतरिक fluorophores का गठन हालांकि, बाद से वे सबसे अधिक प्रोटीन के लिए आम हैं और दोनों में उपस्थित होना होगा, रिसेप्टर प्रोटीन और ligand। इसके अतिरिक्त, नियासिन के जीवनकाल प्रतिदीप्ति anisotropy प्रयोगों के लिए बहुत छोटा है। इस कारण से, यह अध्ययन प्रोटीन से एक के लिए बाह्य fluorophores जोड़ने के लिए आम है। यह अंत करने के लिए, एक fluorophore डाई 4 ', 5'-बीआईएस (1,3,2 dithioarsolan-2-YL) एफ के बीच एक समन्वय बांड के माध्यम से SBDS की सी टर्मिनस के लिए जोड़ा गयाएक tetracysteine ​​मूल भाव जेनेटिक इंजीनियरिंग से प्रोटीन में पेश साथ luorescein। प्रोटीन है कि fluorophore bares का चयन एक यादृच्छिक बात नहीं है। प्रोटीन यहां अध्ययन (SBDS 29 केडीए और EFL1 127 केडीए) के आकार के कारण, हम मुक्त लेबल-SBDS के बीच anisotropy में एक बड़ा परिवर्तन और कहा कि EFL1 के साथ परिसर में होने की उम्मीद है, परिवर्तन के बीच मुक्त लेबल-EFL1 और कहा कि उम्मीद की तुलना SBDS करने के लिए बाध्य है। मन में यह असर, एक फ़्लैश टैग SBDS में बजाय EFL1 करने के लिए पेश किया गया था। एक अन्य पैरामीटर महत्वपूर्ण विचार करने के लिए जब एक प्रतिदीप्ति anisotropy प्रयोग की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया समाधान के अवशोषण है। क्युवेट में समाधान के ऑप्टिकल घनत्व 0.1 उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में से अधिक नहीं होना चाहिए, और पूरे अनुमापन साथ स्थिर रहना चाहिए। अन्यथा, आंतरिक फिल्टर प्रभाव माप में हस्तक्षेप कर सकते हैं और के लिए सही किया जाना चाहिए। प्रयोग यहाँ प्रस्तुत, प्रोटीन का अध्ययन किया excitat की तरंग दैर्ध्य में अवशोषित नहीं हैआयन या 4 ', 5'-बीआईएस (1,3,2 dithioarsolan-2-YL) fluorescein डाई के उत्सर्जन; इस प्रकार आंतरिक फिल्टर प्रभाव एक समस्या पैदा नहीं करता है।

डेटा संग्रह के बारे में, और बाद में ठीक से डेटा फिट करने के लिए, यह बाध्यकारी वक्र साथ संक्रमण के माध्यम से कई डेटा अंक के साथ निचले और ऊपरी आधार रेखा अच्छी तरह से परिभाषित करने के लिए आवश्यक है। अन्यथा, डेटा की फिटिंग गलत है और बाध्यकारी मोड के बारे में जानकारी खो दिया जा सकता है। एक सभ्य बाध्यकारी वक्र यह आवश्यक है कि मुक्त ligand की एकाग्रता नीचे दो लघुगणक इकाइयों द्वारा और हदबंदी लगातार ऊपर अलग है का वर्णन करने के लिए, हालांकि, प्रयोगात्मक इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए मुश्किल हो सकता है। निचली सीमा में, उपकरणों की संवेदनशीलता के साथ समस्याओं को विशेष रूप से उत्पन्न हो सकती है जब प्रोटीन के बीच समानता बहुत अधिक है, जबकि बड़े सांद्रता प्राप्य ligand की घुलनशीलता समस्याओं के कारण नहीं हो सकता। यह स्पष्ट रूप से जब SBDS के बीच बातचीत का परीक्षण उदाहरण थाS143L रोग उत्परिवर्ती और EFL1। इस उत्परिवर्ती EFL1 के लिए बाध्य इस हद तक है कि यह एक उचित बाध्यकारी वक्र प्राप्त करने के लिए संभव नहीं था क्योंकि EFL1 केवल 70 माइक्रोन के लिए ऊपर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है और प्रोटीन अनुमापन 10 के दौरान 5 गुना ≈ पतला हो जाता है खलल डाल दिया। इस प्रकार, यह समानता का एक मोटा अनुमान अनुमापन योजना का अनुकूलन और सुनिश्चित करें कि ligand एकाग्रता में कूदता पदों पर नहीं होती है कि एक कम सटीक फिट का कारण होता है बनाने के लिए आवश्यक है। उदाहरण के लिए, चित्रा 3 में प्रस्तुत बाध्यकारी वक्र की प्रारंभिक अंक लापता यह एक अतिशयोक्ति एक भी बाध्यकारी साइट मॉडल की ओर शोधकर्ता गुमराह तरह लग रही होगी।

एक बार एकत्र, डेटा एक माना बाध्यकारी मॉडल पर लगे थे। तुलना डेटा प्रतिदीप्ति में, anisotropy डेटा आगे हेरफेर के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है और कमजोर पड़ने प्रभाव के लिए सुधार की जरूरत नहीं है। तालिका 1 में प्रस्तुत समीकरणों विचार है कि [एल] ≈[एल] 0 अनुमापन के हर बिंदु पर। यह नहीं हो सकता है जब प्रोटीन के बीच समानता बहुत अधिक ऐसे अनुमापन ligand कमी के पहले अंक में होता है। इस परिदृश्य में, और अधिक जटिल द्विघात समीकरण वर्णित कहीं और 23 डेटा फिट करने के लिए आवश्यक हैं। प्रयोग में यहाँ वर्णित, ligand EFL1 SBDS फ्लैश की एकाग्रता और अनुमापन के प्रत्येक बिंदु पर EFL1 एकाग्रता में परिवर्तन की अवहेलना की जा सकती है की तुलना में बड़े अधिक में हमेशा से था। के रूप में परिणाम अनुभाग में चर्चा की, एक दो गैर-बाध्यकारी साइटों समान मॉडल सबसे अच्छा प्रयोगात्मक डेटा (चित्रा 3 सी) का वर्णन किया। समूह में प्राप्त अतिरिक्त जैव रासायनिक जानकारी का विचार है कि इस EFL1 और SBDS के बीच बातचीत का वर्णन करने के लिए सही मॉडल है का समर्थन करता है (डेटा) नहीं दिखाया। बातचीत के इस मोड आम है ऐसे में EFL1 और SBDS के रूप में बहु-डोमेन प्रोटीन, कर रहे हैं, और कई उदाहरण साहित्य 24-26 में मौजूद हैं। एक हालांकि, यह हैLSO एक गैर विशिष्ट बातचीत है कि उनके ligand के लिए अलग समानताएं के साथ अलग बाध्यकारी साइटों की एक बातचीत मॉडल के रूप में प्रदर्शित कर सकते हैं बाहर शासन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह अंत करने के लिए, एक Scatchard साजिश बहुत उपयोगी है। अन्य तकनीकों की तुलना में, प्रतिदीप्ति anisotropy संकेत गठन जटिल की राशि की रिपोर्ट है और इस प्रकार यह डेटा के साथ एक Scatchard साजिश का निर्माण संभव है। एक उत्तल Scatchard वक्र नकारात्मक सहकारिता या गैर विशिष्ट बंधन के साथ एक दो अलग बाध्यकारी साइटों मॉडल का सुझाव है, जबकि एक अवतल Scatchard साजिश सकारात्मक सहकारिता या ligand अस्थिरता (चित्रा 4) के साथ एक दो अलग बाध्यकारी साइटों मॉडल निकलता है। प्रयोगात्मक डेटा के विश्लेषण से एक अवतल आकार EFL1 और SBDS (चित्रा 4D) के लिए दो स्वतंत्र बाध्यकारी साइटों के मॉडल के समर्थन के साथ एक Scatchard भूखंड दिखाया। इसके अलावा, सकारात्मक सहकारिता एक हिल विश्लेषण है कि 1.8 ± 0.02 की एक पहाड़ी गुणांक मूल्य में हुई प्रदर्शन के बाद इस बात की पुष्टि की गई थी (डेटा) नहीं दिखाया।


चित्रा 4. विभिन्न प्रोटीन, प्रोटीन बाध्यकारी मॉडल के लिए Scatchard भूखंडों। (ए) एकल बाध्यकारी साइट या कई समान साइटों है कि बातचीत नहीं करते। (बी) के नकारात्मक सहकारिता या गैर विशिष्ट बंधन के साथ कई अलग अलग बाध्यकारी साइटों। (सी) सकारात्मक सहकारिता या ligand अस्थिरता के साथ कई अलग अलग बाध्यकारी साइटों। (डी) Scatchard साजिश SBDS-फ्लैश करने के लिए EFL1 का अनुमापन से प्राप्त प्रयोगात्मक anisotropy आंकड़ों के विश्लेषण से उत्पन्न। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

प्रतिदीप्ति anisotropy एक समाधान के आधार पर, सच-संतुलन तकनीक है कि अध्ययन के अणुओं की आवश्यकता की स्थिति का परीक्षण पर समाधान में रहने के लिए है। उस पर नहीं अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताLy पूर्ण लंबाई प्रोटीन लेकिन यह भी बाद translational संशोधनों के साथ प्रोटीन डोमेन, उत्परिवर्ती प्रोटीन या यहां तक ​​कि पेप्टाइड्स के बीच बातचीत के बीच बातचीत। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति anisotropy भी फ्लोरोसेंट संवेदनशील झिल्ली जांच का उपयोग लिपिड झिल्ली प्रोटीन के बंधन को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण सफलतापूर्वक प्रभाव है कि अल्फा-synuclein synaptic पुटिका पैकिंग 27 पर है अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्रतिदीप्ति anisotropy का मुख्य लाभ में से एक यह है कि यह इस तरह है कि सच हदबंदी स्थिरांक यंत्रवत जानकारी के साथ एक साथ प्राप्त किया जा सकता अध्ययन के अणुओं के बंधन पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है। अन्य biophysical तकनीकों में भी इस तरह की जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रतिदीप्ति anisotropy नमूना की छोटी मात्रा की आवश्यकता है और यहाँ के रूप में प्रस्तुत किया है, केवल संतुलन में नहीं किया जा सकता है, लेकिन यह भी रोका प्रवाह fluorometry के रूप में तेजी से कैनेटीक्स, का उपयोग करते हुए, संघ प्राप्त करने के लिए और हदबंदी दरस्थिरांक (क्रमशः पर कश्मीर और कश्मीर बंद,) 28। लाभ और अन्य biophysical तकनीकों के संबंध में प्रतिदीप्ति anisotropy के नुकसान के साथ एक तुलनात्मक तालिका तालिका 2 में प्रस्तुत किया है। सभी तरीकों वर्णित सच संतुलन तकनीकों हैं, क्योंकि उनमें से कोई भी स्वतंत्र और बाध्य अंशों की यांत्रिक जुदाई की एक प्रक्रिया में शामिल हैं। के रूप में परिणाम खंड में बताया गया है, अगर एक लेबल प्रोटीन की प्रतिदीप्ति तीव्रता काफी हद तक बातचीत पर बदलता है, इस संपत्ति तो बाध्यकारी की आत्मीयता यों इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन बातचीत से उत्पन्न आणविक बातचीत पर ही बाह्य fluorophore के संभावित हस्तक्षेप सुझाव है; अर्थात् इसी गैर लेबल प्रोटीन की हदबंदी निरंतर (कश्मीर घ) मूल्य के संभावित परिवर्तन। जैसे, प्रतिदीप्ति anisotropy चर्चा की तुलना में कम आक्रामक तकनीक पर विचार किया जा सकता हैप्रतिदीप्ति तीव्रता में anges के बाद से पूर्व लागू किया जाना चाहिए जब प्रतिदीप्ति तीव्रता बातचीत पर नहीं बदलता है। इस अर्थ में, हालांकि प्रोटीन की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry (आईटीसी) आणविक बातचीत के एक सच्चे कश्मीर घ मूल्य प्रदान कर सकते हैं, क्योंकि यह एक लेबल मुक्त तरीका है। दूसरी ओर, यंत्रवत जानकारी प्राप्त नहीं है, क्योंकि गर्मी में मतभेद केवल प्रक्रिया की तापीय धारिता पर रिपोर्ट नहीं है और जटिल की राशि का गठन 29।

इसकी तुलना में, इस तरह के खमीर दो संकर या टुकड़ा पूरक assays शुद्ध प्रोटीन, लेकिन वे केवल बाध्यकारी के मोड पर अर्द्ध मात्रात्मक जानकारी उपलब्ध कराने की आवश्यकता नहीं है के रूप में विवो तरीकों में। तथ्य यह है कि खमीर दो संकर तकनीक में बाध्यकारी मिलर इकाइयों का उपयोग करने की शक्ति को व्यक्त करने के लिए संभव है के बावजूद, यह एक वास्तविक संतुलन शोधकर्ता के नियंत्रण से बाहर लगातार और कई कारकों इसे बदल सकते हैं नहीं है।

तालिका 2 फायदे और आमतौर पर इस्तेमाल किया biophysical प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक का नुकसान। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
सारणी 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Glass beads Biospec Products 11079105
Tris Base Formedium TRIS01 Ultra pure
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein ThermoFischer Scientific LC6090 This kit contains the dye to label a FlAsH tag
Ampiciline IBI Shelton Scientific, Inc IB02040
D(+)-Glucose Anhydrous Formedium GLU03
D(+)-Galactose Formedium GAL03
L-Leucine Formedium DOC0157
L-Tryptofan  Formedium DOC0189
Bezamidine hydrochloride Sigma-Aldrich B6506-5G
PMSF Gold Biotechnology, Inc P-470-25 Phenylmethylsulfonyl fluoride
NaCl Formedium NAC02 Sodium Chloride 
Glycerol Tecsiquim, S.A. de C.V. GT1980-6
MgCl2 Merck Millipore Corporation 1725711000 Magnesium Chloride
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-500G
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786-500G Potassium phosphate dibasic
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139-500G Sodium phosphate monobasic
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0410
Yeast extract Formedium YEM03 Micro Granulated
L-Tyroisne Formedium DOC0193
Adenine sulphate Formedium DOC0230
Casamino acids Formedium CAS03
Tryptone IBI Shelton Scientific, Inc IB49182
IPTG Formedium IPTG025
Filtration units Merck Millipore Corporation UFC901096 Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
Membrane Filter Merck Millipore Corporation GSWP04700 Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain
Ni2+ affinity column QIAGEN 30760 Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation exchanger column GE Healthcare Life Science 17-5157-01 HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Size Exclusion column GE Healthcare Life Science 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Fluorescence cell Hellma Analytics 111-057-40
Spectrophotometer Agilent Technologies G6860AA Cary 60 UV-Vis
Shaker ThermoFischer Scientific SHKA4000-7 MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C
Centrifuge ThermoFischer Scientific 75004271 Heraeus Megafuge 16R
FPLC Pharmacia Biotech Discontinued FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction
Spectrofluorometer Olis No applicable Olis DM 45 with Polarization Toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
  2. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  3. Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
  4. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  5. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).
  6. Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11 (12), 848 (2015).
  7. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
  8. Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).
  9. Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).
  10. Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).
  11. Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).
  12. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Third, Springer US. (2010).
  13. Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
  14. Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
  15. Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , Wiley. (2015).
  16. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  17. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  18. Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).
  19. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  20. Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
  21. West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).
  22. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
  23. Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
  24. Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).
  25. Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).
  26. Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).
  27. Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
  28. Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
  29. Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).

Tags

जैव रसायन अंक 116 प्रतिदीप्ति anisotropy प्रतिदीप्ति बढ़ाव कारक की तरह 1 Shwachman-डायमंड सिंड्रोम प्रोटीन प्रोटीन प्रोटीन बातचीत Fluorophore
एक उपकरण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के रूप में प्रतिदीप्ति एनिसोट्रॉपिक
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gijsbers, A., Nishigaki, T.,… More

Gijsbers, A., Nishigaki, T., Sánchez-Puig, N. Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (116), e54640, doi:10.3791/54640 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter