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Bioengineering

Acquose goccioline utilizzate come microreattori enzimatica e loro attuazione elettromagnetica

doi: 10.3791/54643 Published: August 28, 2017

Summary

Sistemi di laboratorio-in-a-goccia reazione consentono l'implementazione versatile di reazioni complesse in una scala di microfluidica. Una piattaforma di azionamento automatico costituito da una matrice 3 x 3 di bobine elettromagnetiche è stata sviluppata e utilizzato con successo per Unione due 10 µ l microreattori e quindi avvia una reazione enzimatica nei marmi liquidi risultante.

Abstract

Per l'efficace attuazione di sistemi di reazione microfluidici, quali PCR ed elettroforesi, il movimento di piccoli volumi di liquidi è essenziale. In convenzionale laboratorio-su-a-chip-piattaforme, solventi e campioni vengono passati attraverso canali microfluidici definiti con installazioni di controllo di flusso complesso. La piattaforma di azionamento gocciolina presentata qui è un'alternativa promettente. Con esso, è possibile spostare una goccia di liquido (microreattore) su una superficie piana di una piattaforma di reazione (laboratorio-in-a-goccia). L'attuazione di microreattori sulla superficie idrofobica della piattaforma si basa sull'uso di forze magnetiche che agiscono sulle coperture esterne del liquido scende che è costituito da un sottile strato di particelle di magnetite superidrofobi. La superficie idrofoba della piattaforma è necessaria per evitare il contatto tra il nucleo liquido e la superficie per consentire un buon movimento del microreattore. Sulla piattaforma, microreattori uno o più volumi di 10 µ l possono essere posizionate e spostati contemporaneamente. La stessa piattaforma è costituito da una matrice 3 x 3 di bobine elettriche doppie che possono ospitare nuclei di neodimio o di ferro. I gradienti di campo magnetico sono controllati automaticamente. Dalla variazione dei gradienti di campo magnetico, magnetico coperture idrofobiche dei microreattori può essere manipolata automaticamente per spostare il microreattore o aprire la shell reversibilmente. Reazioni di substrati ed enzimi corrispondenti possono essere avviate attraverso la fusione il microreattori o portandoli a contatto con catalizzatori immobilizzati sulla superficie.

Introduction

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Applicazioni tecniche con micro reazioni avvengono principalmente in fiches microchannel predefiniti. Questi sistemi sono ampiamente stabiliti e ampiamente descritto in letteratura (inter alia 1,2,3). Nel 2011, il fatturato di microfluidica tecnologie in tutto il mondo pari a 6,2 miliardi di euro 4. Al contrario, l'uso dei compartimenti liberamente spostabile micro reattore era precedentemente solo esaminato e pubblicato in misura limitata. Il metodo più comune per lo spostamento acquose micro gocce è Elettrowetting 5. Altri metodi per il movimento delle gocce sulle superfici sono basati su campi elettrici 6, forza magnetica 7 o azionamento acustico 8. Grazie alla loro superficie sfavorevole in rapporto al volume, questi sistemi basati su goccia microreattore sono esposti agli effetti di forte evaporazione. Così, il movimento di discesa è solitamente stabilito come un sistema bifase liquido, dove la fase superiore ha un alto punto di ebollizione proteggendo la fase acquosa da evaporazione. Tuttavia, questo approccio comporta un elevato rischio di contaminazione la goccia di reazione tramite diffusione incontrollata. Si tratta di un ostacolo significativo per l'istituzione di tecnico dei sistemi menzionati.

Recente lavoro si occupa di transizioni di fase solido-liquido non aderente. Un approccio altamente efficace è l'uso di superfici superidrofobiche, consentendo la formazione di goccioline acquose sferiche. Un'estensione di questo concetto di reazione è l'uso dei compartimenti di reazione micro con una superficie superidrofobi o shell, che possono ad esempio consistere di politetrafluoroetilene (PTFE) particelle 9. Loro angoli di contatto sulle superfici sono solitamente nella gamma di 160° (a seconda la rugosità superficiale). I compartimenti sferici quindi forniscono una resistenza minima al movimento su una superficie e contemporaneamente forniscono una protezione contro l'evaporazione dell'acqua.

Acquose gocce rivestiti con micro particelle di PTFE dimensioni possono mantenere la loro forma sferica fino ad un diametro di circa 2 mm. A volumi elevati, la shell idrofobica solitamente non è completamente chiuso piu ' 10. L'influenza di altri materiali di shell e l'espansione del campo di applicazione del liquido marmo ai solventi non polari è stati implementati da Gao e McCarthy utilizzando liquidi ionici 12. Per la formazione di conchiglie basati su particelle idrofobiche, finora i diametri delle particelle di dimensioni di 10 nm-30 µm sono stati descritti 11,14,16. Nuovi studi hanno mostrato che nanoparticelle idrofobiche come materiale di shell sono d'uso ancora migliore di quella di microparticelle 13. Primi studi di stabilità ha confermato un aumento nella stabilità quando la dimensione delle particelle è ridotto da ca. 600 nm a ca. 100 nm. Questo probabilmente deriva dalla distribuzione delle particelle più densa di circa la sfera acquosa 15.

La protezione dei compartimenti di reazione acquosa da un guscio idrofobico e loro designazione come biglie liquido in primo luogo è stato descritto nel 2001 da Aussillous et al. Mahadevan et al. 17 , 18. da allora, sono state descritte poche applicazioni di questi comparti di reazione definita. Ad esempio, un sensore di gas basato su marmi liquido 19 e un metodo di rilevazione di contaminazione dell'acqua basato su base qualitativa otticamente sono stati sviluppati 20. Gli autori distinguono i vantaggi dei tassi di reazione alto e il basso consumo di sostanze chimiche dei loro sistemi di reazione micro. Pubblicazioni recenti a che fare con la produzione di marmi liquido pH sensibili 16 o la rappresentazione di 'Particelle Janus' con due diversi rivestimenti di funzionalità diverse. Ad esempio, Bormashenko et al. potrebbe sintetizzare un microreattore con rivestimenti in Teflon e semiconduttori nerofumo 21. Inoltre è stato dimostrato che microreattori possano in modo efficiente e conveniente sintetizzare polyperoxides assorbendo ossigeno esterno come comonomero attraverso l' interfaccia gas-liquido permeabile 24. In un altro approccio il guscio di base di particelle di silice liquidi Marmi forniscono le superfici reattive substrato per regolare la reazione classica specchio d'argento 26. Problemi attuali di ricerca e sviluppo nel campo delle goccioline idrofila-core-idrofobo-shell sono la regolazione della dimensione delle particelle, la produzione riproducibile di goccioline monodispersi, la bagnabilità delle superfici e l'effetto di un secondo idrofilo shell su micro reazione scomparti 22, nonché un migliore controllo delle traiettorie delle gocce, per esempio per lo sviluppo di microPCR-sistemi continui 4.

Un azionamento magnetico di questi microreattori offre il vantaggio di intervalli di movimento relativamente elevato e una buona selettività della forza quando si lavora in sistemi biochimici. Quando si utilizza particelle di magnetite idrofobo, soddisfano sia la funzione della trasmissione forza magnetica al movimento dei microreattori, nonché la funzione di un guscio idrofobico. Il movimento magnetico di goccioline con particelle magnetiche all'interno di una gocciolina è stato postulato per la prima volta nel 2006 da Lehmann et al. 23 e Shikida et al. 25, che ha usato manualmente spostato magneti permanenti come attuatori per la mobilitazione di una singola goccia. Un altro approccio per spostare una piccola quantità di liquido è stato realizzato da Zhao et al., chi come shell magnetico usato idrofobiche particelle Fe3O4 . Il guscio del marmo liquido magnetico è stato aperto sul lato superiore del trascinamento di un campo magnetico inverso verticale 27. Basato su questo concetto, Xue et al sono stati in grado di sviluppare le particelle che formano un microreattore con una tensione superficiale di dyne 20,1 cm− 1 28. Lin et al fabbricato romanzo basato su cellulosa micro/nano gerarchiche sfere con superparamagnetismo sia superhydrophobicity che garantiscono stabilità di Dio per trasporto e manipolazione di goccia di liquido magnetico 31. Questo finora è stato rilasciato solo come un prova-de-principio studia e non utilizzato per qualsiasi applicazione. Il controllo magnetico ed elettrico dei Marmi del liquidi è attualmente perseguito nei primi approcci. Zhao et al. 2010 15 e Zhang et al. 2012 29 sono stati in grado di sviluppare una manipolazione di goccia dal movimento manuale (a mano) di un magnete permanente sotto le goccioline core-shell. Bormashenko et al. 11 raggiunto l'accelerazione di un marmo liquido ferromagnetico a una velocità di 25 cm s-1 avvicinando un magnete al neodimio. Il principio di cui sopra studi sono stati effettuati esclusivamente tramite il movimento manuale di un piccolo magnete permanente. Come passo successivo sviluppo, Zhao et al sono stati recentemente in grado di stimare la densità di flusso magnetico necessaria per il movimento di liquido magnetico marmo variando la distanza di un magnete permanente 30. Per un controllo di reazione paragonabile a quella dei sistemi comuni di lab-on-a-chip, sembra inevitabile per fornire i mezzi di controllo automatizzato del discreto liquido volumes. Per soddisfare questa esigenza, che abbiamo sviluppato un nuovo sistema di controllo basato su pendenze del campo variabile di fissarsi, spostare e aprire i microreattori magnetico.

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Protocol

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1. Hydrophobization di nanoparticelle magnetiche

  1. per la sintesi delle particelle magnetiche idrofobiche, aggiungere 0,85 g di FeCl 3 esaidrato (3.14 mmol) e 0,30 g FeCl 2 tetraidrato (1,51 mmol) 200 mL soluzione di acqua/etanolo (4:1 v/v).
  2. a questa miscela, aggiungere 0,20 mL 1h, 1h, 2 H, 2h-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFOTES) (5,23 mmol) con agitazione vigorosa di un agitatore magnetico (500 giri/min). Eseguire la sintesi in un'atmosfera di gas inerte (N 2) utilizzando un pallone con un tappo di sughero al fine di impedire l'ossidazione secondaria di particelle di magnetite.
  3. Regolare la goccia di soluzione di saggio con una soluzione di idrossido di ammonio (1,5 M) ad un pH di 8 (pH determinato da un pH-metro). Agitare la soluzione per 24 h con un agitatore magnetico.
  4. Separare le particelle magneticamente dalla soluzione posizionando il pallone su una barra magnete (neodimio magnete parallelepipedo 40 x 20 x 10 mm, adesivo forza 25 kg). Versare la soluzione mantenendo il magnete attaccato al fondo del matraccio.
  5. Lavare le particelle tre volte con la soluzione acqua/etanolo durante l'utilizzo di una barra magnete come descritto al punto 1.4). Asciugare le particelle a 60 ° C per 24 h (rendimento ca. 0,43 g).
  6. Per analizzare le particelle, utilizzare un microscopio elettronico a scansione secondo produttore ' istruzioni s.

2. Fabbricazione di microreattori

  1. macinare tutte le particelle secche leggermente con un pestello di vetro e successivamente tutti loro posto direttamente in un piatto di pesata (46 × 46 × 8 mm, polistirolo).
  2. Pipetta 10 µ l di soluzione reazione (composizione come descritto in 5.1) su tutte le particelle e sposta il peso leggermente pan in modo circolare per circa 10 s (massa della particella per un microreattore 10 µ l: ca. 3.2 x 10 -7 kg < sup classe = "xrif" > 33). Conservare le rimanenti particelle (particelle che non auto-assemblarsi intorno la soluzione di reazione) a temperatura ambiente per ulteriori applicazioni.
  3. Per la misurazione dell'angolo di contatto del microreattore, costruire un microreattore 5 µ l con acqua come descritto al punto 2.2), posto su un film di teflon e analizzare l'angolo di contatto utilizzando un dispositivo di misura di angolo di contatto ottico secondo produttore ' s istruzioni.

3. 3D-stampa dei corpi bobina

  1. progettare i corpi di doppia bobina con un'altezza di 16 mm (una camera), un diametro di 10 mm e un diametro interno di ca. 4 mm utilizzando un software di CAD secondo produttore ' s istruzioni.
  2. Stampare i corpi bobina con una stampante 3D secondo il produttore ' s istruzioni utilizzando materiali come polilattide filamento. Avvolgere i corpi con un filo di rame di 0,08 mm per raggiungere 4.500 avvolgimenti utilizzando un computer controllato bobinatrice.

4. Fabbricazione della piattaforma azionamento

  1. Disponi il doppio bobine in una matrice (per esempio 3 x 3) su un quadro elettrico con un elemento Peltier sotto, avvitare le bobine doppie e collegarli a un controllo tramite nastro cavo ( Figura 3).
  2. a seconda dell'applicazione desiderata, aggiungere un nucleo di ferro (altezza 32 mm, 4 mm di diametro) o un magnete al neodimio (del 12,5 mm di altezza, della 4 mm di diametro da pranzo, della 1.035 kA m -1) al corpo della bobina per ottenere un campo magnetico più forte.
  3. Alla fine della piattaforma posto un piatto, preferibilmente di vetro al quarzo, con un'altezza massima di 1 mm sulla matrice bobina.
  4. Mettere un microreattore sulla superficie della piattaforma.
  5. Di ritirare le particelle superiore dalla soluzione di reazione e quindi aprire un microreattore attivare una bobina con un magnete al neodimio all'interno usando il comando menzionato in 4.1). Per chiudere il microreattore disattivare nuovamente la bobina.
  6. Per unire due microreattori che sono inizialmente ca. 10 mm a parte usare magneti al neodimio come descritto in 4.2). Sollevare il magnete nei corpi bobina richiesto attivando le bobine per ca. 25 s per aprire un microreattore (distanza richiesta fra magnete e microreattore bugie circa 12 mm) e spostare l'altro nella stessa posizione sulla piattaforma.
  7. Raffreddare la reazione soluzione in microreattore sulla superficie della piattaforma e per diminuire la temperatura della bobina accendere l'elemento Peltier posizionato sotto la matrice di bobina, come descritto in 4.1).

5. Reazione enzimatica di fusione microreattori

  1. perossidasi di rafano sciogliere ad una concentrazione di 0,1 µ g mL -1 in tampone fosfato di potassio (0,1 M, pH 6.5). Diluire il substrato, 10-acetile-3,7-dihydroxyphenoxazine (10 mM in dimetilsulfossido (DMSO)) con tampone fosfato di potassio (0,1 M, pH 6.5) ad una concentrazione di 200 µM.
  2. Uso 10 µ l di ciascuna di queste soluzioni per costruire due microreattori come descritto al punto 2.2). Unire i due microreattori facendo la media delle forze magnetiche (neodimio cilindro: 12,5 mm x 4 mm, 1.035 kA m -1) come descritto in 4.6) a 25 ° C.
  3. Rilevare la reazione posizionando una sonda a fluorescenza (lunghezza d'onda di eccitazione: 570 nm, lunghezza d'onda di emissione: 585 nm) ca. 10 mm direttamente sopra un microreattore aperto prima dell'Unione.

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Representative Results

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Le particelle di shell hanno un diametro di circa 640 nm. Le nanoparticelle magnetizable racchiuse in questo particelle di shell fluorosilane hanno diametri in un range tra 22 nm e 37 nm. Un microreattore 5 µ l con acqua come un nucleo liquido aveva un angolo di contatto di circa 160°.

La forza necessaria per spostare un microreattore 10 µ l, come descritto in precedenza è 1.34 ± 0,08 µN. la figura 1 Mostra la forza elettromagnetica di una bobina con 4.500 avvolgimenti di filo di rame e un nucleo di ferro interno alimentato con 58 mA. La distribuzione della forza è stimata da un modello ad elementi finiti (FEM) per determinare le proprietà di bobina necessaria per spostare un microreattore. Come si può vedere nella Figura 1, la forza magnetica condotta dalla bobina descritta è abbastanza forte per spostare un microreattore a una distanza più lontano di 10 mm dal centro della bobina.

La forza magnetica per aprire un microreattore è uguale a 0,85 ± 0.05 mN che è molto più elevato rispetto la forza necessaria per spostare la goccia. Come la forza magnetica indotta dalla bobina con il nucleo di ferro all'interno (Figura 1) non è abbastanza forte per aprire un microreattore, un magnete al neodimio è stato utilizzato nelle bobine. Alimentando le bobine doppie in direzioni di flusso di corrente alternata, il magnete permanente può essere spostato verso o dalla piattaforma. In tal modo, il microreattore può essere aperta o chiusa magneticamente. Se due microreattori con un guscio completamente intatto si trovano fianco a fianco non unire come la tensione superficiale inibisce la loro fusione. Pertanto, almeno uno deve essere aperto.

La figura 2 Mostra la cinetica di Michaelis-Menten risultante dalla fusione un microreattore 10 µ l contenenti perossidasi con un altro 10 µ l microreattore contenente il substrato corrispondente (n = 3). Di valorem di Lineweaver-Burk linearizzazione la K calcolata per la reazione all'interno il microreattore è 86.85 µM ± 10.95 µM, il valore dimax v si trova a 378.8 nmol L-1 s-1 ± 115,6 nmol L-1 s-1. Come il valore dim K è in buona corrispondenza con quanto indicato nella letteratura, 81 ± 3 µM 32, si può presumere che la reazione enzimatica all'interno il microreattore in piccola scala con il materiale idrofobo shell non è influenzata in affinità.

Figure 1
Figura 1: Elettromagnetici forzare la simulazione di una bobina con 58 mA e 4.500 avvolgimenti di rame filo in dipendenza della distanza di microreattore al centro della bobina, determinato dal FEM. Il diametro della bobina è di 10 mm, il diametro del nucleo di ferro è 4 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Cinetica di Michaelis-Menten di perossidasi misurata dalla fusione di due 10 µ l microreattori. La temperatura è di 25 ° C e il buffer utilizzato è il fosfato di potassio (0,1 M) con un pH di 6.5. Sono state effettuate tre ripetizioni.

Figure 3
Figura 3: Piattaforma di azionamento. La piattaforma di azionamento è costituito da una matrice 3 x 3 di doppie bobine. Una bobina ha 4.500 avvolgimenti, un'altezza di 16 mm (una camera), un diametro di 10 mm e un diametro interno di circa 4 mm. L'altezza delle bobine è predefinito per l'altezza del magnete al neodimio usato cilindro. Il diametro è stato scelto perché studi precedenti hanno indicato che si tratta di una distanza ragionevole per lo spostamento di un microreattore con questo tipo di magnete. Il numero degli avvolgimenti e la corrente è stato determinato dal FEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Per il riuscito uso di tecnologie di microfluidica, è importante spostare il volume di reazione corrispondenti ai requisiti del biotecnologiche sintesi e analisi. La piattaforma di attuazione presentata qui rende possibile spostare microfluidici goccioline di forza magnetica. Il movimento può avvenire liberamente in due dimensioni su una superficie piana di una piattaforma di reazione racchiudendo la goccia di liquido con un guscio superidrofobiche magnetico. Così un sistema alternativo ai canali microfluidici predefiniti con installazioni di controllo di flusso complesso, come utilizzato in sistemi microfluidici convenzionale, per passare i solventi ed i campioni è introdotto. L'azionamento automatico delle goccioline di piccola reazione è così una significativa semplificazione delle piattaforme lab-on-a-chip conosciute. Inoltre, la piattaforma rende possibile aprire reversibilmente un microreattore per aggiungere e rimuovere campioni di reazione. In combinazione con un sistema di dispenser, questo può provocare un elevato grado di controllo automatizzato di reazione ed è il primo passo per in silico progettabili microreactions in una virtual lab-in-a-goccia. Il limite principale di questa tecnica è che i microreattori possono essere costruito solo con piccoli volumi (fino a ca. 30 µ l). Un passo fondamentale nel protocollo è la rilevazione della reazione enzimatica all'interno il microreattori perché la sonda a fluorescenza deve essere regolato correttamente. Un'ulteriore possibilità di rilevazione può essere spettroscopia di UV/vis.

Il processo di sviluppo della piattaforma ha mostrato che una bobina elettromagnetica con un diametro di 10 mm è sufficiente per il movimento della gocciolina. D'altra parte, una doppia bobina riempita di aria o un nucleo di ferro non è in grado di indurre la forza magnetica necessaria per aprire una shell di microreattore. Di conseguenza, nuclei di magneti al neodimio sono stati scelti nelle bobine per eseguire questa operazione. I gradienti di campo magnetico risultante nuovo possono essere variati dal movimento elettromagnetico del magnete verticale per la piattaforma di reazione. Le dimensioni del passo della piattaforma sono limitata solo dal controllo. Il controllo e il software già esistente è progettato e pronto all'uso per una matrice di 10 x 10. L'elemento Peltier non è necessaria per le applicazioni descritte ma può essere necessario quando il microreattore deve essere fissato per un tempo più lungo e vi permetterà di raffreddare la miscela di reazione sopra la superficie della piattaforma.

In futuro, la combinazione della piattaforma azionamento con i marmi liquidi può funzionare come laboratorio-in-a-goccia-sistemi flessibili per la realizzazione di proiezioni, analisi veloce ottici e complesso enzima cascata reazioni con volumi di reazione molto piccolo. Inoltre, la piattaforma può essere utilizzata per (bio-) analisi chimiche come PCR, elettroforesi o ELISA. Inoltre, lo screening di nuovi, industriali enzimi pertinenti e aptamero amplificazioni è possibilità promettenti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori si desidera ringraziare il DFG per il supporto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printer FelixPrinters Pro1
10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red) Life Technologies A12222
Ammonium hydroxide TU-KL 1072
CAD software Siemens Soled edge
Contact angle measuring device Dataphysics OCA 20
Cylinder magnet Webcraft GmbH S-04-13-N https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N
Dipotassium phosphate Bernd Kraft 7758-11
Drying oven Binder FD 115
Ethanol Sigma-Aldrich 68-17-5
FeCl2 tetrahydrate TU-KL 1625
FeCl3 hexahydrate TU-KL 1622
Fluorescence probe PerkinElmer LS 55
Horseradish peroxidase Carl Roth 9003-99-0
Hydrogen peroxide Th.Geyer GmbH & Co 7722-84-1
Monopotassium phosphate Bernd Kraft 7778-77-0
Peltier element Conrad  193569
Perfluoroctyltriethoxysilane Sigma-Aldrich 51851-37-7
Scanning Electron Microscope FEI Helios NanoLab 650 DualBeam
Separation bar magnet Webcraft GmbH Q-40-20-10-N
Winding machine IWT GmbH FW122

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Acquose goccioline utilizzate come microreattori enzimatica e loro attuazione elettromagnetica
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Al-Kaidy, H., Kuthan, K., Hering, T., Tippkötter, N. Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation. J. Vis. Exp. (126), e54643, doi:10.3791/54643 (2017).More

Al-Kaidy, H., Kuthan, K., Hering, T., Tippkötter, N. Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation. J. Vis. Exp. (126), e54643, doi:10.3791/54643 (2017).

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