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Bioengineering

マイクロリアクター及び、電磁作動に水滴が酵素として使用

doi: 10.3791/54643 Published: August 28, 2017

Summary

ラボでドロップ反応システムには、マイクロ スケールでの複雑な反応の多彩な実装ができるようにします。電磁コイルの 3 x 3 行列から成る自動作動プラットフォーム開発されたマージ 2 つ 10 μ L マイクロリアクターを使用しましたとそれにより生じる液体ビー玉で酵素反応を開始します。

Abstract

PCR、電気泳動などのマイクロ流体反応システムの実装を成功させる液体少量の運動が欠かせません。従来ラボ-の-、-チップ-プラットフォーム、溶剤とサンプルは、複雑なフロー コントロールのインストールで定義されたマイクロ チャネルを介して渡されます。ここで示した液滴駆動プラットフォームは、有望な代替手段です。それと反応プラットフォーム (ラボでは-ドロップ) の平面サーフェス上の液滴 (マイクロリアクター) を移動することが可能です。プラットフォームの疎水性表面上マイクロリアクターの作動は、超撥水のマグネタイト粒子の薄層の液体の低下の外殻に作用する磁気力の使用に基づいています。プラットフォームの疎水性表面は液体のコアとマイクロリアクターの滑らかな動きを許可する表面間の接触を避けるために必要です。プラットフォーム上 10 μ L のボリュームの 1 つまたは複数のマイクロリアクターを配置され、同時に移動することができます。プラットフォーム自体は、ネオジムや鉄のコアに対応する電気の二重コイルの 3 x 3 行列で構成されます。磁場勾配は自動的に制御されます。磁場勾配の変化に、マイクロリアクターの磁気疎水性シェルをマイクロリアクターを移動または可逆的にシェルを開くに自動的に操作できます。基板および対応する酵素の反応は、マイクロリアクターをマージまたは表面固定化触媒に接触させることによって開始できます。

Introduction

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マイクロ反応技術のアプリケーションは、定義済みマイクロ チップで主に行われます。これらのシステムを広く定め、総合的に、資料に記載 (アリア1,2,3間)。2011 年の世界マイクロ流体技術の売り上げ高は 62 億ユーロ4となりました。対照的に、自由に可動式マイクロ原子炉区画の使用以前のみ検討、限られた範囲で公開します。水溶液の微小液滴を移動するための最も一般的な方法は、電気泳動5です。表面上の水滴の動きの他の方法は、電気フィールド6磁気力7または音響作動8に基づいています。容積の比率に自分の不利な面、ためこれらの液滴を用いたマイクロリアクター システムは強い蒸発効果にさらされています。したがって、ドロップ モーションは通常、上部の段階が水性相を蒸発から守る高沸点液体二相システムとして確立されます。それにもかかわらず、このアプローチは自由な拡散による反応液滴を汚染の高リスクを伴います。これは、述べられたシステムの技術確立のための重大な障害です。

最近の仕事は非付着固液相転移にかかわっています。非常に効果的なアプローチは、超撥水表面、球状水滴の形成を許可します。この反応の概念の拡張は、超撥水表面とシェルは、ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 粒子9がありますたとえばで構成されるマイクロ反応区画の使用です。表面での接触角は、通常 (表面粗さ) によって 160 ° の範囲で。球状のコンパートメントは、表面上の動きに抵抗を提供し、同時に蒸発する水に対する保護を提供します。

マイクロ サイズの PTFE 粒子でコーティング水溶液滴約 2 mm の直径までの球形の形を維持すること。高いボリュームに疎水性のシェルは通常完全に閉じていないもう10。その他シェル材料の影響と非極性溶媒への液体の大理石の適用分野の拡張は、イオン液体12を使用して Gao とマッカーシーによって実装だった。これまで疎水性粒子ベースの殻の形成は、10 nm 30 μ m の大きさの粒子径が説明11,14,16をされています。新しい研究は、シェル素材として疎水性ナノ粒子が微粒子13のそれよりもさらに良い使用である示した。最初の安定性の研究から粒子サイズが減少したときに安定性の増加を確認ca 。600 nm ~100 nm。水性球15周辺密度の粒子分布から可能性が高い結果がこの。

疎水性シェルと液体のビー玉の認定によって水溶液中反応区画の保護は、最初、Aussillousやマハデヴァンによって 2001 年に記述されていた17,18します。 その後、これらの定義された反応区画のいくつかのアプリケーションに記載されています。たとえば、液体のビー玉19と光学的定性的基準に基づく水質汚染の検出法に基づくガスセンサー開発20をされています。著者らは、マイクロ反応システムの化学物質の低消費電力と高反応速度の利点を区別します。最近の出版物は pH に敏感な液体ビー玉16の生産やさまざまな機能の 2 つの別のコーティングが「ヤヌス助詞」の表現に対処します。たとえば、Bormashenkoはテフロンと半導体カーボン ブラック21で作られたシェルとマイクロリアクターを見いだします。さらには、マイクロリアクターが効率的にできることが分かったと便利な24透気液界面を通してのコモノマーとして外部の酸素を吸収することによって polyperoxides を合成します。別のアプローチでは、液体大理石のシリカ粒子ベースのシェルは、古典的な銀鏡反応26を規制する反応性基板表面を提供します。親水性-疎水性-コアシェルクラ液滴の分野で開発の現状と課題、粒度の調整、単分散液滴の再現性のある生産、表面の濡れ性、2 番目の効果液滴軌道など継続的な microPCR システム4の開発のためのよりよい制御と同様、マイクロ反応区画22, 親水性シェル。

これらのマイクロリアクターの磁気駆動生化学システムで作業するとき比較的高い運動範囲の利点と力の良い選択を提供しています。疎水性マグネタイト粒子を使用しているとき彼らは、マイクロリアクターの動きへの磁気力伝達の機能として疎水性シェルの機能の両方を満たします。液滴内磁性粒子と液滴の磁気の動きだったレーマンによって 2006 年に最初に仮定しました。23と式田25, 手動での使用者は、単一液滴の動員のためのアクチュエータとして永久磁石を移動します。少量の液体を移動する別のアプローチは、趙、磁気シェルとして疎水性 Fe3O4の粒子を使用したにより実現しました。磁気液体大理石のシェルは、ドロップの面の上に垂直方向の逆磁場27によって開かれました。このコンセプトに基づき、雪は 20.1 ダイン cm− 1 28の表面張力とマイクロリアクターを形作る粒子を開発できた林作製新規セルロース ベース マイクロ/ナノ階層球超常磁性と多次元センサーデー磁性液滴輸送および操作のための31の神安定性を提供します。原理実証研究用途でも使わないとこれだけリリースでだったところ。液体のビー玉の磁気と電気の制御は現在最初のアプローチで追求されます。趙2010 年15と張2012 29コア-シェル水滴の下に永久磁石のマニュアル (手動) 動きによって液滴操作を開発することができた。Bormashenko11は、ネオジム磁石の接近によって 25 cm s-1の速度に強磁性液体の大理石の高速化を実現しました。手動の小さい永久磁石による移動によって専ら研究を行った上記の原則。次の開発のステップとして趙が最近永久磁石30の距離を変化させることで磁性液体の大理石の動きに必要な磁束密度を推定することができます。ラボ-オン-チップの一般的なシステムに匹敵する反応制御のそれは離散液体 v の自動制御の手段を提供する避けられないolumes。この必要性を満たすためには、固定、移動および磁気マイクロリアクターを開く変数フィールド グラデーションに基づいて新しいコントロール システムを開発しました。

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Protocol

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1 磁性ナノ粒子 Hydrophobization

  1. 疎水性磁性粒子の合成, 200 mL に 0.85 g した FeCl 3 六水和物 (3.14 モル) と 0.30 g した FeCl 2 四水和物 (1.51 mmol) を追加。水/エタノール溶液 (4:1 v/v).
  2. この混合物に追加 0.20 mL 1 H、1 H、2 H、2 H Perfluorooctyltriethoxysilane (PFOTES) (5.23 モル) 磁性攪拌器 (500 rpm) で激しく攪拌しながら。マグネタイト粒子のセカンダリの酸化を防ぐためにコルクで丸底フラスコを用いた不活性ガス雰囲気 (N 2) の合成を実行します
  3. は、8 (pH pH メーターによって決まります) の pH に水酸化アンモニウム溶液 (1.5 M) で賢明なソリューション ドロップを調整します。マグネチックスターラーを用いて 24 時間のためのソリューションをかき混ぜる
  4. 粒子を分離、磁気ソリューションからバーにフラスコを置くことによって磁石 (ネオジム立方体マグネット 40 × 20 × 10 mm、粘着力 25 kg)。フラスコの下部に取り付けた磁石を保ちながら、ソリューションを注ぐ
  5. は、バーを使用している間 3 回水/エタノール溶液で粒子を洗浄磁石 1.4 に従って)。24 h (収量 0.43 g) 60 ° C で粒子を乾燥。
  6. 粒子を分析し、メーカーによると走査型電子顕微鏡を使用して ' の指示

2。マイクロリアクターの試作

  1. 少しガラス乳棒を使用してすべての乾燥粒子を挽くし、その後秤量皿に直接それらのすべてを配置 (46 × 46 × 8 mm、ポリスチレン).
  2. ピペット 10 μ L 反応液 (構成に記載されている 5.1 として) すべての粒子と、体重移動にパン約 10 の円形の方法で少し s (10 μ L マイクロリアクターの粒子質量: 3.2 × 10 -7 kg < supクラス ="xref"> 33)。さらにアプリケーションの常温で残りの粒子 (しなかった自己組み立てないで反応液の粒子) を保存します
  3. 2.2 で説明されているように、水で 5 μ L マイクロリアクターの構築をマイクロリアクターの接触角を測定するため)、テフロン フィルム上に配置し、メーカーによると光接触角測定装置を用いた接触角の分析 ' s指示します

3. コイル本体の 3 D 印刷

  1. は、メーカーによると CAD ソフトウェアを使用しての 16 mm (一室)、直径 10 mm、内径 4 mm の高さの二重コイル体を設計 ' s。指示します
  2. 印刷メーカーによると 3 D プリンターでのコイル本体 ' ポリ乳酸繊維などの材料を使用しての指示。4,500 巻線をコンピューター制御の巻線機を使用して達成するために 0.08 mm の銅ワイヤーで体をラップします

4。駆動プラットフォームの作製

二重コイルのネジの下に、ペルチェ素子と電気基板のマトリックス (例: 3 x 3 マトリックス) の
  1. 配置二重コイルとリボン ケーブル (を介して制御するそれらを接続 図 3).
  2. 目的のアプリケーションによって強力な磁界を得るためにコイル本体に鉄芯 (高さ 32 mm、直径 4 mm) またはネオジム磁石 (高さ 12.5 mm、直径 4 mm、1,035 kA m -1) を追加します
  3. 終了するプラットフォームを配置、プレート、好ましくは石英ガラス、コイル マトリックスに 1 mm の高さの最大値
  4. プラットフォームのサーフェスにマイクロリアクターを配置します
  5. 。 反応液から上部の粒子を撤回し、それによりマイクロリアクターを開くに
  6. をアクティブにネオジム磁石の中でコイル 4.1 で説明したコントロールを使用して)。閉じますマイクロリアクターは、コイルをもう一度非アクティブ化します
  7. は最初は 10 mm 離れている 2 つのマイクロリアクターをマージする使用ネオジム磁石 4.2 で説明したよう)。 25 s 1 つマイクロリアクター (マイクロリアクターで磁石は約 12 mm の必要な距離) を開くには、プラットフォーム上の同じ位置に他の 1 つを移動するためのコイルを活性化によって必要なコイル本体に磁石を持ち上げています。
  8. 反応を冷却するプラットフォーム表面上、コイル温度を下げるマイクロリアクターを用いたソリューションをオン 4.1 で説明したようにコイルの行列の下に位置するペルチェ素子).

5。マージ マイクロリアクターによる酵素反応

  1. 0.1 の濃度で溶解西洋ワサビペルオキシダーゼ μ g mL -1 カリウム リン酸バッファー (0.1 M、pH 6.5)。カリウム リン酸バッファー (0.1 M、pH 6.5) 200 μ M の濃度で基板、10-アセチル-3, 7-dihydroxyphenoxazine (ジメチルスルホキシド (DMSO) 10 mM) を希釈します
  2. 使用 10 μ L のそれぞれの 2.2 で説明されているように 2 つのマイクロリアクターを構築するこれらのソリューション)。磁気力により 2 つのマイクロリアクターをマージ (シリンダーのネオジム磁石: 12.5 mm × 4 mm、1,035 kA m -1) 4.6 で説明したよう) 25 ° C
  3. 蛍光プローブを配置することで反応を検出 (励起波長: 570 nm、発光波長: 585 nm) マージ前にオープンしたマイクロリアクターの真上 10 mm

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Representative Results

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シェル粒子は約 640 の直径を持つ nm。この fluorosilane シェル粒子に囲まれている磁化できるナノ粒子 22 間の範囲の直径を持っている nm と 37 nm。水液体コアとして 5 μ L マイクロリアクターは、約 160 ° の接触角を持っていた。

前述のように、10 μ L マイクロリアクターは 1.34 ± 0.08 µN。 移動する必要な力図 1に示します銅線と 58 搭載内部鉄心の 4,500 の巻線コイルの電磁力 mA。力の分布は、有限要素モデル (FEM) マイクロリアクターを移動する必要なコイルのプロパティを調べることによって推定されます。図 1に見られるように、記述されているコイルによる磁気力はマイクロリアクターを 10 mm のコイル センター距離より遠くの距離に移動するには十分に強い。

マイクロリアクターを開くに磁気力に等しい 0.85 ± 0.05 mN は、液滴の移動に必要な力よりはるかに高い。(図 1) 鉄芯とコイルによる磁気力は十分に強いマイクロリアクターを開くに、ネオジム磁石はコイルで使用されました。フロー方向が交互になる電流のダブルのコイルを電源によって永久磁石はに向かってまたは離れてプラットフォームに移動できます。それによって、マイクロリアクターを開くまたは磁気閉鎖できます。完全にそのまま殻をもつ 2 つのマイクロリアクターが並んである場合表面張力はその融合を抑制するようないマージを行います。したがって、少なくとも 1 つは開く必要があります。

図 2に示す別 10 μ L マイクロリアクター対応する基板を含むとペルオキシダーゼを含む 10 μ L マイクロリアクターの結合によるミカエリス-メンテン型の速度論 (n = 3)。占める割合バーク線形計算 Km値によってマイクロリアクター内反応が 86.85 μ M ± 10.95 μ M、v の最大値 378.8 nmol L-1-1 ± 115.6 nmol L-1-1であります。Km値は文献、81 ± 3 μ M 32で与えられていると良い対応で、それが想定される場合に疎水性シェル素材で小規模のマイクロリアクター内酵素反応の影響を受けない親和性。

Figure 1
図 1:電磁力に 58 とコイルによる mA と銅の 4,500 の巻線コイル センターを有限要素法によって決定するマイクロリアクターの距離依存性のコイル径は 10 mm、鉄芯の直径は 4 mm ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2:2 つをマージすることによって測定したペルオキシダーゼのミカエリス-メンテン型の速度論 10 μ L マイクロリアクター 。温度が 25 ° C、使用されるバッファーは、6.5 の pH のリン酸カリウム (0.1 M)。3 つの繰り返しが行われました。

Figure 3
図 3:駆動プラットフォーム。作動のプラットフォームは、二重コイルの 3 x 3 行列で構成されます。1 つのコイルは 4,500 の巻線、高さ 16 mm (一室)、直径 10 mm、内径4 mm。コイルの高さに使用されるネオジム シリンダー磁石の高さによって定義されます。直径は、以前の研究は示した磁石のこの種のマイクロリアクターを移動するための合理的な距離であるために選ばれました。巻線と現在の数は有限要素法による定められたこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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マイクロ流体技術の使用の成功、バイオ合成、分析の要件に対応する反作用ボリュームを移動することが重要です。ここに示す作動プラットフォームでは、磁力によってマイクロ液滴を移動することが可能。運動は磁気超撥水シェルと液滴を囲むことによって反応プラットフォームの平面サーフェスの 2 次元で自由に実行できます。従って代替システム、複雑なフロー制御のインストールで定義済みのマイクロ チャンネルを溶剤とサンプルを渡すために従来マイクロ流体システムの使用が導入します。小さな反応液滴の自動作動はこうして知られているラボ-オン-チップ プラットフォームの大幅な簡素化です。さらに、プラットフォームの場合、可逆的に追加および反作用のサンプルを削除するマイクロリアクターを開くことが可能になります。ディスペンサー システムと組み合わせて、これは高度な自動反応制御につながる、インシリコ仮想ラボでは-ドロップでデザイン可能な microreactions の最初のステップです。この手法の主な制限は、マイクロリアクターは小容量 (最大30 μ L) の構築とできます。プロトコルの重要なステップは、マイクロリアクター内酵素反応の検出蛍光プローブが正しく調整する必要があるため。紫外/可視分光それ以上の検出可能性があります。

プラットフォームの開発プロセスは、直径 10 mm の電磁コイルが液滴移動に十分であることを示した。その一方で、満ちている空気や鉄芯二重コイルはマイクロリアクター シェルを開くために必要な磁気力を誘発することができません。したがって、このタスクを実行するコイルのネオジム コアが選ばれました。再び結果勾配磁場反応プラットフォームに垂直方向の磁石の電磁界の動きによって変えることができます。プラットフォームのピッチ サイズは、コントロールによってのみ制限されます。既存の管理およびソフトウェアは設計され、10 x 10 のマトリックスに使用する準備ができています。ペルチェ素子は記述されているアプリケーションでは必要ありませんが、マイクロリアクターは長い時間を固定するとプラットフォームの表面上の反応混合物を冷却することが必要があります。

将来は、液体のビー玉で作動プラットフォームの組み合わせは、柔軟なラボ-に-は-ドロップ-システム上映、高速光分析および非常に小さい反応ボリュームと複雑な酵素カスケード反応の実施のためとして機能できます。さらに、PCR、電気泳動法や elisa 法など化学分析 (バイオ-) のプラットフォームを使用できます。さらに、新しい、産業関連酵素とアプタマー増幅のスクリーニングは有望な可能性が。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、サポートの DFG を認めたいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printer FelixPrinters Pro1
10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red) Life Technologies A12222
Ammonium hydroxide TU-KL 1072
CAD software Siemens Soled edge
Contact angle measuring device Dataphysics OCA 20
Cylinder magnet Webcraft GmbH S-04-13-N https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N
Dipotassium phosphate Bernd Kraft 7758-11
Drying oven Binder FD 115
Ethanol Sigma-Aldrich 68-17-5
FeCl2 tetrahydrate TU-KL 1625
FeCl3 hexahydrate TU-KL 1622
Fluorescence probe PerkinElmer LS 55
Horseradish peroxidase Carl Roth 9003-99-0
Hydrogen peroxide Th.Geyer GmbH & Co 7722-84-1
Monopotassium phosphate Bernd Kraft 7778-77-0
Peltier element Conrad  193569
Perfluoroctyltriethoxysilane Sigma-Aldrich 51851-37-7
Scanning Electron Microscope FEI Helios NanoLab 650 DualBeam
Separation bar magnet Webcraft GmbH Q-40-20-10-N
Winding machine IWT GmbH FW122

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References

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マイクロリアクター及び、電磁作動に水滴が酵素として使用
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Al-Kaidy, H., Kuthan, K., Hering, T., Tippkötter, N. Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation. J. Vis. Exp. (126), e54643, doi:10.3791/54643 (2017).More

Al-Kaidy, H., Kuthan, K., Hering, T., Tippkötter, N. Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation. J. Vis. Exp. (126), e54643, doi:10.3791/54643 (2017).

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