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Bioengineering

효소 Microreactors 및 그들의 전자기 작동기로 사용 하는 수성 방울

doi: 10.3791/54643 Published: August 28, 2017

Summary

실험실에서 드롭 반응 시스템 미세 규모에 복잡 한 반응의 다양 한 구현을 수 있습니다. 전자기 코일의 3 x 3 매트릭스의 구성 하는 자동된 개폐 플랫폼 개발 되었다 성공적으로 병합 두 10 µ L microreactors를 사용 하 고 결과 액체 구슬에서 효소 반응 함으로써 시작.

Abstract

전기 이동 법, PCR 등 미세 반응 시스템의 성공적 구현에 대 한 작은 액체 볼륨의 움직임은 필수적입니다. 기존의 연구소-에-어-칩-플랫폼, 용 매 및 샘플 복잡 한 흐름 제어 설치 정의 된 미세 채널을 통해 전달 됩니다. 여기에 제시 된 물방울 개폐 플랫폼 유망한 대안 이다. 그것, 그것 반응 플랫폼 (연구소-에서-한-드롭)의 평면 표면에 액체 방울 (microreactor) 이동 가능 하다. 플랫폼의 소수 성 표면에 microreactors의 개폐 superhydrophobic 자 철 광 입자의 얇은 층의 만든 액체 방울의 바깥쪽에 행동 하는 자기 세력의 사용을 기반으로 합니다. 플랫폼의 소수 성 표면 액체 코어는 microreactor의 부드러운 움직임을 허용 하도록 표면 사이 어떤 접촉을 피하기 위해 필요 합니다. 플랫폼에서 하나 이상의 microreactors 10 µ L의 양으로 위치 고 동시에 이동 될 수 있습니다. 철 또는 네오디뮴 코어를 수용할 수 있는 전기 이중 코일의 3 x 3 매트릭스 플랫폼 자체에 의하여 이루어져 있다. 자기장 기온 변화도 자동으로 제어 됩니다. 자기장 기온 변화도의 변화에 의해 microreactors' 자기 소수 쉘은 microreactor 이동 하거나 역 셸을 열고 자동으로 조작할 수 있습니다. 기판 및 해당 효소의 반응은 microreactors 병합 또는 표면 고정된 촉매에 접촉으로 그들을 데리고 하 여 시작할 수 있습니다.

Introduction

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마이크로 반응 기술 응용 프로그램 미리 정의 된 아닌 칩에서 주로 실행 된다. 이 시스템은 널리 설립 하 고 문학에 포괄적으로 설명 (인터 알 리아 1,,23). 2011 년 미세 기술 전세계의 회전율 6.2 십억 유로 4를 합계 했다. 반면, 자유롭게 움직이는 마이크로 반응 기 구획의 사용 이전만 조사 되었고 한정된 된 넓이에 게시. 수성 마이크로 작은 물방울을 이동 하기 위한 가장 일반적인 방법은 electrowetting 5입니다. 표면에 방울의 움직임을 위한 다른 방법은 전기 분야 6, 자력 7 또는 음향 발동 8를 기반으로 합니다. 볼륨 비율에 그들의 불리 한 표면 때문이 microreactor 방울 기반 시스템 강한 증발 효과에 노출 됩니다. 따라서, 드롭 모션 보통 위 단계는 증발에서 수성 단계 보호 높은 비등 점 액체 2 단계 시스템으로 설정 됩니다. 그럼에도 불구 하 고,이 접근 통제 확산에 의해 반응을 물방울 오염의 높은 위험을 포함 한다. 이의 언급 한 시스템 기술 설립에 대 한 중요 한 장애물입니다.

최근 작품 비 점착 액체-고체 상전이 염려 된다. 매우 효과적인 접근 superhydrophobic 표면, 구형 수성 방울의 형성을 허용의 사용 이다. 이 반응 개념의 확장 superhydrophobic 표면 또는 셸, 소계 (PTFE) 입자 9이루어져 예 수 있는 마이크로 반응 구획의 사용 이다. 표면에 그들의 접촉 각도 (표면 거칠기)에 따라서 160 °의 범위에 일반적으로. 구형 구획 표면에 따라서 운동에 최소한의 저항을 제공 하 고 동시에 물 증발에 대 한 보호를 제공 합니다.

마이크로 크기의 PTFE 입자 코팅 수성 상품 약 2 m m의 직경까지 그들의 둥근 모양을 유지할 수 있습니다. 높은 볼륨에서 소수 포탄은 일반적으로 완전히 닫히지 더 이상 10. 다른 셸 재료의 영향 및 비 극성 용 매에 액체 대리석의 적용 분야의 확대가 오와 맥 카시에 의해 이온 액체 12를 사용 하 여 구현 되었습니다. 소수 성 입자 기반 포탄의 형성에 대 한 지금까지 10 nm-30 μ m 크기에서 입자 직경 되었습니다 설명된 11,,1416. 새로운 연구 쉘 소재로 소수 성 나노 미 13의 그것 보다 더 나은 사용을 보였다. 입자 크기에서 감소 될 때 첫 번째 안정성 연구 안정성에서 증가 확인 ca. 600 nm ca. 100 nm. 밀도가 높은 입자 분포의 수성 범위 15주변에서이 가능성이 결과.

소수 성 껍질 및 액체 대리석으로 그들의 지정에 의해 수성 반응 구획의 보호 Aussillous 그 외 여러분 및 Mahadevan 외. 2001 년에 처음 설명 했다 17 , 18. 그 이후, 몇 가지 애플 리 케이 션이 정의 반응 구획의 설명 되었습니다. 예를 들어 액체 대리석 19 및 광학 질적 기준에 따라 물 오염에 대 한 검출 방식에 따라 가스 센서 개발된 20되었습니다. 저자는 높은 반응 속도의 장점과 마이크로 반응 시스템의 화학 물질의 낮은 소비를 구별합니다. 최근 간행물 처리 pH에 민감한 액체 구슬 16 의 생산 또는 다른 기능의 두 개의 서로 다른 코팅 '야누스 입자'의 표현. 예를 들어 Bormashenko 외. 테 플 론 및 반도체 카본 블랙 21만든 포탄으로는 microreactor를 음성 합성 수 있습니다. 또한 microreactors 수 효율적으로 시연 되었다 고 편리한 comonomer 침투성 가스-액체 인터페이스 24로 외부의 산소를 흡수 하 여 polyperoxides을 합성. 또 다른 방법은 실리 카 입자 기반 액체 대리석의 껍질에서 고전은 거울 반응 26규제 반응 기판 표면 제공. 연구 및 개발 분야에서 친수성-코어-소수 성-쉘 방울의 현재 문제는 입자 크기 조정, 단 분산 방울의 재현 생산, 표면 습윤 및 두 번째의 효과 방울 궤도의 더 나은 제어 예: 연속 microPCR-시스템 4의 개발을 위한 마이크로 반응 구획 22에 친수성 포탄.

이러한 microreactors의 자기 작동 생화학 시스템에서 작업할 때 상대적으로 높은 운동 범위의 이점 및 힘의 좋은 선택도 제공 합니다. 소수 자 입자를 사용할 경우 그들은 모두 microreactors의 움직임에 자기 힘 전송 기능 뿐만 아니라 소수 껍질의 기능을 완수 합니다. 방울 물방울 내부 자석 입자의 자기 운동 레만 에 의해 2006 년에 처음으로 가정 되었다 23 , Shikida 외. 25, 수동으로 사용 하는 하나의 작은 물방울의 동원에 대 한 액추에이터로 영구 자석 이동. 또 다른 방법은 작은 양의 액체를 이동 하는 자오 외., 자석 포탄으로 소수 성 철3O4 입자를 사용 하 여 실현 되었다. 마그네틱 액체 대리석의 쉘 드롭의 상부에 27세로 역 자기장 의해 열렸다. 이 개념을 바탕으로, Xue 외. 20.1 다 인 cm− 1 28의 표면 장력을 가진 microreactor를 형성 하는 입자를 개발할 수 있었다. 린 그 외 소설 룰 기반 마이크로/나노 계층적 분야 superparamagnetism와 superhydrophobicity 마그네틱 액체 방울 교통 및 조작 31하나님 안정성을 제공 하는 조작. 이것은 지금까지 발표 증거의 원리 연구와 모든 응용 프로그램에 사용 되지. 액체 대리석의 자기와 전기 제어 현재 첫 번째 접근 방법에서 추구 된다. 2010 년 15 에 장 외. 2012 29외. 코어-쉘 방울 아래 영구 자석의 수동 (수동) 운동에 의해 물방울 조작 개발 수 있었다. Bormashenko 외. 11 네오디뮴 자석에 접근 하 여 25 cm s-1 의 속도로 강자성 액체 대리석의 가속도 달성. 위에서 언급 한 원칙 연구는 작은 영구 자석의 수동 운동에 의해 독점적으로 실행 되었다. 다음 개발 단계로 자오 외. 최근 영구 자석 30의 거리를 변화 하 여 마그네틱 액체 대리석의 움직임에 대 한 필요 자기 플럭스 밀도 추정 할 수 있었다. 반응 제어 일반적인 랩 온 칩 시스템의 비교에 대 한 개별 액체 v의 자동된 제어 수단을 제공을 피할 수 없는 것olumes입니다. 이 필요를 만족 시키기 위해 우리 흥분, 이동 하 고 열고 자기 microreactors 변수 필드 그라디언트에 따라 새로운 제어 시스템을 개발 했다.

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Protocol

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1. Hydrophobization의 자성 나노 입자

  1. 소수 자석 입자의 합성에 대 한 추가 0.85 g FeCl 3 hexahydrate (3.14 mmol)와 0.30 g FeCl 2 tetrahydrate (1.51 mmol) 200 mL 물/에탄올 솔루션 (4:1 v/v).
  2. 가이 혼합물에 0.20 mL 1 시간, 1 시간, 2 H, 2 H-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFOTES) 추가 (5.23 mmol)와 자력 (500 rpm)에 의해 활발 한 감동. 자 철 광 입자의 보조 산화를 방지 하기 위하여 코르크와 둥근 바닥 플라스 크를 사용 하 여 불활성 가스 분위기 (N 2) 합성 수행.
  3. 8 (산도 pH 미터에 의해 결정)의 pH에는 수산화 암모늄 솔루션 (1.5 M) 현명한 솔루션 드롭을 조정 합니다. 자력 교 반기를 사용 하 여 24 시간에 대 한 솔루션을 저 어.
  4. 분리 입자 자석으로 솔루션에서 바에 플라스 크를 배치 하 여 자석 (네오디뮴 자석 사각 40 x 20 x 10 mm, 접착제 강제로 25 kg). 플라스 크의 밑면에 부착 된 자석 유지 하면서 솔루션 쏟아.
  5. 막대를 사용 하는 동안 물/에탄올 용액으로 세 번 입자를 씻어 자석 1.4에 설명 된 대로). 24 시간 (수율 ca. 0.43 g)에 대 한 60 ° C에서 입자를 건조.
  6. 입자 분석를 사용 하 여 제조 업체에 따라 스캐닝 전자 현미경 ' s 지침.

2. Microreactors의 제조

  1. 약간 유리 방 앗 공이 사용 하 여 모든 말린된 입자를 갈기 고 이후 모든 이들의 무게 팬에 직접 (46 × 46 × 8 mm, 폴리스 티 렌).
  2. 피 펫 10 µ L 반응 솔루션 (구성에 설명 된 5.1) 모든 입자는 무게 이동에 약간 약 10 순환 방식에서 팬 s (10 µ L microreactor에 대 한 입자 질량: ca. 3.2 x 10 -7 kg < sup 클래스 = "외부 참조" > 33). 추가 응용 프로그램에 대 한 상 온에서 나머지 입자 (입자를 반응 솔루션 주위 자기 조립 하지 않았다)를 저장.
  3. 는 microreactor의 접촉 각을 측정 하기 위한 구축 물으로 5 µ L microreactor 2.2에 설명 된 대로), 테 플 론 영화에 배치 하 고 제조 업체에 따라 광학 접촉 각 측정 장치를 사용 하 여 접촉 각 분석 ' s 지침.

3. 코일의 3D 인쇄

  1. 제조 업체에 따라 CAD 소프트웨어를 사용 하 여 높이 16 m m (1 실), 10 mm의 직경 및 ca. 4 m m 내경은 이중 코일 시체 디자인 ' s 지침.
  2. 인쇄 제조 업체는 3D 프린터와 코일 시체 ' polylactide 필 라 멘 트 같은 재료를 사용 하 여 s 지시. 컴퓨터 제어 굴곡 기계를 사용 하 여 4500 권선을 달성 하기 위해 0.08 m m 구리 철사 바디 랩.

4. 개폐 플랫폼의 제조

아래, Peltier 요소와 전기 보드에 (예: 3 x 3 매트릭스) 매트릭스에서
  1. 정렬 이중 코일 이중 코일에 나사 및 리본 케이블 (를 통해 컨트롤에 연결 그림 3).
  2. 원하는 응용 프로그램에 따라 추가 철 코어 (높이 32 m m, 직경 4 mm) 또는 네오디뮴 자석 (12.5 m m 높이, 직경 4 mm, 1,035 카 m -1) 강한 자기장을 얻기 위해 코일 몸.
  3. 완료 플랫폼 장소는 접시, 선호 최대 높이 1 m m 코일 매트릭스에의 석 영 유리.
  4. 플랫폼의 표면에는 microreactor를 놓습니다.
  5. 반응 솔루션에서 상단 입자를 철회 하는 microreactor를 오픈 함으로써 활성화 내부 네오디뮴 자석 코일 4.1에서 언급 하는 컨트롤을 사용 하 여). 종료는 microreactor 다시 코일 비활성화.
  6. 두 microreactors는 처음 ca. 10 m m 떨어져 있는 병합
  7. 네오디뮴 자석 4.2에 설명 된 대로) 사용 합니다. Ca. 25 s 1 microreactor (microreactor 및 자석 거짓말 약 12 m m 사이의 필요한 거리)를 오픈 하 고 플랫폼에 동일한 위치를 다른 하나를 이동 하는 코일을 활성화 하 여 필요한 코일 시체에 자석 올려.
  8. 반응을 진정 솔루션 플랫폼 표면에 고 코일 온도 감소 microreactor에서 4.1에 설명 된 대로 코일 매트릭스 아래 위치 하는 Peltier 요소에 스위치).

5. 병합 Microreactors 효소 반응

칼륨 인산 염 버퍼 (0.1 m M, pH 6.5)
  1. 0.1의 농도에 디졸브 양 고추냉이 과산화 효소 µ g mL -1. 기판, 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine dimethylsulfoxide (DMSO) (10 mM) 칼륨 인산 염 버퍼 (0.1 m M, pH 6.5) 200 µ M의 농도를 희석.
  2. 사용 10 µ L 2.2에 설명 된 대로 두 개의 microreactors를 만들려고 이러한 솔루션의). 자기 세력의 평균에 의해 두 개의 microreactors를 병합 (네오디뮴 실린더 자석: 12.5 m m x 4 m m, 1,035 카 m -1) 4.6에 설명 된 대로) 25 ° c.
  3. 형광 프로브를 배치 하 여 반응 검출 (여기 파장: 570 nm, 방출 파장: 585 nm) ca. 바로 병합 하기 전에 열린된 microreactor 위에 10 m m.

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Representative Results

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쉘 입자는 직경 약 640 nm. 이 fluorosilane 쉘 입자에 magnetizable 나노 22 사이의 범위에 있는 직경 및 37 nm. 5 µ L microreactor 액체 코어로 물으로 약 160 °의 접촉 각을 했다.

위에서 설명한 대로 10 µ L microreactor는 1.34 ± 0.08 µN. 이동 하는 데 필요한 힘 그림 1 에서는 구리 철사와 58로 구동 하는 내부 철 코어의 4500 권선으로 코일의 전자기 힘 mA. 강제로 유통 유한 요소 모델 (FEM)는 microreactor 이동 필요한 코일 속성을 결정 하 여 추정 된다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 설명된 코일에 의해 실시 하는 자력 강하다 충분히 10 m m 코일 중심에서 멀리 거리는 microreactor를 이동.

microreactor 여 자력 같습니다 0.85 ± 0.05 미네소타를 물방울을 이동 하는 데 필요한 힘 보다 훨씬 높다. (그림 1)에서 철 코어와 코일에 의해 유도 된 자기장은 강하지는 microreactor 여, 네오디뮴 자석 코일에 사용 되었다. 교류 전류 흐름 방향으로 이중 코일 전원, 여 영구 자석으로 또는 플랫폼에서 이동할 수 있습니다. 따라서,는 microreactor 열 수 또는 자석으로 닫혀. 완전히 그대로 포탄을 가진 2 개의 microreactors 나란히 거짓말 하는 경우에, 그들은 표면 장력을 억제 그들의 융해로 병합 하지 마십시오. 따라서 하나 이상 열어야 합니다.

그림 2 는 해당 기질을 포함 하는 또 다른 10 µ L microreactor와 과산화 효소를 포함 하는 10 µ L microreactor 병합 결과 Michaelis Menten 활동 (n = 3). Lineweaver-버크 선형화 계산된 Km 값으로는 microreactor 내 반응에 대 한 86.85 µ M ± 10.95 µ M, v최대 값 378.8 nmol L-1 s-1 ± 115.6 nmol L-1의 -1에 놓여 있습니다. 문학, 81 ± 3 µ M 32, 주어진 좋은 통신에 Km 값은 추측 될 수 있다 소수 성 쉘 소재 소규모 microreactor 내에서 효소 반응에 영향을 받지 않습니다. 선호도입니다.

Figure 1
그림 1: 전자기 강제로 58와 코일의 시뮬레이션 FEM.에 의해 결정 하는 코일 센터에 microreactor의 거리의 의존에서 mA와 구리의 4500 권선 와이어 코일 직경 10 m m, 철 코어의 직경은 4 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 과산화 효소의 Michaelis-Menten 활동 두 가지를 병합 하 여 측정 10 µ L microreactors. 온도 25 ° C 그리고 사용 버퍼 ph 6.5의 칼륨 인산 염 (0.1 m M) 이다. 3 반복 실시 했다.

Figure 3
그림 3: 작동 플랫폼. 3 x 3 매트릭스 이중 코일의 개폐 플랫폼에 의하여 이루어져 있다. 1 개의 코일에는 4500 권선, 높이 16 m m (1 실), 직경 10 mm의 ca. 내경 4 m m. 코일의 높이 사용된 네오디뮴 실린더 자석의 높이 의해 미리 정의 됩니다. 직경은 이전 연구 보여주었다이 이동 하는 자석의이 종류는 microreactor 적당 한 거리 때문에 선택 되었다. 권선의 전류 번호 FEM.에 의해 결정 되었다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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미세 기술의 성공적인 사용을 위해 그것은 바이오 합성 및 분석의 요구 사항에 해당 하는 반응 볼륨을 이동 하는 것이 중요. 여기에 제시 된 발동 플랫폼 자기 힘으로 미세 물방울을 이동 가능 하 게. 운동을 자유롭게 반응 플랫폼의 평면 표면에 2 차원에서 자기 superhydrophobic 쉘 액체 방울을 포함 하 여 수행할 수 있습니다. 따라서 복잡 한 흐름 제어 설치와 미리 정의 된 미세 채널 대체 시스템 용 매 및 샘플 통과 기존의 미세 시스템에 사용 되는 소개. 작은 반응 방울의 자동된 개폐 따라서 알려진된 랩 온 칩 플랫폼의 상당한 단순화 이다. 또한, 플랫폼 역 추가 하 고 제거 반응 샘플 microreactor을 열 수 있습니다. 디스펜서 시스템와 함께,이 수 높은 정도의 자동된 반응 제어 되며 가상 실험실-에서-한-드롭 디자인 microreactions 실리콘에 대 한 첫 번째 단계입니다. 이 기술의 주요 한계는 microreactors만 (까지 ca. 30 µ L) 작은 볼륨으로 건축 될 수 있다 이다. 프로토콜에 중요 한 단계는 microreactors 내부 효소 반응의 검출 이므로 형광 프로브 제대로 조정 될 수 있다. 더 검출 가능성 UV/vis 분광학 있을 수 있습니다.

플랫폼의 개발 프로세스는 전자기 코일 직경 10 mm의 물방울 운동에 대 한 충분 한 보여주었다. 다른 한편으로, 공기 또는 철 심 가득한 더블 코일은 microreactor 셸을 열에 필요한 자력을 유도 수 없습니다. 따라서, 네오디뮴 코어는이 작업을 수행 하는 코일에서 선정 됐다. 결과 자기장 기온 변화도 다시 반응 플랫폼 수직 자석의 electromagnetical 운동에 의해는 다양 한 수 있습니다. 플랫폼의 피치 크기만 컨트롤에 의해 제한 됩니다. 이미 기존 제어 및 소프트웨어 설계 및 10 × 10 행렬에 사용할 준비가입니다. Peltier 요소 설명된 응용 프로그램에 대 한 필요 하지 않습니다 하지만 긴 시간 동안 고정 하는 microreactor는 그것 플랫폼 표면 위의 반응 혼합물을 수 때 필요할 수 있습니다.

미래에, 액체 대리석와 함께 작동 플랫폼의 조합 유연한 연구소-에서-한-드롭-시스템의 검 진, 빠른 광학 분석 복잡 한 효소 캐스케이드 아주 작은 반응 볼륨 구현에 대 한로 작동할 수 있습니다. 또한, 플랫폼 (바이오) 화학 분석 PCR, 전기 이동 법, ELISA 등에 대 한 사용할 수 있습니다. 또한, 새로운, 산업 관련 효소 및 aptamer 확대의 심사는 유망한 가능성.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 지원을 위해 DFG을 인정 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printer FelixPrinters Pro1
10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red) Life Technologies A12222
Ammonium hydroxide TU-KL 1072
CAD software Siemens Soled edge
Contact angle measuring device Dataphysics OCA 20
Cylinder magnet Webcraft GmbH S-04-13-N https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N
Dipotassium phosphate Bernd Kraft 7758-11
Drying oven Binder FD 115
Ethanol Sigma-Aldrich 68-17-5
FeCl2 tetrahydrate TU-KL 1625
FeCl3 hexahydrate TU-KL 1622
Fluorescence probe PerkinElmer LS 55
Horseradish peroxidase Carl Roth 9003-99-0
Hydrogen peroxide Th.Geyer GmbH & Co 7722-84-1
Monopotassium phosphate Bernd Kraft 7778-77-0
Peltier element Conrad  193569
Perfluoroctyltriethoxysilane Sigma-Aldrich 51851-37-7
Scanning Electron Microscope FEI Helios NanoLab 650 DualBeam
Separation bar magnet Webcraft GmbH Q-40-20-10-N
Winding machine IWT GmbH FW122

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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효소 Microreactors 및 그들의 전자기 작동기로 사용 하는 수성 방울
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Al-Kaidy, H., Kuthan, K., Hering, T., Tippkötter, N. Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation. J. Vis. Exp. (126), e54643, doi:10.3791/54643 (2017).More

Al-Kaidy, H., Kuthan, K., Hering, T., Tippkötter, N. Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation. J. Vis. Exp. (126), e54643, doi:10.3791/54643 (2017).

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