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Bioengineering

Gotas acuosas utilizan como enzimática microreactores y su accionamiento electromagnético

doi: 10.3791/54643 Published: August 28, 2017

Summary

Sistemas de laboratorio en gota reacción permiten la aplicación versátil de reacciones complejas en una escala de microfluidos. Una plataforma de actuación automatizada que consiste en una matriz de 3 x 3 de bobinas electromagnéticas fue desarrollada y utilizado con éxito para combinar dos 10 μl microreactores y así iniciar una reacción enzimática en los mármoles líquidos resultantes.

Abstract

Para la implementación exitosa de sistemas de reacción de microfluidos, como PCR y electroforesis, el movimiento de pequeños volúmenes de líquidos es esencial. En el laboratorio-en-un-chip-plataformas convencionales, solventes y las muestras pasan a través de canales definidos microfluídicos con instalaciones de control de flujo compleja. La plataforma de actuación gotita presentada aquí es una alternativa prometedora. Con él, es posible mover una gota líquida (microreactores) sobre una superficie plana de una plataforma de reacción (laboratorio en gota). La actuación de microreactores en la superficie de la plataforma se basa en el uso de fuerzas magnéticas que actúan en el exterior de las gotas de líquido que está hecho de una fina capa de partículas de magnetita superhidrófobos. La superficie de la plataforma es necesaria para evitar cualquier contacto entre la base líquida y la superficie para permitir un movimiento suave de los microreactores. En la plataforma, microreactores de uno o más volúmenes de 10 μl pueden ser colocados y movidos al mismo tiempo. La plataforma sí mismo consiste en una matriz de 3 x 3 de bobinas dobles eléctricas que acomodar corazones neodimio o hierro. Los gradientes de campo magnético son controlados automáticamente. Por la variación de los gradientes de campo magnético, magnético shell hidrofóbico los microreactores puede manipularse automáticamente para mover el microreactor o abrir el shell reversible. Reacciones de los sustratos y las enzimas correspondientes se pueden iniciar por fusión de los microreactores o traerlos en contacto con la superficie catalizadores inmovilizados.

Introduction

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Aplicaciones técnicas con micro reacciones se llevan a cabo predominante en fichas predefinidas microchannel. Estos sistemas son ampliamente establecidos y ampliamente descritos en la literatura (entre otras cosas 1,2,3). En 2011, el volumen de negocios de tecnologías de microfluidos en todo el mundo totalizaron 6,2 billones euro 4. En contraste, el uso de compartimientos del reactor micro libremente movible fue previamente sólo revisado y publicado hasta cierto punto. El método más común para el movimiento acuosas gotitas micro es electrowetting 5. Otros métodos para el movimiento de las gotas sobre las superficies se basan en campos eléctricos 6, fuerza magnética 7 o 8de actuación acústica. Debido a su superficie desfavorable relación, estos sistemas microreactor basada en gotas están expuestos a efectos de fuerte evaporación. Así, el movimiento de la gota generalmente se establece como un sistema de dos fases líquido, donde la fase superior tiene un elevado punto de ebullición contra evaporación de la fase acuosa. Sin embargo, este enfoque implica un alto riesgo de contaminación de la gota de la reacción por la incontrolada difusión. Esto es un obstáculo importante para la creación técnica de los sistemas mencionados.

Trabajo reciente se refiere a las transiciones de fase de líquido-sólido no adherente. Un enfoque muy eficaz es el uso de superficies superhidrófobos, que permite la formación de gotas acuosas esféricas. Una extensión de este concepto de reacción es el uso de compartimientos de la micro reacción con una superhidrófobos superficie o cáscara, que por ejemplo puede consistir en partículas de politetrafluoroetileno (PTFE) 9. Sus ángulos de contacto en las superficies suelen estar en el rango de 160° (dependiendo de la rugosidad de la superficie). Los compartimientos esféricos así ofrecen mínima resistencia al movimiento en una superficie y al mismo tiempo proporcionan una protección contra la evaporación del agua.

Gotas acuosas recubiertas con partículas PTFE tamaño micro pueden mantener su forma esférica hasta alrededor de 2 mm de diámetro. En volúmenes más altos, la cáscara hidrofóbica generalmente no está completamente cerrada ya 10. La influencia de otros materiales de la cáscara y la expansión del campo de aplicación del líquido mármol en solventes no polares se implementó por Gao y McCarthy usando líquidos iónicos 12. Para la formación de conchas basada en partículas hidrofóbicas, diámetros de partículas en tamaños de 10 nm-30 μm hasta ahora han sido descritas 11,14,16. Nuevos estudios demostraron que nanopartículas hidrofóbicas como material de la cáscara son de uso incluso mejor que el de micropartículas 13. Primeros estudios de estabilidad confirmaron un aumento en la estabilidad cuando se reduce el tamaño de partícula de ca. 600 nm a aprox. 100 nm. Esto resulta probablemente de la distribución de partículas más densa alrededor de la esfera acuosa 15.

La protección de los compartimientos de la reacción acuosa por una cáscara hidrofóbica y su designación como mármoles de líquido primero fue descrita en 2001 por Aussillous et al. y Mahadevan et al. 17 , 18. desde entonces, se han descrito algunas aplicaciones de estos compartimientos de reacción definidas. Por ejemplo, un sensor de gases basado en mármoles líquido 19 y un método de detección de contaminación del agua sobre una base cualitativa ópticamente han sido desarrollados 20. Los autores distinguen las ventajas de alta reacción y el bajo consumo de productos químicos de sus sistemas de reacción micro. Publicaciones más recientes tratan de la producción de mármoles líquido sensible al pH 16 o la representación de 'Partículas Janus' con dos diversas capas de diferente funcionalidad. Por ejemplo, Bormashenko et al. podría sintetizar un microreactor con cáscaras de teflón y semiconductor negro 21. Además se demostró que los microreactores pueden eficiente y conveniente sintetizar polyperoxides absorbiendo oxígeno externo como comonoméricas a través de la interfaz de gas-líquido permeable 24. En otro enfoque, la cáscara de la partícula-basados en sílice líquidos mármoles proporcionan las superficies de sustrato reactivo para regular el clásico espejo de plata reacción 26. Problemas actuales de investigación y desarrollo en el campo de gotitas hidrofílico-core-hidrofóbico-shell son el ajuste de tamaño de partícula, la producción reproducible de gotitas monodispersa, la mojabilidad de las superficies y el efecto de segundo shell hidrofílico en la micro reacción compartimentos 22, así como un mejor control de las trayectorias de la gota, por ejemplo, para el desarrollo de sistemas continuos de microPCR 4.

Una actuación magnética de los microreactores ofrece la ventaja de las gamas de movimiento relativamente alta y una buena selectividad de la fuerza cuando se trabaja en sistemas bioquímicos. Al utilizar partículas de magnetita hidrofóbico, que cumplen la función de la transmisión de la fuerza magnética a la circulación de los microreactores, así como la función de una cubierta hidrófoba. El movimiento magnético de gotas con partículas magnéticas dentro de una gota fue postulado por primera vez en 2006 por Lehmann et al. 23 y Shikida et al. 25, que utilizar manualmente mover imanes permanentes como actuadores para la movilización de una sola gota. Otro enfoque para mover una pequeña cantidad de líquido fue realizado por Zhao et al., quienes utilizan las partículas hidrofóbicas de4 de3O de Fe como cáscara magnética. La cáscara del mármol líquido magnético fue abierta en la parte superior de la gota por un vertical campo magnético inverso 27. Basado en este concepto, Xue et al fueron capaces de desarrollar las partículas que forman un microreactor con una tensión de superficie de Dina 20,1 cm−1 28. Lin et al. fabricados novedosas basados en celulosa micro/nano jerárquicas esferas con superparamagnetism y superhydrophobicity que proporcionan estabilidad de Dios para transporte y manipulación de gotas de líquido magnético 31. Esto hasta ahora sólo fue liberado como una prueba del principio de estudio y no utilizar para cualquier aplicación. El control eléctrico y magnético de los mármoles de líquido actualmente es perseguido en los primeros acercamientos. Zhao et al. en 2010 15 y Zhang et al 2012 29 fueron capaces de desarrollar una manipulación de gota por el movimiento manual (manual) de un imán permanente debajo de las gotitas de core-shell. Bormashenko et al. 11 lograr la aceleración de un mármol ferromagnético líquido a una velocidad de 25 cm s-1 acercando un imán de neodimio. El mencionado principio los estudios se llevaron a cabo exclusivamente por el movimiento manual de un pequeño imán permanente. Como un paso siguiente del desarrollo, Zhao et al pudieron recientemente estimar la densidad del flujo magnético necesaria para el movimiento de mármol líquido magnético variando la distancia de un imán permanente 30. Para un control de reacción comparable a la de los comunes sistemas lab-on-a-chip, parece inevitable que proporcionan los medios de control automatizado de la discreta v líquidaolumes. Para satisfacer esta necesidad, hemos desarrollado un nuevo sistema de control basado en gradientes de campo variable para fijar, mover y abrir los microreactores magnético.

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Protocol

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1. Hydrophobization de nanopartículas magnéticas

  1. para la síntesis de las partículas magnéticas hidrofóbicas, Añadir 0,85 g FECLAS 3 hexahidrato (3.14 mmol) y 0,30 g FECLAS 2 tetrahidrato (1.51 mmol) a 200 mL solución de agua y etanol (v/v de 4:1).
  2. a esta mezcla, agregar 0,20 mL 1H, 1H, 2 H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFOTES) (5.23 mmol) con agitación vigorosa por un agitador magnético (500 rpm). Llevar a cabo la síntesis en una atmósfera de gas inerte (N 2) utilizando un matraz de fondo redondo con un corcho para evitar la oxidación secundaria de las partículas de la magnetita.
  3. Ajustar la gota de la solución sabia con una solución de hidróxido de amonio (1,5 M) a un pH de 8 (pH determinado por un medidor de pH). Agitar la solución durante 24 horas utilizando un agitador magnético.
  4. Separar magnéticamente las partículas de la solución colocando el matraz en una barra de imán (fuerza de neodimio imán cuboides 40 x 20 x 10 mm, adhesiva 25 kg). Vierta la solución manteniendo el imán en la parte inferior del matraz.
  5. Lavar las partículas tres veces con la solución de agua y etanol durante el uso de una barra de imán como se describe en la 1.4). Seco las partículas a 60 ° C por 24 h (rendimiento aprox. 0,43 g).
  6. Para el análisis de las partículas, usar un microscopio electrónico de barrido según fabricante ' instrucciones s.

2. Fabricación de microreactores

  1. moler todas las partículas secas un poco con un mortero de vidrio y posteriormente colocar todos ellos directamente en un platillo (46 × 46 × 8 mm, poliestireno).
  2. Pipeta 10 μl reacción solución (composición como descrito en 5.1) todas las partículas y mover el peso de la cacerola levemente en forma circular de aproximadamente 10 s (masa de la partícula para un microreactor de 10 μl: aprox. 3.2 x 10 -7 kg < sup clase = "xref" > 33). Almacenar las partículas restantes (partículas que no uno mismo-montar alrededor de la solución de reacción) a temperatura ambiente para más aplicaciones.
  3. Para medir el ángulo de contacto de los microreactores, construir un microreactor de 5 μl con agua como se describe en 2.2), coloque en una película de teflón y analizar el ángulo de contacto mediante el uso de un dispositivo de medición de ángulo de contacto óptico según fabricante ' s instrucciones.

3. 3D-impresión de los cuerpos de bobina

  1. diseño de los cuerpos de doble bobina con una altura de 16 m m (una cámara), un diámetro de 10 mm y un diámetro interior de aprox. 4 mm mediante el uso de un software de CAD según fabricante ' s instrucciones.
  2. Imprimir los cuerpos de bobina con una impresora 3D según el fabricante ' instrucciones utilizando materiales como filamentos de poliláctido. Envolver los cuerpos con un alambre de cobre 0.08 mm para conseguir 4.500 bobinas mediante el uso de una máquina de bobina controlado ordenador.

4. Fabricación de la plataforma de actuación

  1. organizar el doble bobinas en una matriz (por ejemplo 3 x 3) en un tablero eléctrico con un elemento Peltier, enroscar las bobinas dobles y conectarlos a un control a través de cable de cinta ( figura 3).
  2. Según la aplicación deseada, agregar una base de hierro (altura 32 mm, 4 mm de diámetro) o un imán de neodimio (12,5 mm de altura, 4 mm de diámetro, 1.035 kA m -1) en el cuerpo de la bobina para obtener un campo magnético más fuerte.
  3. Para terminar la plataforma Coloque una placa, preferiblemente cristal de cuarzo, con una altura máxima de 1 mm en la matriz de la bobina.
  4. Lugar en la superficie de la plataforma de un microreactor.
  5. Para retirar las partículas superiores de la solución de reacción y así abrir un microreactor activa una bobina con un imán de neodimio interior usando el control mencionado en la 4.1). Para cerrar el microreactor desactivar nuevamente la bobina de.
  6. Para combinar dos microreactores que inicialmente son aprox. 10 mm. utiliza imanes de neodimio como se describe en 4.2). Levante el imán en el cuerpo de la bobina requerida mediante la activación de las bobinas para aprox. 25 s abra un microreactor (distancia entre imán y microreactores mentiras aproximadamente 12 mm) y uno en la misma posición en la plataforma de.
  7. Enfriar la reacción solución en microreactores en la superficie de la plataforma y disminuir la temperatura de la bobina encienda el elemento Peltier colocado debajo de la matriz de la bobina como se describe en la 4.1).

5. Reacción enzimática de microreactores fusión

  1. disolver con peroxidasa de rábano en una concentración de 0,1 μg mL -1 en tampón de fosfato de potasio (0.1 M, pH 6,5). Diluir el sustrato, 10-acetilo-3,7-dihydroxyphenoxazine (10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO)) con tampón de fosfato de potasio (0.1 M, pH 6,5) a una concentración de 200 μm.
  2. Uso 10 μl de cada una de estas soluciones para construir dos microreactores descrito en 2.2). Combinar los dos microreactores por medio de fuerzas magnéticas (imanes de neodimio cilindro: 12,5 mm x 4 mm, 1.035 kA m -1) como se describe en 4.6) a 25 ° C.
  3. Detectar la reacción colocando una sonda de fluorescencia (longitud de onda de excitación: 570 nm, longitud de onda emisión: 585 nm) aprox. 10 mm directamente por encima de un microreactor abierto antes de la fusión.

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Representative Results

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Las partículas de cáscara tienen un diámetro de alrededor de 640 nm. Las nanopartículas magnetizables dentro de esta las partículas de cáscara de fluorosilane tienen diámetros en un rango entre 22 nm y 37 nm. Un microreactor de 5 μl con agua como un núcleo líquido tenía un ángulo de contacto de alrededor de 160°.

La fuerza necesaria para mover un microreactor de 10 μl, como se describe anteriormente es 1.34 ± 0.08 µN. la figura 1 muestra la fuerza electromagnética de una bobina con 4.500 bobinados de alambre de cobre y un núcleo interior de hierro con 58 mA. La distribución de fuerza se estima un modelo de elementos finitos (FEM) para determinar las propiedades de la bobina necesaria para mover un microreactor. Como puede verse en la figura 1, la fuerza magnética dirigida por la bobina se describe es lo suficientemente fuerte como para mover un microreactor a una distancia de más de 10 mm del centro de la bobina.

La fuerza magnética para abrir un microreactor es igual a 0.85 mN ± 0.05 que es mucho mayor que la fuerza necesaria para mover la gota. Como la fuerza magnética inducida por la bobina con el núcleo de hierro (figura 1) no es lo suficientemente fuerte como para abrir un microreactor, un imán de neodimio fue utilizado en las bobinas. Alimentando las bobinas dobles en las direcciones de flujo de corriente alterna, se puede mover el imán permanente hacia o lejos de la plataforma. Así, los microreactores pueden abre o se cierra magnéticamente. Si dos microreactores con una cáscara totalmente intacta se encuentran lado a lado no combinan como la tensión superficial inhibe su fusión. Por lo tanto al menos uno debe estar abierto.

La figura 2 muestra la cinética de Michaelis-Menten resultante de fusión un microreactor de 10 μl que contiene peroxidasa con otro 10 microreactor μl que contiene el sustrato correspondiente (n = 3). Por valor de Lineweaver-Burk linearización K calculadom para la reacción dentro del microreactor es 86.85 μm ± 10.95 μm, el valormáximo de v se encuentra en 378.8 nmol L-1 s-1 ± 115,6 nmol L-1 s-1. Que el valor dem K sea en buena correspondencia con eso dado en literatura, 81 ± 3 μm 32, se puede suponer que la reacción enzimática dentro de los microreactores en pequeña escala con el material de la cáscara hidrofóbico no se influencia con respecto a afinidad.

Figure 1
Figura 1: Simulación de una bobina con 58 la fuerza electromagnética mA y 4.500 bobinados de cobre alambre en dependencia de la distancia de los microreactores al centro de la bobina determinado FEM. El diámetro de la bobina es 10 mm, el diámetro de la base de hierro 4 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cinética de Michaelis-Menten de la peroxidasa se mide por la fusión de dos 10 μl microreactores. La temperatura es 25 ° C y el buffer utilizado es el fosfato de potasio (0,1 M) con un pH de 6.5. Se realizaron tres repeticiones.

Figure 3
Figura 3: Plataforma de actuación. La plataforma de actuación consiste en una matriz de 3 x 3 de bobinas dobles. Una bobina tiene 4.500 bobinados, una altura de 16 m m (una cámara), un diámetro de 10 mm y un diámetro interior de aprox. 4 mm. La altura de las bobinas está predefinida por la altura la utiliza cilindros de imanes de neodimio. El diámetro fue elegido porque estudios anteriores demostraron que se trata de una distancia razonable para un microreactor con este tipo de imán en movimiento. Se determinó el número de los devanados y la corriente por FEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Para el uso exitoso de las tecnologías de microfluidos, es importante mover el volumen de reacción correspondientes a los requisitos de análisis y la síntesis biotecnológica. La plataforma de actuación presentada aquí permite mover microfluídicos gotitas por la fuerza magnética. El movimiento puede realizarse libremente en dos dimensiones en una superficie plana de una plataforma de reacción utilizando la gota líquida con una cáscara superhidrófobos magnética. Así se introduce un sistema alternativo a canales predefinidos microfluídicos con instalaciones de control de flujo compleja, como se utiliza en sistemas de microfluidos convencional, solventes y muestras. El accionamiento automatizado de gotitas pequeñas de la reacción así es una simplificación importante de las conocidas plataformas de lab on a chip. Además, esta plataforma hace posible abrir reversiblemente un microreactor para añadir y eliminar muestras de reacción. En combinación con un sistema de depósito, esto puede resultar en un alto grado de control de reacción automatizada y es el primer paso para en silico diseño microreactions en un virtual laboratorio-en-un-drop. La principal limitación de esta técnica es que los microreactores pueden construirse sólo con volúmenes pequeños (hasta aprox. 30 μL). Un paso crítico en el protocolo es la detección de la reacción enzimática dentro de los microreactores porque la sonda de fluorescencia debe ser ajustada adecuadamente. Otra posibilidad de la detección puede ser espectroscopia UV/vis.

El proceso de desarrollo de la plataforma demostró que una bobina electromagnética con un diámetro de 10 mm es suficiente para el movimiento de la gota. Por otra parte, una bobina doble rellenas de aire o un núcleo de hierro no es capaz de inducir la fuerza magnética que se necesita para abrir un shell microreactor. Por lo tanto, núcleos de neodimio fueron elegidos en las bobinas para realizar esta tarea. Otra vez los gradientes de campo magnético resultante pueden ser variados mediante movimiento electromagnética del imán vertical a la plataforma de reacción. El tamaño de la echada de la plataforma sólo está limitado por el control. El control ya existente y el software está diseñado y listo para usar para una matriz de 10 x 10. El elemento Peltier no es necesaria para las aplicaciones descritas, pero puede ser necesario cuando el microreactor tiene que fijarse por un tiempo más largo y permite que se enfríe la mezcla de reacción sobre la superficie de la plataforma.

En el futuro, la combinación de la plataforma de actuación con los mármoles líquidos puede funcionar como laboratorio-en-un-gota-sistemas flexibles para la aplicación de exámenes, análisis ópticos rápido y complejo enzima cascada reacciones con volúmenes muy pequeños de la reacción. Además, la plataforma puede utilizarse para análisis químicos (bio-) tales como PCR, electroforesis o ELISA. Por otra parte, la proyección de enzimas relevantes nuevos, industriales y amplificaciones de aptámeros es prometedoras posibilidades.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer el DFG para la ayuda.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printer FelixPrinters Pro1
10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red) Life Technologies A12222
Ammonium hydroxide TU-KL 1072
CAD software Siemens Soled edge
Contact angle measuring device Dataphysics OCA 20
Cylinder magnet Webcraft GmbH S-04-13-N https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N
Dipotassium phosphate Bernd Kraft 7758-11
Drying oven Binder FD 115
Ethanol Sigma-Aldrich 68-17-5
FeCl2 tetrahydrate TU-KL 1625
FeCl3 hexahydrate TU-KL 1622
Fluorescence probe PerkinElmer LS 55
Horseradish peroxidase Carl Roth 9003-99-0
Hydrogen peroxide Th.Geyer GmbH & Co 7722-84-1
Monopotassium phosphate Bernd Kraft 7778-77-0
Peltier element Conrad  193569
Perfluoroctyltriethoxysilane Sigma-Aldrich 51851-37-7
Scanning Electron Microscope FEI Helios NanoLab 650 DualBeam
Separation bar magnet Webcraft GmbH Q-40-20-10-N
Winding machine IWT GmbH FW122

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References

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Al-Kaidy, H., Kuthan, K., Hering, T., Tippkötter, N. Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation. J. Vis. Exp. (126), e54643, doi:10.3791/54643 (2017).More

Al-Kaidy, H., Kuthan, K., Hering, T., Tippkötter, N. Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation. J. Vis. Exp. (126), e54643, doi:10.3791/54643 (2017).

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