Introduction
Brillouin lysspredning (BLS) virkning ble oppdaget av Léon Brillouin i 1922. 1. Det består av uelastisk spredning av synlig lys ved termisk aktiverte akustiske fononer i et materiale. I materialfysikk, akustiske fononer er koherente vibrasjoner av alle atomer i et gitter. En en-dimensjonal kjede av to vekslende typer av atomene i et gitter er en enkel modell som illustrerer forskjellen mellom akustiske fononer, åpenbart av BLS og optiske fononer, probet med IR-absorpsjon og Raman-spredning (figur 1). Akustiske fononer er i-fase-bevegelse av atomer i kjeden med en forskyvning langs forplantningsretningen (langsgående akustiske fononer) eller vinkelrett på forplantningsretningen (tver akustiske fononer), mens optiske fononer er ut-av-fase bevegelse av atomene produsere en oscillerende elektrisk dipolmoment (langsgående eller tverrgående modus).
BLS spektrokopi har vært brukt i analytiske vitenskap siden 1920-tallet; imidlertid kun siden 1980-årene har høy kontrast målinger vært mulig ved bruk av den multipass tandem Fabry-Perot-spektrometer. Siden da stadig flere fremskritt i BLS for analytiske applikasjoner i kondensert materie (der fotonet-Phonon interaksjon blir utnyttet) 2-4 og magnetiske materialer (gjennom foton-Magnon interaksjon) 5 har blitt ført. Brytende arbeider på biomedisinske anvendelser 6-8 har banet vei til utvikling av forskjellige framgangsmåter, inkludert den som anvendes her, og det som er beskrevet tidligere 9 ved hjelp av et reflekterende substrat i en plateliknende form for å oppnå den fullstendige beskrivelsen av elastisiteten av tensor en prøve.
I dette arbeidet bruker vi BLS-spektroskopi til de grunnleggende bestanddeler av den ekstracellulære matrise i bindevev, fibrøse proteiner elastin og type I-kollagen. Type I kollagen er en stiv, trippel skruelinjeformet molekyl som setter sammen sideveis og i lengderetningen med utstrakt tverrbinding for å danne i det vesentlige stive fibre i vev så som sener. Nettverk av kollagen ofte sameksistere med nettverk av elastin, et protein som uvanlig, genererer lang elastisitet gjennom en kombinasjon av entropi og hydrofobe interaksjoner med omgivelsene og er avgjørende for funksjonene til vev som lunge og hud. Begge fibrene blir modellert ved hjelp av en sekskantet krystall modell i den pågående forskning. 9 I en del beskriver vi protokollen for å trekke ut fibrene fra animalsk vev og for å forberede prøven for spektroskopiske målinger. I del 2, er prosedyren for å sette opp Brillouin apparater og anskaffe spektra fra fibrene presentert. Del 3 gir detaljer om dataanalyse anvendt på Brillouin spektra å trekke ut relevant mekanisk informasjonen som finnes der. Deretter blir representative resultatene presentert og discussed.
Protocol
Forsiktig: Sjå biologiske sikkerhetsprotokoller og alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Laseren ansatt i disse forsøkene er en klasse 3B laser; overensstemmelse med lokale regler for en sikker bruk av systemet er nødvendig. Vennligst bruk alle nødvendige sikkerhetsrutiner når du utfører en laserspektroskopi måling herunder bruk av personlig verneutstyr (vernebriller).
Tail sener ble oppnådd 7-8 uker gamle Wistar rotter avlives for andre formål i samsvar med EU-forordning 1099/2009 og dyrevelferd (slakting eller avliving) Forskrift 1995. Storfe nuchal leddbånd ble hentet fra en lokal slakteri.
1. Utarbeidelse av Sample Fibers
MERK: Protein fibrene i den ekstracellulære matriks kan ekstraheres fra forskjellige vev, ved hjelp av forskjellige prosedyrer. Protokoller ble raffinert basert på mye brukt prosedyrer.
- Ofre en rotte av intra-peritoneal injeksjon av 100 mg / kg kroppsvekt natriumpentobarbiton. Deretter bryte halen rett på det punktet av kontakt med kroppen, trykke ned med et enkelt-kant barberblad. Pakk halen i plastfolie og oppbevar den fryses ved -20 ° C inntil nødvendig.
- Samle halen fra fryseren, skjæres et 20 mm langt segment fra den proksimale ende mens det fortsatt frosset og deretter la den stå for å tine i en petriskål fylt med fosfatbufret saltvann (PBS) løsning (pH 7,4) ved romtemperatur.
- Når halen er tint, gjør et snitt langs lengden av segmentet ved hjelp av en skalpell til å splitte huden. Så skrelle tilbake for å avdekke fire overtrukne sene bunter om halen vertebra.
- Bruke fin pinsett og være forsiktig med å bruke noen pre-belastning, forsiktig trekke hver fiber ut av skjeden og legg den i et hetteglass med destillert vann med 0,01% vekt / volum natriumazid (NaN 3) for å prhendelse bakterievekst, og lagre nedkjølt. En enkelt hale gir rundt tretti sene fiber.
- For å få ren fiber type I kollagen, gjelder en tre del enzymatisk fordøyelse prosess 10 til de sene fiber for å fjerne proteoglykaner og alt annet noncollagenous materiale.
- Først dyppe fibrene i 0,125 U / ml kondroitinase ABC i 0,05 M Tris-buffer og 0,06 M natriumacetat (CH ^ COONa 3) ved pH 8,0 i 24 timer ved 37 ° C i en risteinkubator ved 200 rpm.
- Deretter dyppe fibrene i en U / ml streptomyces hyaluronidase i 0,05 M Tris-buffer og 0,15 M natriumklorid (NaCl) ved pH 6,0 og gå tilbake til risteinkubator i 24 timer ved 37 ° C.
- Til slutt, dyppe fibrene i 1 mg / ml trypsin i 0,05 M natriumfosfat (NaHPO 4) og 0,15 M NaCl ved pH 7,2 i 16 timer i en rysteinkubator ved 37 ° C.
- Oppbevar de rensede fibre nedkjølt i hetteglass med destillert vann, with 0,01% NaN3 for å hindre bakterievekst, inntil nødvendig for målingen.
- Skaff storfe nuchal ligament fra slakteriet, pakk den i plastfolie og oppbevar den fryses ved -20 ° C inntil bruk.
- For å produsere ren elastin, samle ligament fra fryseren, tillater det å tine ved romtemperatur, avfette den ved hjelp av en skalpell og fordøye ligament i et kokende vannbad i henhold til den prosedyre Lansing, 11 som følger.
- Forbered en 0,1 M løsning av natriumhydroksid (NaOH) i destillert vann og legge den til i fettfri ligament i en erlenmeyerkolbe, som dekker vev.
- Kok kolbe i et vannbad ved 95 ° C i 45 min.
- Fjern ligament fra fordøyelse kolbe og vasker det uoppløselige vevsblokk gjentatte ganger i destillert vann inntil pH 7,0 (overvåket ved hjelp av et pH-meter) oppnås.
- Fjerne vevet fra den endeligeVask løsningen og senke den ned i destillert vann (blandet med 0,01% NaN3 for å hindre bakterievekst) i en lukket beholder og oppbevares i kjøleskap.
- Samle vev fra kjøleskapet, og være forsiktig med å bruke for mye kraft og pre-belastning, bruk pinsett til å trekke mindre elastin segmenter forsiktig (20 til 50 mm lange, ca. 2 mm tykk) bort fra den større blokk og plassere dem i en petriskål med PBS-løsning (pH 7,4).
- Bruke fin pinsett, forsiktig erte små fiberbunter rundt 1 mm tykk og skjær dem i lengder på noen få mm ved hjelp av en skalpell.
- Overfør fibrene til ampuller inneholdende destillert vann (med 0,01% NaN3 for å hindre bakterievekst), og lagre dem i kjøleskap inntil nødvendig for målingen.
- Ved hjelp av en diamant cutter, klippe et stykke av reflekterende silikon lysbilde.
- For å opprette en hydrert kupént, kuttet en stripe av Parafilm for å passe over silikon lysbilde med en hul kutt i sentrum (stor nok til å passe en fiber) og plasser det i silikon underlaget.
NB: For tørre fiber måling, skåret parafilmen inn i en U-form, slik at en av de fire sidene forblir åpen til luften når forseglet i trinn 1.3.4. - Fjern fibrene fra kjøleskapet, bruke et par fine tang til å samle en enkelt fiber fra lagringsløsning og legg den i en liten petriskål fylt med rent vann ved romtemperatur i 5 min for å vaske prøven. Deretter samle fiber og overføre den til midten av Parafilm hul på silikon substratet.
Forsiktig: Unngå å skade fiber ved å strekke det under denne operasjonen, og unngå å snu prøven på underlaget, da dette kan føre til en endring i mekaniske egenskaper. - Plassere et tynt glass dekkglass over fiber og forsegle kammeret ved å føre en oppvarmet loddebolt forsiktig over glassoverflaten for å smelte under Parafilmglasset.
Forsiktig: Unngå å skade fiber ved ikke å bringe loddespiss for nær eller oppvarming underlaget overdrevet. - Plasser forseglet kammer på et flatt underlag under en liten vekt, og la det stå i omkring 12 timer for å oppnå en god kontakt mellom prøven og silikonsubstratet samtidig unngå skade på prøven.
- Fjern vekt og sikre kammeret på plass på underlaget, ved hjelp av skruer.
2. Sette opp Brillouin Eksperimenter og anskaffe Fiber Spectra
- Tilberedning av prøverommet
- Prøven fremstilt som i del 1.3 montere på en vertikal holder utstyrt med et goniometer for å muliggjøre rotasjon i planet til prøven og samtidig opprettholde en konstant spredningsvinkelen (2 Φ = 90 °, se fig SI-1) og spredningsvolumet stilling.
- Utfør en nøyaktig fokus justering av laserlys på prøven gjennom lens. 9
Forsiktig: Laseren utgangseffekt kan være for høy og produsere et brannsår i prøven. Sørg for at det er satt tilstrekkelig høyt til å gi en god følsomhet, men ikke for høy for å unngå skade på prøven. Her ble det benyttet en kraft på ca. 76 mW på prøven. Dette var tilstrekkelig til å få en god følsomhet uten å brenne prøven, også tatt i betraktning at denne er tynn og i kontakt med et substrat som bidrar til avgi varmen som genereres av laserbelysning. - Plasser prøven i 45 ° vinkel (Φ) til laserstrålen ved hjelp av en Vernier skala. Oppnå optimal posisjonering ved å kjøre en måling og maksimere intensiteten av toppene i spektret (se nedenfor).
- Sette opp spektrometeret
- Åpne programvaren for kjøp og manipulering av data og sette opp kjøpet av en Brillouin spekteret av prøven 12. Fremgangsmåten som er beskrevet her gjelder for multipass tandem interferometer (figur SI-1A).
- Juster de to Fabry-Perot (FP) interferometre uavhengig skiftende spenningene brukes på piezo av kontrollenheten. Til denne for-innretningsprosedyre, observere det lys som reflekteres av hver FP. Når intensiteten reflekteres av to fps tendens til null, er det riktig innretting nådd.
- Kalibrer-spektrum: det tilgjengelige frekvensområde, eller frie spektralområde (FSR), er avhengig av avstanden mellom de to speil av den første FP hulrom, L, gjennom FSR = c / 2 L, hvor c er lysets hastighet og L måles ved en oppringt måler.
- Synkroniser skanninger av de to FP interferometre og slå det optiske systemet til tandem multipass konfigurasjon. En tilbakekoplingsstyring av det utsendte laserlys intensitet vil automatisk opprettholde innrettingen av de to fps under målingen.
- måling of Brillouin Spectra
Forsiktig: Den Brillouin-spektrum er svært avhengig av temperaturen og hydratisering av prøven og så nøye kontroll av disse parametre er nøkkelen til å oppnå reproduserbare spektra.- Starte kjøp av en Brillouin-spektrum av prøven og la den gå til et godt signal-til-støy-forhold oppnås. Dette kan ta flere minutter, avhengig av spredningstverrsnitt, konsentrasjon og tykkelsen til prøven.
MERK: det er ikke en tommelfingerregel for signal-til-støy-forhold, men den spektrale kvaliteten kontrolleres av experimentalist basert på den bestemte prøven analyseres. Det er en avveining mellom spektral kvalitet og varighet av målingen, derfor de eksperimentelle parametre må velges i henhold til den spesifikke applikasjonen. - For måling av en tørr prøve, ta suksessive spektra - for hver av dem, etterfølgende trinn 2.3.1 - inntil ingen endringer i posisjonen av toppene is observert. Dette oppnås når prøven er i likevekt med atmosfæren i rommet, og ingen ytterligere tørking vil påvirke spekteret.
- Velg lyspolarisering (VV eller VH; V står for vertikal og H for horisontalretningen til lyset polarisering i forhold til spredningsplanet) og erverve spektra ved hver vinkel i forhold til fiberaksen (θ Fig SI-1) ved å dreie prøven i planet for hånd.
- Lagre Brillouin spektra til fil for senere behandling.
- Starte kjøp av en Brillouin-spektrum av prøven og la den gå til et godt signal-til-støy-forhold oppnås. Dette kan ta flere minutter, avhengig av spredningstverrsnitt, konsentrasjon og tykkelsen til prøven.
3. Analyse av Brillouin Spectra
MERK: Fit analyse av Brillouin topper kan utføres ved hjelp av forskjellige funksjoner. En dempet harmonisk oscillator (DHO) -funksjonen 4,13 ble valgt da dette er en gyldig modell for topper som stammer fra dempede akustiske moduser i viskoelastiske media.
- Fit analyse av Brillouin topper
- Velg spektralområdet for toppen av interesse i the Brillouin spektrum.
- Muliggjøre en grunnlinje i form dersom den spektrale bakgrunnen er mye høyere enn null.
MERK: baseline kan variere mellom spektra. Pass på at korreksjonen er brukt på en systematisk og reproduserbar måte. - Påfør en detaljert minste kvadraters passer å bruke en DHO funksjon 4,13 til Brillouin toppen av interesse iterativt inntil konvergens er oppnådd og den best tilpassede kurven er oppnådd. Deretter lagre fit resultatene til fil.
- Skaff gjennomsnittsverdier fra fit parametere av de to toppene i hver Brillouin dublett.
- Beregn den akustiske bølgehastighet fra toppen frekvens (ved hjelp av uttrykket nedenfor).
- Plotte fit resultater gjennom grafer, f.eks akustisk bølgehastighet vs. vinkel fiber aksen, θ , Og anvende relevante modeller (f.eks, for akustisk anisotrope systemer 9) for å trekke mekaniske mengder som elastisitet tensor koeffisienter.
Representative Results
Brillouin spektroskopi Apparaturen anvendt i dette eksperimentet (figur SI-1A) er blitt beskrevet tidligere. 9 Det benytter en enkeltmodus 532 nm solid-state laser med 76 mW utgangseffekt på prøven. En 20 cm akromatisk linse fokuserer laserlyset på prøven og samler de spredte lyset fra prøven i en tilbakespredning geometri. En tandem multipass Fabry-Perot interferometer blir brukt for å filtrere det spredte lys, som deretter blir detektert av en lav-støyfotodiode detektor. Denne tilnærmingen gir ekstremt høy kontrast (ca. 120 dB) og stabilitet gjennom selv samkjøre piezo-scanning av etalons. En polarisator og analysator er innført for å velge polarisering av hendelsen og spredte lys. Spektra oppnås vanligvis med polarisatoren fastholdt velge den vertikale (V) retning av den innfallende lys polarisering og analysatoren velge alternativt den vertikale (V) or horisontal (H) retning av den spredte lys polarisasjon. I denne konfigurasjonen, er de langsgående og transversale akustiske modi detektert henholdsvis.
En typisk Brillouin-spektrum har en intens sentral topp som skyldes elastisk spredning og ett eller flere sett med like forskjøvet topper, eller Brillouin dubletter, som er signaturen av mekanikken i prøven. I disse målingene, kan det spredte lys stammer både fra bulk fononer som reiser kvasi-ortogonal til prøven, og etter refleksjon av innfallende lys på sample-substrat-grensesnittet, fra bulk fononer som reiser parallelt med overflaten (PS moduser). 9
Figur 2 viser BLS spektra av tørre og hydrerte trypsin-spaltet kollagenfibre som oppnås med VV polarisasjon på 0,2 GHz oppløsning, med en 30 GHz fritt spektralområde og ca 10 min samling gangper spektrum. Hvert spektrum svarer til en bestemt dreievinkel, θ (Figur SI-1C). I tørt kollagen fiber ved θ = 0 °, langsgående modi gir opphav til en massetopp ved (18,92 ± 0,02) GHz mens PS-modus er ved (9,85 ± 0,03) GHz (figur 2A). PS peak skifter til lavere frekvenser som θ går fra 0 ° (Phonon sondering aksiale retningen på fiber) til 90 ° (Phonon sondering radial retning), mens hovedtyngden peak bare litt rød-skift ved å endre θ i samme område (fonon sondering en kvasi-radial retning gjennom hele rotasjonen). I våt kollagenfiber, de to toppene på grunn av de langsgående fononer er i hovedsak uforandret gjennom hele forsøket, og mesteparten topp ved ca. 10,5 GHz og PS-topp ved 4,9 GHz (figur 2B). Dette indikerer en 80 til 100% reduksjon i maksimal frekvens (i forhold til data av 18,92og 9,85 GHz, henholdsvis), og følgelig av stivhet av materialet, på grunn av hydratisering. Legg merke til at bulk og PS måter hydratisert kollagen ligge nær i frekvens til moduser av rent vann, noe som tyder på at dens elastiske konstanter er en kombinasjon av vann og fiber bidrag, med en dominerende rolle spilt av vann.
Figur 3 viser et spektrum av tørr trypsin-spaltet kollagen fiber målt ved θ = 30 ° med VH polarisering; en lekkasje av VV polarisasjonen muliggjør PS og massetopper å fortsatt overholdes. Transversale modi står for en topp på (4,1 ± 0,2) GHz (θ = 0 °), som så vidt blue-skift som q endres fra 0 ° til 90 °. Fit resultater for både de tverrgående og PS topper er også vist. Peak parametre ble hentet ut og akustiske bølgehastigheter ble utledet som V L = v λ / √2, der
Figur 4 er et plott av de akustiske bølgehastigheter som oppnås fra de langsgående og tverrgående modi (PS og T-topper) som en funksjon av vinkelen θ . Fit analyse til en modell av heksagonalt symmetrisk elastisk fast 7 - ligningene A1 og A2 nedenfor - gir de fem komponenter av den elastisitet tensor av tørr trypsin-spaltet type I kollagenfibre (tabell 1).
9
(A1)
(A2)
hvor ρ er tettheten av materialet, og c 11 c 33 c 44 c og 13 er fire av de fem elastiske konstanter som karakteriserer systemer med en heksagonal symmetri. Den femte konstant, c 12, kan avledes fra det omtrentlige forhold c 12 ~ c 11 -. 2 c 44 7
Koeffisienter er lik de som tidligere er oppnådd fra urenset kollagen fibers. 9 En merkbar forskjell oppstår for koeffisienten c 13 som blir reflektert inn i tilsvarende verdier for elastisitetsmodulene E ǁ og E 
(Ca. 7,2 og 7,7 GPa) for den rensede kollagen.
Figur 5 er et plott av den langsgående akustiske bølgehastigheten av våt kollagen versus θ . I dette tilfellet er ingen periodisk endring i frekvens observert, noe som gir en konstant hastighet i løpet av feilen. Figur 6 viser spektrene til tørre og hydrerte elastinfibre målt på q = 0 °. Tverrgående moduser ble ikke oppdaget for disse prøvene. I tørr elastin, oppstår hoveddelen topp på 16,8 GHz mens PS-modus ved 8.2 GHz 9 (13 og 20% lavere enn de tilsvarende toppene i tørr kollagen). Våte elastin fiber presentere en bulk pEAK ved (12,30 ± 0,01) GHz (37% lavere i frekvens enn hoveddelen toppen av tørr elastin). PS-modus av våt elastin er ikke synlig i spekteret på grunn av den intense halen av den elastiske topp ved disse frekvensene. På den annen side er toppen ved ca. 7,5 GHz tilskrives bulk vann.
Figur 7 viser avhengigheten av akustiske bølgehastigheten i tørr elastin fiber på θ. Fra disse data ble de elastisitet tensor komponentene (mekanisk og moduler) erholdt (tabell 1). 9. Som i våt kollagen, det er bevis for isotropi i den mekaniske modulus av hydratiserte elastin fiber. Disse resultatene indikerer hvordan Brillouin-spektroskopi kan gi relevant informasjon om stivhet, sammensetning og strukturelle aspekter ved et materiale.
Figur 1. Akustisk og optiske fononer i en-dimensjonal kjede av atomer. Skjematisk diagram av akustiske og optiske vibrasjoner i en en-dimensjonal diatomisk kjede. Atomer har masse m 1 og m 2 og vekslet. Piler indikerer forskyvninger av atomene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Brillouin-spektrene for trypsin-rensede type I kollagen fibre fra rottehale sene. Spectra av (A) tørr fiber og (B) hydratisert fiber fra VV-målinger ved forskjellig vinkel i forhold til fiberaksen θ, i grader. Et spektrum av rent destillert vann, er også vist. Spektrene ble normalisert til intensiteten (høyde) på bulk topp. Etiketter B og PS betegner toppene er relatert til bulk og parallell-til-overflate moduser, respektivt. Feilfelt indikere standard feil (kvadratroten av antall tellinger). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Brillouin spektrum av tørr trypsin-rensede type I kollagen fibre fra rottehale sene. Spektrum fra en VH måling ved θ = 30 °. Etiketter T, PS og B betegner toppene er relatert til tversgående, parallelle-til-overflate av bulk moduser, respektivt. Resultater av passform analyse ved hjelp av en dempet harmonisk oscillator (DHO) modell for både T og PS modus er også vist. Feilfelt indikere standard feil (kvadratroten av antall tellinger)./54648fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Plot av den akustiske bølgehastigheten i tørr trypsin-renset kollagen vs vinkel i forhold til fiberaksen. Langsgående og tverrgående akustisk bølgehastigheter tørt kollagen fiber avledet fra fit analyse av Brillouin topper. Data er montert på en modell av heksagonalt symmetrisk elastisk faststoff. Rød linje: Ligning A1 (R 2 = 0,99); blå linje: Ligning A2 (R 2 = 0,36). Feilfelt angir standardfeilene hentet fra kvadratroten av de diagonale elementer av kovariansmatrisen etter en Levenberg-Marquardt ikke-lineær minste kvadraters tilpasning av Brillouin spektra. Klikk her for å se et større Versi på denne figuren.
Figur 5. Plot av den langsgående akustiske bølgehastigheten i våt trypsin-renset kollagen vs vinkel i forhold til fiberaksen. Langsgående akustiske bølgehastigheten av hydratisert kollagen fiber avledet fra fit analyse av Brillouin topper. Linjen er vist er en veiledning for øyet og gir den gjennomsnittlige verdien av den akustiske bølgehastigheten i dette område. Feilfelt angir standardfeilene hentet fra kvadratroten av de diagonale elementer av kovariansmatrisen etter en Levenberg-Marquardt ikke-lineær minste kvadraters tilpasning av Brillouin spektra. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
jpg "/>
Figur 6. Brillouin-spektra av elastin fibre fra bovin nuchal ligament. Spectra av tørr og hydratisert fiberen ved θ = 0 °. Spektrene ble normalisert til intensiteten (høyde) på bulk topp. Etiketter B og PS betegner toppene er relatert til bulk og parallell-til-overflate moduser, respektivt. B F og B W refererer til bulk toppene av fiber og vann, henholdsvis. Feilfelt indikere standard feil (kvadratroten av antall tellinger). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Plot av den langsgående akustiske bølgehastigheten i tørr elastin vs vinkel i forhold til fiberaksen. Langsgående akustiske bølgehastigheten av tørr elastin fiber avledet fra fit analyse av Brillouin topper. Data er montert på en modell av heksagonalt symmetrisk elastisk faststoff. Rød linje: Ligning A1 9 (R 2 = 0,74). Feilfelt angir standardfeilene hentet fra kvadratroten av de diagonale elementer av kovariansmatrisen etter en Levenberg-Marquardt ikke-lineær minste kvadraters tilpasning av Brillouin spektra. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur SI-en. Skjematisk av Brillouin-oppsett og BLS spredning geometri. (A) innfallende lys som sendes ut av en solid-state laser blir sendt til prøven gjennom en akromatisk linse. Lyset spres av bulk akustiske fononer og av de som følge av reflection av lys ved substratets overflate, som er i kontakt med prøven, blir samlet av linsen, filtreres av et tandem-multipass Fabry-Perot-interferometer og påvises med en fotomultiplikator. FP1 og FP2 indikere de to interferometrene utgjør tandem-oppsett. En polarisator velger polarisasjonen av innfallende lys, og en analysator benyttes til å velge polarisasjonen av spredt lys. (B) BLS geometri med en prøve i kontakt med overflaten av en reflekterende silisiumsubstrat. En glassplate (ikke vist) er plassert over prøven for å forsegle kammeret, og lett trykk blir tilført gjennom elektrodene ved hjørnene av substratet. Hendelsen lys (k i) passerer gjennom linsen, brytes på luft-prøven grensesnitt (k 'i) og fokusert på sample-underlaget grensesnitt. Den spredte lys samles inn av den samme objektivet (k 's) resultater fra samhandling med både bulk fononer (qb) og de som reiser PS av prøven (q s). . Vinkler mellom retninger av lys og normalen til overflaten, er angitt som Φ og Φ '(C) Skjematisk diagram av prøven og av den vedtatte koordinatsystem; z definerer den ekstraordinære akse parallell til retningen av fibrene. Vinkler θ og α er de mellom retning av fononer q s og q b til z-aksen, henholdsvis ki, k 'i, k s, k' s. Bølgetall til hendelsen og spredt lys, q b, q s, bølge vektorer av hoveddelen og PS moduser, respektivt. (Gjengitt fra ref 9.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| prøve | elastiske koeffisienter (GPa) | |
| trypsin-fordøyd kollagen | c 33 | 18,7 ± 0,1 |
| c 11 | 14,4 ± 0,2 | |
| c 44 | 3,4 ± 0,1 | |
| c 12 | 7,2 ± 0,2 | |
| c 13 | 11,2 ± 0,3 | |
| elastin | c 33 | 11,5 ± 0,2 |
| c 11 | 10,4 ± 0,1 | |
| c 44 | 1,9 ± 0,2 | |
| c 12 | 6,6 ± 0,2 | |
| c 13 | 6,8 ± 0,3 | |
Discussion
Brillouin-spredning spektroskopi er et unikt verktøy ved hvilken de enkelte komponentene av elastisiteten tensor av et protein fiber kan karakteriseres på enestående detalj. Videre kan målingene utføres på en mikroskopisk skala og derved vil gi oss ny innsikt i mikro-skala mekanikken av biologiske strukturer, slik at vi for første gang, for å forstå den mekaniske, og sannsynligvis funksjonelle betydning av kompleksiteten i matrisen arkitektur og biokjemi som har blitt avslørt de siste årene.
Teknikken måler mekaniske egenskaper i en GHz frekvensområdet. Dette domenet har aldri vært utforsket før for strukturelle biopolymerer og det både øker og gir mulighet til å svare på grunnleggende spørsmål om molekylære mekanismer av elastisitet.
Vi beskrev fremgangsmåten for å trekke kollagen og elastin fiber fra animalsk vev og å måle Brillouin scattering spektra ved bruk av et reflekterende substrat for å oppnå en fullstendig beskrivelse av fiber biomekanikk. Kritiske trinnene i protokollen, er de som sikrer at rensede fibre erholdes og egnede eksperimentelle forhold er på plass for reproduserbare målinger av den fibrøse proteiner. Det må imidlertid tas i betraktning at ekstraksjonsmetoder kan modifisere de mekaniske egenskaper for fibrene.
Modifikasjoner av den teknikk som involverer kobling med optisk mikroskopi for microfocused Brillouin-spredning og kartlegging nærmer seg 13, og den mulige kombinasjon med komplementære teknikker (f.eks Raman-spredning). Aktuelle anvendelser av teknikken er i hovedsak fokusert på utskårende biologisk materiale, men viktige utviklingstrekk, for eksempel de som er basert på flere Vipa etalons 14, gjør mulig oversettelse av denne teknikken fra den stasjonære maskiner til sengen med en rekke applikasjoner allerede demonstrated 15,16 inkludert potensial in vivo applikasjoner. Den VIPA tilnærmingen er et alternativ til det vi beskriver; den har raskere innhentingstiden, men er ikke nødvendigvis er hensiktsmessig i tilfelle av ugjennomsiktig prøver slik som de som analyseres her. Dessuten er bruken av et reflekterende substrat ikke er praktisk i oppsett som benytter VIPA etalons fordi deres derimot ikke ville være tilstrekkelig til å avvise den kvasi-elastisk lys. Begrensninger knyttet til hastigheten på kjøpet av en spektral datasett og iboende svake spredning tverrsnitt av materialet kan begrense programmer til dynamiske biologiske systemer, og til kjøp av data fra dypt inne vev, men tekniske finesser kan forbedre på nåværende ytelse.
BLS lover å være et viktig verktøy i fundamental biofysiske forskning på ekstracellulære matrise og dermed til å produsere ny innsikt i utviklingen av mekaniske egenskaper under matrise vekst og deres tap i patologiskdegenerasjon. Det er imidlertid viktig å huske på at målingene er ikke-invasiv og kan derfor bli foretatt in vivo. Faktisk er dette allerede er oppnådd i hornhinnen 16 og slikt arbeid kan tilveiebringe en plattform for utvikling av nye diagnostiske verktøy for et bredt spekter av bindevevssykdommer.
Ultralyd elastography og atomkraftmikroskopi (AFM) finnes alternative metoder for mikromekanisk måling, men BLS teknikken gir bedre romlig oppløsning (på en subcellulære skala) enn den førstnevnte, og, i motsetning til AFM, stiller ingen mekaniske krefter på prøven, og er ikke begrenset til analysen eneste av overflatetrekk. Brillouin-moduler kollagen og elastin er i GPa rekkevidde, mens Youngs moduler fra makroskopiske stammer er i størrelsesorden MPa (ytterligere detaljer vil bli rapportert andre steder). Dette resultatet indikerer en differensialelastisitetsmodul med en sterk avhengighet av eksiteringsfrekvensen, på grunnden viskoelastiske oppførsel av fibrene. BLS kan brukes på en lang rekke problemer og materialer i biomedisinsk forskning. Det kan hjelpe i å svare på spørsmål om fysiologi og patologi av biologiske vev, samt gi et fysisk verktøy for grunnleggende forståelse av materialer og samhandling på molekylært nivå.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C2905 | |
| Tris Buffer | Fluka | 93358 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | S608-500 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S2002 | |
| Streptomyces Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H1136-1AMP | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S7653 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4665 | |
| Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S320-500 | |
| Pure Water | Millipore | ZRQS0P3WW | Produced in-house |
| Distilled Water | Bibby Scientific Limited | D4000 | Produced in-house from water still |
| Euthatal | Merial | J01601A | |
| Tandem Interferometer TFP-1 | JRS Scientific Instruments | ||
| Freezer | Lec | TU55144 | |
| Refrigerator | Zanussi | ZBA15021SA | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | SP88857206 | |
| Clamps | VWR | 241-7311 & 241-7201 | |
| Clamp Stand | VWR | 241-0093 | |
| Thermometer | Fisher Scientific | 13-201-401 | |
| Cling Film | Sainsbury's | 7650540 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Silicone | IDB Technologies | N/A | No catalogue number. Order upon request. |
| Cover Glass | VWR | 631-1571 | |
| Conical Flask | VWR | 214-1175 | |
| Beaker | VWR | 213-0469 | |
| Measuring Cylinder | VWR | 612-3838 | |
| Vial | VWR | 548-0051 & 548-0863 | |
| Petri Dish | VWR | 391-0441 | |
| Scalpel | Swann Morton Ltd | 0914 & 0308 | |
| Diamond Scribe | RS Instruments | 394-217 | |
| Soldering Iron | RS Instruments | 231-5332 | |
| Fine Forceps | VWR | 232-0188 | |
| Double Micro-Spatula | VWR | Various Sizes | |
| pH Meter | Hanna Instruments | HI-2210-02 | |
| Orbital Shaker | IKA | 0002819000 |
References
- Brillouin, L. Diffusion de la lumière et des rayonnes X par un corps transparent homogène; influence de l'agitation thermique. Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).
- Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials. J. Chem. Phys. 141 (21), 214901 (2014).
- Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids. Soft Matter. 8 (15), 4235-4243 (2012).
- Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D. Solid State Physics. Robert, E. C., Robert, L. S. 63, Academic Press. 1-77 (2012).
- Madami, M., et al. Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque. Nat. Nanotechnol. 6 (10), 635-638 (2011).
- Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle. Nature. 267 (5608), 285-287 (1977).
- Cusack, S., Miller, A. Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering. J. Mol. Biol. 135 (1), 39-51 (1979).
- Vaughan, J. M., Randall, J. T. Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye. Nature. 284 (5755), 489-491 (1980).
- Palombo, F., et al. Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering. J. R. Soc. Interface. 11 (101), (2014).
- Sivan, S. S., et al. Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs. Biochem. J. 399 (1), 29-35 (2006).
- Leon, W. C. Methods in Enzymology. 144, Academic Press. 196-214 (1987).
- Fioretto, D., Scarponi, F. Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering. Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).
- Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy. Analyst. 139 (4), 729-733 (2014).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Express. 19 (11), 10913-10922 (2011).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Express. 20 (8), 9197-9202 (2012).
