Introduction
Rodent modeller er blevet brugt til at studere talrige menneskelige sygdoms manifestationer, herunder pyelonefrit og urinvejsinfektioner (UTI). UTI er et globalt sundhedsproblem og kan påvirke børn, mænd og kvinder i alle aldre. 1 , 2 , 3 Den oprindelige manifestation af UTI'er omfatter blærebetændelse, og hvis infektionen stiger langs ureteren, kan en nyreinfektion (pyelonefritis) følge. Samtidig nærmer forekomsten af diabetes over 400 millioner mennesker over hele verden. 4 , 5 Vigtigt kan UTI-forekomsten være op til 4 gange højere hos patienter, der er overvægtige eller har type 2 diabetes mellitus, hvilket medfører øget risiko for tilbagevendende UTI-infektion (rUTI), sepsis, renal fibrose fra pyelonefritis og blæredysfunktion. 6 , 7 , 8 RodentModeller er vigtige for at studere UTI'er, fordi de nuværende antibiotiske terapier kun giver en vedvarende forebyggende respons i en del af UTI-patienter. For at forbedre klinisk UTI-pleje er nøgletrinene at forstå mekanismen for rUTI og dens patofysiologiske processer fra akut infektion til inflammation over for fibrose samt virkningen af type 2 diabetes mellitus.
Målet med at forbedre dyremodeller er at udvikle teknikker, der muliggør en mere præcis vurdering af sygdomsprogression og terapeutiske interventioner. Flere forskellige tilgange har været anvendt til at inducere pyelonefrit hos rotter og / eller mus for at studere patofysiologien af nyreskade, virkningen af antibiotikabehandling og andre aspekter af det naturlige forløb af UTI'er. En fælles fremgangsmåde til etablering af retrograd UTI er transurethral kateterisering. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> Denne metode introducerer bakterier via urinrøret i urinblæren hos bedøvede dyr. Mens denne teknik simpelthen simulerer menneskelig pyelonefrit, kan den faktiske forekomst og omfanget af pyelonefritisinfektion være meget variabel på grund af flere faktorer, herunder mangel på spontan ureter reflux eller urinrøvning under eller umiddelbart efter inokulation. 11 Som følge heraf den eksperimentelle variabilitet i at inducere en opadgående pyelonephritis-infektion kan begrænse anvendeligheden af denne model til at studere nyre infektioner samt terapeutiske strategier.
Denne rapport beskriver en kirurgisk pyelonefritis-rottemodel, hvor E. coli injiceres direkte i rotteryren. På trods af at denne rottemodel er invasiv, kan mængden af E. coli leveret til nyren effektivt kontrolleres, hvilket muliggør en robust nyreinfektion og betændelse. 14 I denne procedure beskriver vi ogsåHvordan disse inducerede nyresygdomme kan overvåges i længderetningen med in vivo magnetisk resonansbilleddannelse (MR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med godkendte Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokoller hos Case Western Reserve University. Varigheden af den kirurgiske procedure beskrevet nedenfor er ca. 45-60 minutter. MRI-proceduren i sig selv er ca. 15 minutter for hvert tidspunkt.
1. Anæstesi
- Bedøves rotte i isoflurankammer sat til 2% isofluran blandet med oxygen for at lette dyrehåndtering og tilbageholdenhed inden administration af injicerbar bedøvelse intraperitonealt.
- Efter 3-5 min eksponering for isofluran skal du kontrollere, at dyret er bedøvet og ikke udviser noget svar på tåhinde.
- Yderligere sederende rotte med en intraperitoneal injektion af en blanding af xylazin og ketamin: 75 mg / kg ketamin / 10 mg / kg xylazin. Når du udfører intraperitoneale injektioner, skal du trække nålen tilbage for at sikre, at dele af tarmen eller andre vitale organer ikke er punkteret.
- jegInjicer 2 mg / kg bupivacain subkutant på skæringsstedet for at give lokal smertelindring.
2. Forberedelse af kirurgisk område
- Steriliser kirurgiske instrumenter og forsyninger, før de bruges til operation og læg ud på kirurgisk pad til sterilitet. De fleste instrumenter og forsyninger kan autoklaveres og genanvendes.
- Brug sterile handsker til alle kirurgiske procedurer.
- Brug en elektrisk barbermaskine til at barbere pelsen ud af dyrets højre side. Barber dyret fra bunden af ribbenburet til toppen af bagbenet, hvilket giver et stort hårfrit område for snittet.
- Anbring dyret på en steril kirurgisk pude for at isolere det desinficerede område fra omgivende områder.
- Skrub huden med et desinfektionsmiddel, såsom povidon iod eller betadin. Start skrubningen i midten af det kirurgiske område og bevæge sig udad på en cirkulær måde. Gentag mindst tre gange med en ny aftørring af povidonjod eller betadin. Skrub det kirurgiske sted med 70% alkoholpind, indtil huden er klar, da jod kan være giftigt, hvis det absorberes.
3. kirurgisk procedure
- Vedligehold denne procedure under aseptiske forhold.
- Placer det bedøvede dyr på en varm opvarmning seng i venstre lateral decubitus position med højre flanke vendt opad.
BEMÆRK: Der skal sørges for at opretholde dyreens kropstemperatur ved 35-37 ° C for at forhindre hypotermi. Denne opvarmningslejet bør også steriliseres efter behov for at opretholde aseptiske forhold. - Feel for ribbe buret og lav en lille 2-3 cm højre dorsal retroperitoneal indsnit ved hjælp af en steril størrelse 10 skalpellblad startende ved bunden af ribben bur.
- Placer sterilt gaze langsgående langs begge sider af snittet.
- Dissektér det subkutane væv, fedt og muskler for at visualisere og få adgang til bukhulen. Brug buet bladet Mayo saks for at tillade dybere penetreringRation i sår og skåret tykt væv.
- Når leveren er tydelig synlig og tilgængelig, skal du bruge blanke tang for at trække leveren opad.
- Brug et andet par blunt tang i den anden side, udsæt den rigtige nyre, så den sidder lige uden for bughulen.
- Brug pegefingeren og tommelfingeren til venstre for at holde nyren på plads. Med den højre hånd injiceres langsomt og støt 0,1 ml UTI89 E. coli opløsning (koncentration mellem 1 x 10 8 -1 x 10 9 ) fra en steril sprøjte ind i nyren (som vises som en hvid boble) 15 .
BEMÆRK: Forbered bakterietiteren som beskrevet i reference 15 . - Anbring en strimmel absorberbar hæmostat over nålen for at forhindre udstrømning af inokulum i peritoneum. Træk langsomt nålen ud af nyrens bækken.
BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed for ikke at gennembore eller inficere omgivende væv, hvilket resulterer i off-target infectiOns og / eller komplikationer. - Brug en større sprøjte til at skylle nyren grundigt med normal saltvand, før du sætter den tilbage i bukhulen.
4. Suturer
Bemærk: Sutur, der vil blive begravet i væv, skal være 4-0 ikke-absorberbare flettet suturer. Absorberbare eller monofilament suturer kan anvendes til kropsoverflader.
- Placer suturerne jævnt og så tæt på vævskanten som muligt for at forhindre forhindring af blodgennemstrømning; Typisk ikke mere end 0,3 cm fra kanten er nødvendig.
- Tag fat i huden og tag den lidt ud ved hjælp af et par fintandede tang og drej nålholderen i en udtalt stilling som forberedelse til at gennembore huden.
- Kør nålen gennem hele tykkelsen af huden ved at supine håndleddet for at dreje nålen og passere det gennem huden.
- Gentag denne proces for hudkanten tæt på den person, der udfører proceduren.
- StrammeSuturerne er tilstrækkelige til at modstå vævskanterne. Enhver strammere vil forhindre blodtilførsel, langsom sårheling og kan resultere i udryddelse.
- Slip suturen ud ved hjælp af firkantede knuder, som om det var en simpel afbrudt sting, bortset fra at kun den korte streng skæres og efterlader ca. 3-4 mm hale.
- Efter at den første søm er blevet bundet, skal du forberede dig til at placere en anden søm ca. 3 mm væk fra den første, og fortsæt løbens sutur.
- Når slutningen af snittet er nået, træk ikke den sidste søm helt igennem. I stedet skal du bruge den løkke, der holdes med nålholderen her som den korte streng for at binde den distale ende af suturlukningen.
- Ved hjælp af instrumentbånd binder du suturen ved hjælp af firkantede knuder. Dette resulterer i 3 tråde stikker op fra den færdige knude i den distale ende.
5. Animal Recovery
- Injicer 2,1 mg / kg Yohimbin intraperitonealt efter kirurgi for at vende anæstesi. ENNimaler forventes fuldt ud at komme sig fra den kirurgiske procedure efter 3-5 timer.
- Hold dyret på en varmepude (for at undgå hypotermi) og absorberende blødt sengetøj efter operationen.
- Giv rehydrering med orale eller parenterale væsker, indtil det kan vende tilbage til normal fodring (inden for 24 timer). Injicer ca. 0,6 ml normal saltopløsning peritonealt umiddelbart efter operationen for at begrænse dehydreringseffekter.
- Tilvejebring analgesi som beskrevet i den IACUC godkendte Animal Care and Use Protocol. Injicer 5 mg / kg carprofen subkutant til smertebehandling.
- Overvåg indsnit regelmæssigt til hævelse, ekssudat, smerte eller dehiscens.
6. Validering via magnetisk resonansbilleddannelse
- Udfør i n vivo MR-eksperimenter på MRI-scannere med høj dyreforsøg.
- Inducer anæstesi med 3% isofluran i ilt og position dyret med den rigtige nyre ved isocenter i MR-scanneren og passendeSpiste radiofrekvensspole. Giver dyr med 1-2% isoflurananæstesi kontinuerligt igennem billeddannelsesproceduren via en nosekon.
BEMÆRK: For in vivo MRI-billederne vist i figur 1 blev der anvendt en rotorstørrelsesvolumespole (indre diameter = 72 mm). - Brug et dyr overvågnings- og kontrolsystem for at opretholde hvert dyrs respirationshastighed (40-60 åndedræt / min) og kerne kropstemperatur (35 ± 1 ° C).
- Brug et multi-skive, multi-ekko-spin-ekko-MRI-opkøb for at opnå højopløsende, axiale T2-vægtede billeder af både de inficerede og kontrollerede nyrer. Typiske MRI-opkøbsparametre er gentagelsestid = 5.000 msek, ekotid = 40 msek, skive tykkelse = 2,0 mm, rumlig opløsning i flyet = 200 μm, 3 signalgennemsnit og en overtagelsestid på 8 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medicinsk billedteknik giver mulighed for ikke-invasiv vurdering af UTI og terapeutisk effekt. Derfor blev MR brugt til at validere induktion af akut infektion efter injektion af 1-2 x 107 UTI89 E. coli og til at visualisere forandringer i nyrerne før og efter operationen. Figur la-b viser et progressivt stigende område af nyrebeslag (gule pile). MR-billeder opnået for hvert dyr i dag 1 og 4 efter infektionstjenesten karakteriserer væksten af den akutte pyelonefritis-infektion.
Figur 1: Aksialt T1-vægtet MRI-billeder fra en E. coli -induceret gnavermodel af pyelonefritis ved ( a ) Dag 1 og ( b ) Dag 4 efter infektion (gule pile).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stigende akut pyelonefrit hos gnavere (dvs. mus og rotter) kan produceres ved transurethral kateterisering. 16 , 17 , 18 Denne transurethrale infektionsmetode er fordelagtig, idet den er ikke-invasiv og efterligner den humane patofysiologi af stigende infektion. 17 , 18 , 19 , 20 Imidlertid kan denne metode også lider af uregelmæssige infektionshastigheder og variabel E. coli dosering til nyren på grund af fysiologiske begrænsninger såsom voiding og anatomisk variation. 11 Fierer et al. (1971) rapporterede 6 ud af 40 (15%) rotteryrer, der viste tegn på pyelonefrit efter infusion af E. coli i blæren. 15 Endvidere blev gentagne infusioner af E. coli, krævede flere gange om ugen for at diskriminereAbly producere pyelonefritis. 15 , 19
I denne rapport beskriver vi en alternativ gnaver pyelonefritis model, der kirurgisk introducerer E. coli direkte ind i nyrebækkenet. Den primære fordel ved den kirurgiske model af pyelonephritis-teknik er administration af en konsistent dosis af E. coli- koncentrationen mellem 1 x 10 8 - 1 x 10 9 samt injektion af bakterierne på det samme anatomiske sted (højre nyrebælte) for hver dyr. 15 Denne direkte injektion undgår kravet om tilbagesvaling, der giver en mere pålidelig infektion samt en mere præcis bestemmelse af injiceret dosis. Samlet set giver denne kirurgiske pyelonefritmodel en alternativ mulighed for undersøgelser, der kræver konsistent, reproducerbar infektion med minimal virkning af urethral reflux.
Optimering af succesen med denne kirurgiske teknik omfatter:1) opnå en dyb anæstesi for at begrænse åndedrætsbevægelsen og at tillade tilstrækkelig arbejdstid 2) barbering området af kirurgisk snit for at forhindre forurening fra ikke-prepped områder; 3) sterilisering for at forhindre indførsel af forurening 4) omhyggelig injektion af en kendt dosis af E. coli i råtankenbækkenet 5) grundig saltopløsning af nyren efter injektion 6) tæt tilnærmelse af sårkanter via suturer Og 7) overvågning af intraoperative og postoperative komplikationer såsom hypotermi og systemiske bivirkninger. Selvom en varmepude blev brugt til at øge dyrekomforten, kan denne protokol optimeres yderligere ved anvendelse af en rektal temperatursensor til opretholdelse af kernekropstemperaturen. Et vigtigt skridt i at opnå en vellykket overlevelsekirurgi er korrekt bedøvelse og overvågning af dyrets åndedræt. Manglende at gøre det resulterer i forlængede kirurgiske tider for at stabilisere dyrets bedøvelsesniveau og begrænse uønsket skade på grund af overdrevenbevægelse. Kompromitteret sterilitet i arbejdsområdet og / eller utilsigtet infektion i peritoneum med E. coli- bakterier er også almindelige komplikationer forbundet med den kirurgiske model. Derfor hjælper tilstrækkelig forberedelse til autoklaver kirurgiske værktøjer til at sterilisere hele arbejdsområdet og procedurelle bestræbelser for at begrænse yderligere E. coli- infektioner alle med til at minimere dyre mortalitet såvel som fejlagtige infektionsresultater.
På trods af fordelene ved den direkte injektion af E. coli i nyren har denne kirurgiske model af pyelonefrit også flere begrænsninger i forhold til den transurethrale leveringsmetode. Den største ulempe ved at anvende den direkte kirurgiske indsprøjtningsmetode er den iboende invasiveness af teknikken. Dødeligheden er imidlertid betydeligt lav med implementering af en ordentlig steril teknik og anvendelse af tilstrækkelig smertebehandling, temperaturregulering via varmepuder og blødt absorberende sengetøj efter operationen tilSikre hurtig genopretning. Desuden er autoklaverende kirurgiske værktøjer til sterilisering en ekstremt pålidelig og omkostningseffektiv metode til sterilisering. Den samlede kirurgiske tidsforpligtelse er typisk mindre end 1 time. Desuden sikrer administrationen af anæstesi samt lokal og systemisk levering af smertestillende lægemidler, der er kalibreret til kropsvægt, nøjagtig dosering og sikkerhed for emner. En anden potentiel begrænsning i den kirurgiske model er, at de kirurgiske teknikker er vanskeligere hos mus på grund af de mindre anatomiske størrelser. I modsætning til den transurethrale metode, der kan implementeres i både rotter og mus, øger kravet om at anvende rottemodeller til den kirurgiske model de samlede omkostninger ved undersøgelsen og kan lægge begrænsninger på undersøgelsen af forskellige genetiske ændringer, der kan være lettere tilgængelige Og omkostningseffektive i musemodeller. Som nævnt ovenfor er en anden væsentlig begrænsning af den kirurgiske metode, at den ikke repræsenterer human pyelonefrit somTæt som den transurethrale metode.
Her anvendte vi MR-teknikker til at spore nyrefunktionerne. Som vist i figur 1 giver MR-scanning evnen til ikke-invasiv at overvåge nyrefunktionerne over tid. En alternativ tilgang til sporing af E. coli- infektioner er gennem fluorescerende mærkning af bakterierne. 11 , 18 Imidlertid er fluorescerende billeddannelse mindre effektiv i denne rotte-model (i modsætning til musemodeller) på grund af lysabsorption fra vævet, der resulterer i stærkt reduceret detektionsfølsomhed. Derfor giver MRI et mere følsomt middel til at spore E. coli- infektioner i deres tidligste stadier og at give regionale oplysninger om omfanget af infektionen i tre dimensioner.
Mekanismerne for UTI / akut pyelonefritis-patofysiologi og progressionen til nyresvigt er dårligt forstået. Infektionsmidlerne, de underLiggende immunologisk værtsrespons, og inflammatoriske reaktioner spiller en integreret rolle, men betydningen af hver er ukendt. Forbedringen i målrettet levering af bakterier til nyrerne ved anvendelse af denne direkte injektionsprocedure har potentialet til at øge reproducibiliteten af akut pyelonefrit hos gnavermodeller og måske mere præcist at vurdere tidlige terapeutiske interventioner til behandling af UTI. Denne metode blev oprindeligt udviklet som en fremgangsmåde til optimering af leveringen af bakterier til nyren, men har også ansøgning om levering af andre reagenser og patogener. Denne metode kan ligeledes tilbyde fordele ved studier af blærebetændelse, pyelonefritis, UTI og diabetisk nyresygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbing Pad | Fisher | 14-127-47 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisher | 22-415-469 | |
| Latex Surgical Gloves | Henry Schein Animal Health | 21540 | |
| Curved Mayo Scissors | Fisher | S17341 | |
| Straight Blunt Foreceps | Fisher | 08-895 | |
| Scalpel Handle | Fisher | 08-913-5 | |
| Sterile Scalpel Blades | Fisher | 53220 | |
| 1 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 309628 | For bacterial injections |
| 20 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 301031 | For saline wash |
| Hemostat | Seneca Medical | 240267 | |
| 23 G 3/4 in. Needle | BD Biosciences | 305143 | |
| 30 G 1 in. Needle | BD Biosciences | 305128 | |
| U-100 Insulin Syringe | Exel International | 25846 | For medication injections |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Xylazine | Henry Schein Animal Health | 33197 | Inject IP |
| Ketamine | Patterson Vetrinary | 07-881-9413 | Inject IP |
| Yohimbine (Atipamezole) | Patterson Vetrinary | 07-867-7097 | Inject IP after surgery |
| Bupivacaine (Marcaine) | Patterson Vetrinary | 07-890-4584 | Inject SQ at site of incision |
| 4-0 Chromic Gut Suture | Ethicon Inc. | U203H | |
| 4-0 Braided Vicryl Suture | Ethicon Inc. | J304H | |
| 1 ml SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| E. coli UTI89 or CFT073 | ATCC | 700928 | |
| Surgicel Absorbable Hemostat | Ethicon Inc. | ETH1951CS | |
| Biospec 9.4T MRI | Bruker | 94/20 USR |
References
- Saliba, W., Barnett-Griness, O., Rennert, G. The association between obesity and urinary tract infection. Eur J Intern Med. 24 (2), 27-31 (2012).
- Semins, M., Shore, A., Makary, M., Weiner, J., Matlaga, B. The impact of obesity on urinary tract infection risk. Urology. 79 (2), 266-269 (2011).
- Zilberberg, M., Shorr, A. Secular trends in gram-negative resistance among urinary tract infection hospitalizations in the United States, 2000-2009. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (9), 940-946 (2013).
- Whiting, D., Guariguata, L., Weil, C., Shaw, J. IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 94 (3), 311-321 (2011).
- Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 27 (5), 1047-1053 (2004).
- Ma, D., Gulani, V., Seiberlich, N., Liu, K., Sunshine, J., Duerk, J., et al. Magnetic resonance fingerprinting. Nature. 495 (7440), 187-192 (2013).
- Lu, L., Sedor, J., Gulani, V., Schelling, J., O'Brien, A., Flask, C. A., et al. Use of diffusion tensor MRI to identify early changes in diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 34 (5), 476-482 (2011).
- Rosen, D., Hooton, T., Stamm, W., Humphrey, P., Hultgren, S. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
- Torine, L. A. Urinary tract infection: diabetic women's strategies for prevention. Br J Nurs. 20 (13), 791-792 (2011).
- Rosen, D., Hung, C., Kline, K., Hultgren, S. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect Immun. 76 (9), 4290-4298 (2008).
- Larsson, P., Kaijser, B., Mattsby-Baltzer, I., Olling, S. An experimental model for ascending acute pyelonephritis caused by Escherichia coli or proteus in rats. J Clin Pathol. 33 (4), 408-412 (1980).
- Gupta, R., Ganguly, N., Ahuja, V., Joshi, K., Sharma, S. An ascending non-obstructive model for chronic pyelonephritis in BALB/c mice. J. Med. Microbiol. 43 (1), 33-36 (1995).
- Fernandes, P., Shipkowitz, N., Bower, R. Murine models for studying the pathogenesis and treatment of pyelonephritis. Adv. Exp. Med. Biol. 224, 35-51 (1987).
- Kaye, D. The effect of water diuresis on spread of bacteria through the urinary tract. J. Infect. Dis. 124 (3), 297-305 (1971).
- Fierer, J., Tainer, L., Braude, A. Bacteremia in the pathogenesis of retrograde E. coli pyelonephritis in the rat. Am. J. Pathol. 64 (2), 443-456 (1971).
- Nickel, J., Olson, M., Costerton, J. Rat model of experimental bacterial prostatitis. Infection. 19 (3), S126-S130 (1991).
- Hagberg, L., Engberg, I., Freter, R., Olling, S., Eden, C. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Am Soc Microbiol. 40 (1), 273-283 (1983).
- Kurosaka, Y., Ishida, Y., Yamamura, E., Takase, H., Otani, T., Kumon, H. A non-surgical rat model of foreign body-associated urinary tract infection with Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Immunol. 45 (1), 9-15 (2001).
- Anderson, B., Jackson, G. Pyelitis, an important factor in the pathogenesis of retrograde pyelonephritis. J Exp Med. 114 (3), 375-384 (1961).
- Anderson, J. Vesico-ureteric reflux. J R Soc Med. 55 (6), 419-426 (1962).
