Introduction
Les modèles de rongeurs ont été utilisés pour étudier de nombreuses manifestations de maladies humaines, y compris la pyélonéphrite et les infections urinaires (UTI). Les infections urinaires sont un problème de santé mondial et peuvent avoir un impact sur les enfants, les hommes et les femmes de tous âges. 1 , 2 , 3 La manifestation initiale de l'UTI comprend la cystite, et si l'infection augmente le long de l'urètre, une infection rénale (pyélonéphrite) peut suivre. Dans le même temps, la prévalence du diabète touche environ 400 millions de personnes à travers le monde. 4 , 5 Il est important de noter que l'incidence de l'UTI peut être jusqu'à 4 fois plus élevée chez les patients obèses ou qui ont un diabète de type 2, ce qui entraîne un risque accru d'infection à UTI récurrente (UTI), une septicémie, une fibrose rénale de la pyélonéphrite et un dysfonctionnement de la vessie. 6 , 7 , 8 RongeurLes modèles sont importants dans l'étude des infections urinaires, car les traitements antibiotiques actuels produisent une réponse préventive et soutenue uniquement dans un sous-ensemble de patients atteints d'UTI. Pour améliorer les soins cliniques d'UTI, les étapes clés sont de comprendre le mécanisme de rUTI et ses processus pathophysiologiques, de l'infection aiguë à l'inflammation à la fibrose, ainsi que l'impact du diabète sucré de type 2.
L'objectif d'améliorer les modèles animaux est de développer des techniques permettant une évaluation plus précise de la progression de la maladie et des interventions thérapeutiques. Plusieurs approches différentes ont été utilisées pour induire une pyélonéphrite chez les rats et / ou les souris pour étudier la pathophysiologie des lésions rénales, l'effet du traitement antibiotique et d'autres aspects du cours naturel des infections urinaires. Une approche commune pour établir une UTI rétrograde est le cathétérisme transurétral. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> Cette méthode introduit des bactéries par l'urètre dans la vessie des animaux anesthésiés. Bien que cette technique simule de près la pyélonéphrite humaine, l'incidence et l'ampleur réelles de l'infection pyélonéphrite peuvent être très variables en raison de multiples facteurs, y compris un manque de reflux urétéral spontané ou de sédiment urinaire pendant ou immédiatement après l'inoculation. 11 En conséquence, la variabilité expérimentale pour induire une infection ascendante de pyélonéphrite peut limiter l'utilité de ce modèle pour étudier les infections rénales ainsi que des stratégies thérapeutiques.
Ce rapport décrit un modèle de rat de pyélonéphrite chirurgicale où E. coli est directement injecté dans le rein du rat. Bien que ce modèle de rat soit envahissant, la quantité d' E. Coli délivrée au rein peut être efficacement contrôlée, ce qui permet une infection et une inflammation rénales rénales. 14 Dans cette procédure, nous décrivons égalementComment ces infections rénales induites peuvent être surveillées longitudinalement avec l'imagerie par résonance magnétique (MRI) in vivo .
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Protocol
Toutes les études sur les animaux ont été effectuées selon les protocoles approuvés du Comité d'aide et de prise en charge des animaux institutionnels (IACUC) à l'Université Case Western Reserve. La durée de la procédure chirurgicale décrite ci-dessous est d'environ 45 à 60 minutes. La procédure d'IRM elle-même est d'environ 15 minutes pour chaque point de temps.
1. Anesthésie
- Anesthésier le rat dans la chambre d'isoflurane réglée à 2% d'isoflurane mélangé à de l'oxygène pour faciliter la manipulation et la contrainte des animaux avant d'administrer une anesthésie injectable intrapéritonéale.
- Après 3 à 5 minutes d'exposition à l'isoflurane, vérifiez que l'animal est anesthésié et ne présente aucune réponse au pincement de l'orteil.
- Plus de rat sédatif avec une injection intra-péritonéale d'un mélange de xylazine et de kétamine: 75 mg / kg de kétamine / 10 mg / kg de xylazine. Lorsque vous effectuez des injections intra-péritonéales, retirez l'aiguille pour s'assurer que des parties de l'intestin ou d'autres organes vitaux n'ont pas été perforées.
- jeNject 2 mg / kg de bupivacaïne par voie sous-cutanée sur le site d'incision pour fournir un soulagement de la douleur topique.
2. Préparation de la zone chirurgicale
- Stériliser les instruments et les fournitures chirurgicales avant d'être utilisés pour la chirurgie et disposer sur le coussin chirurgical pour la stérilité. La plupart des instruments et des fournitures peuvent être autoclavés et réutilisés.
- Utilisez des gants stériles pour toutes les interventions chirurgicales.
- Utilisez un rasoir électrique pour raser la fourrure du côté droit de l'animal. Raser l'animal du fond de la cage thoracique vers le haut de la patte postérieure en fournissant une grande zone sans cheveux pour l'incision.
- Placez l'animal sur un tampon chirurgical stérile pour isoler la zone désinfectée des zones environnantes.
- Nettoyer la peau avec un désinfectant comme la povidone iodée ou la betadine. Commencez le lavage au centre du site chirurgical et passez à l'extérieur de manière circulaire. Répétez au moins trois fois avec un nouvel essuyage de povidone iodine ou betadine. Scrub le site chirurgical avec des tampons à alcool de 70% jusqu'à ce que la peau soit claire, car l'iode peut être toxique s'il est absorbé.
3. Procédure chirurgicale
- Maintenir cette procédure dans des conditions aseptiques.
- Placez l'animal anesthésié sur un lit de chauffage chaud dans la position de décubitus latéral gauche avec le flanc droit vers le haut.
REMARQUE: il faut veiller à maintenir la température du corps central de l'animal à 35-37 ° C pour prévenir l'hypothermie. Ce lit chauffant devrait également être stérilisé au besoin pour maintenir les conditions aseptiques. - Sentez-vous pour la cage thoracique, et faites une petite incision rétropéritonale dorsale droite de 2-3 cm en utilisant une lame de scalpel stérile de taille 10 commençant au bas de la cage thoracique.
- Placez la gaze stérile longitudinalement de chaque côté de l'incision.
- Dissectionner le tissu sous-cutané, la graisse et les muscles afin de visualiser et d'accéder à la cavité abdominale. Utilisez des ciseaux à lame incurvée pour permettre une pénétration plus profondeRayer la plaie et couper les tissus épais.
- Une fois que le foie est clairement visible et accessible, utilisez une pince serrée pour rétracter le foie vers le haut.
- À l'aide d'une autre paire de pinces émoussées, d'autre part, exposez le rein droit de sorte qu'il se trouve juste à l'extérieur de la cavité abdominale.
- Utilisez le doigt du pointeur et le pouce de la main gauche pour maintenir le rein en position. Avec la main droite, injectez lentement et régulièrement une solution de E. coli UTI89 0,1 ml (concentration entre 1 x 10 8 -1 x 10 9 ) d'une seringue stérile dans le bassin rénal (qui apparaît comme une bulle blanche) 15 .
REMARQUE: Préparez le titre bactérien comme décrit dans la référence 15 . - Placez une bande d'hémostatique absorbable sur l'aiguille pour empêcher l'écoulement d'inoculum dans le péritoine. Retirez lentement l'aiguille du bassin rénal.
REMARQUE: Il faut prendre soin de ne pas percer ou infecter les tissus environnants, ce qui entraîne une infectibilité hors cibleOns et / ou des complications. - Utilisez une seringue plus grande pour bien rincer le rein avec une solution saline normale avant de le remettre dans la cavité abdominale.
4. Sutures
Remarque: La suture qui sera enterrée dans les tissus devrait être de 4 à 0 sutures tressées non absorbables. Les sutures absorbantes ou monofilaments peuvent être utilisées pour les surfaces corporelles.
- Placez les sutures uniformément et aussi près du bord du tissu que possible pour empêcher l'obstruction du flux sanguin; Généralement pas plus de 0,3 cm du bord est nécessaire.
- Saisissez la peau et évitez-la légèrement à l'aide d'une pince fine à pointe dentée, et faites pivoter le porte-aiguille dans une position pronisée en vue de percer la peau.
- Conduisez l'aiguille à travers l'épaisseur totale de la peau en supprimant le poignet pour faire pivoter l'aiguille et la passer à travers la peau.
- Répétez ce processus pour le bord de la peau le plus proche de l'individu exécutant la procédure.
- SerrerLes sutures suffisent pour s'opposer aux bords des tissus. Tout plus serré entravera l'approvisionnement en sang, cicatrisera lentement et entraînera une déhiscence.
- Attachez la suture en utilisant des noeuds carrés, comme s'il s'agissait d'un simple point interrompu, sauf que seul le brin court est coupé, laissant environ une queue de 3-4 mm.
- Une fois que le premier point a été attaché, préparez-vous à placer un deuxième point à environ 3 mm de la première et continuez la suture en cours d'exécution.
- Une fois la fin de l'incision atteinte, n'attimez pas complètement le dernier point. Au lieu de cela, utilisez la boucle qui est retenue avec le porte-aiguille ici comme brins courts pour attacher l'extrémité distale de la fermeture de suture.
- En utilisant des attaches d'instruments, attachez la suture en utilisant des noeuds carrés. Il en résulte 3 brins dépassant le nœud terminé à l'extrémité distale.
5. Récupération animale
- Injecter 2,1 mg / kg de Yohimbine intra-péritonéale après une intervention chirurgicale pour inverser l'anesthésie. UNEOn s'attend à ce que les nimaux se récupèrent complètement de la procédure chirurgicale après 3-5 heures.
- Gardez l'animal sur un coussin chauffant (pour éviter l'hypothermie) et le lit doux absorbant après la chirurgie.
- Fournir une réhydratation avec des liquides oraux ou parentéraux jusqu'à ce qu'il puisse revenir à l'alimentation normale (dans les 24 heures). Injecter environ 0,6 ml de solution saline normale par voie peritoneale immédiatement après la chirurgie pour limiter les effets de déshydratation.
- Fournir une analgésie tel que décrit dans le protocole approuvé par l'IACUC sur les soins et l'utilisation des animaux. Injecter 5 mg / kg de carprofène par voie sous-cutanée pour le traitement de la douleur.
- Surveillez régulièrement les incisions pour le gonflement, l'exsudat, la douleur ou la déhiscence.
6. Validation par imagerie par résonance magnétique
- Effectuer des expériences d'IRM n vivo sur des scanners d'IRM à petits animaux sur le terrain.
- Induire l'anesthésie avec 3% d'isoflurane dans l'oxygène et positionner l'animal avec le rein droit chez isocenter dans le scanner IRM et appropriéA alimenté la bobine radiofréquence. Fournir aux animaux une anesthésie à l'isoflurane à 1-2% en continu tout au long de la procédure d'imagerie par une pointe de nez.
REMARQUE: Pour les images IRM in vivo représentées sur la figure 1 , une bobine de volume de taille de rat (diamètre intérieur = 72 mm) a été utilisée. - Utilisez un système de surveillance et de contrôle des animaux pour maintenir le taux de respiration de chaque animal (40-60 respirations / min) et la température corporelle du corps (35 ± 1 ° C).
- Utiliser une acquisition d'IRM à écho de spin multicouches et multi-écho pour obtenir des images pondérées en T2 axiales et à haute résolution des reins infectés et contrôlés. Les paramètres typiques d'acquisition de l'IRM sont le temps de répétition = 5 000 ms, le temps d'écho = 40 ms, l'épaisseur de la tranche = 2,0 mm, la résolution spatiale dans le plan = 200 μm, 3 moyennes du signal et un temps d'acquisition de 8 min.
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Representative Results
Les techniques d'imagerie médicale offrent la possibilité d'évaluer de façon non invasive l'UTI et l'efficacité thérapeutique. Par conséquent, l'IRM a été utilisée pour valider l'induction d'une infection aiguë après injection de 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli et pour visualiser les changements dans le rein avant et après la chirurgie. La figure 1a-b montre une région d'infection rénale qui augmente progressivement (flèches jaunes). Les images IRM obtenues pour chaque animal aux jours 1 et 4 post-infection aident à caractériser la croissance de la pyélonéphrite aiguë.
Figure 1: Images IRM à pondération T1 axiale à partir d'un modèle de pyrale induit par E. coli de pyélonéphrite à ( a ) Jour 1 et ( b ) Jour 4 après infection (flèches jaunes).
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Discussion
La pyélonéphrite aiguë ascendante chez les rongeurs (c.-à-d. Les souris et les rats) peut être produite par un cathétérisme transurétral. 16 , 17 , 18 Cette méthode d'infection transurétrale est avantageuse en ce qu'elle est non invasive et imite la pathophysiologie humaine de l'infection ascendante. 17 , 18 , 19 , 20 Cependant, cette méthode peut également subir des taux d'infection irréguliers et un dosage variable de E. coli dans le rein en raison de limitations physiologiques telles que l'anéatoire et la variation anatomique. 11 Fierer et al. (1971) ont rapporté 6 des 40 (15%) des reins de rat présentant des signes de pyélonéphrite après perfusion de E. coli dans la vessie. 15 En outre, des infusions répétées de E. coli étaient nécessaires plusieurs fois par semaine pour reliGénétiquement produire une pyélonéphrite. 15 , 19
Dans ce rapport, nous décrivons un modèle alternatif de pyélonéphrite chez les rongeurs qui introduit chirurgicalement E.coli directement dans le bassin gastro-intestinal. Le principal avantage du modèle chirurgical de la technique de pyélonéphrite comprend l'administration d'une dose cohérente de concentration de E. coli entre 1 x 10 8 - 1 x 10 9 ainsi que l'injection de la bactérie au même site anatomique (bassin rénal droit) pour chaque animal. 15 Cette injection directe évite l'exigence de reflux fournissant une infection plus fiable ainsi qu'une détermination plus précise de la dose injectée. Dans l'ensemble, ce modèle de pyélonéphrite chirurgicale constitue une option alternative pour les études nécessitant une infection cohérente et reproductible avec un impact minimal du reflux urétral.
L'optimisation du succès de cette technique chirurgicale est la suivante:1) obtenir une anesthésie profonde pour limiter les mouvements respiratoires et permettre un temps de travail suffisant; 2) rasage de la zone d'incision chirurgicale pour prévenir la contamination des zones non préchauffées; 3) stérilisation pour prévenir l'introduction de la contamination; 4) injection minutieuse d'une dose connue de E. coli dans le bassin rénal du rat; 5) rinçage salin complet du rein après injection; 6) rapprochement étroit des arêtes de la plaie par sutures; Et 7) la surveillance des complications intra-opératoires et post-opératoires telles que l'hypothermie et les effets secondaires systémiques. Bien qu'un coussin chauffant ait été utilisé pour améliorer le confort des animaux, ce protocole peut être encore optimisé en utilisant un capteur de température rectale pour maintenir la température corporelle du corps. Une étape clé dans la réalisation d'une chirurgie de survie réussie est l'anesthésie appropriée et la surveillance de la respiration de l'animal. Le fait de ne pas le faire entraîne une période chirurgicale prolongée pour stabiliser le niveau d'anesthésie de l'animal et limiter les blessures indésirables en raison de l'excèsmouvement. La stérilité compromise de la région de travail et / ou l'infection non intentionnelle du péritoine avec des bactéries E. coli sont également des complications courantes associées au modèle chirurgical. Par conséquent, une préparation adéquate pour l'autoclave des outils chirurgicaux, pour stériliser l'ensemble de l'espace de travail et les efforts de procédure pour limiter les infections E. coli supplémentaires contribuent tous à minimiser la mortalité des animaux ainsi que des résultats d'infection erronés.
Malgré les avantages de l'injection directe de E. coli dans le rein, ce modèle chirurgical de pyélonéphrite a également de multiples limites par rapport à la méthode de transurethral. Le plus grand inconvénient de l'utilisation de l'approche d'injection chirurgicale directe est l'intrusivité intrinsèque de la technique. Cependant, la mortalité est considérablement faible avec la mise en place d'une technique stérile appropriée et l'utilisation d'une gestion adéquate de la douleur, de la régulation de la température par des tampons chauffants et d'une couche de couche douce et absorbante post-chirurgie àAssurer une récupération rapide. En outre, les outils chirurgicaux d'autoclavage pour la stérilisation sont une méthode extrêmement efficace et rentable pour la stérilisation. L'engagement général de temps chirurgical est généralement inférieur à 1 h. De plus, l'administration de l'anesthésie, ainsi que la délivrance locale et systémique de médicaments contre la douleur calibrés sur le poids du corps garantissent une livraison correcte des doses et la sécurité du sujet. Une autre limitation potentielle dans le modèle chirurgical est que les techniques chirurgicales sont plus difficiles chez les souris en raison de la taille anatomique plus petite. Contrairement à la méthode transurétrale qui peut être mise en œuvre chez les rats et les souris, l'exigence d'utiliser des modèles de rat pour le modèle chirurgical augmente le coût global de l'étude et peut imposer des contraintes à l'étude de diverses altérations génétiques qui peuvent être plus facilement disponibles Et rentable dans les modèles de souris. Comme mentionné ci-dessus, une autre limitation significative de la méthode chirurgicale est qu'elle ne représente pas la pyélonéphrite humaineÉtroitement comme la méthode transurethral.
Nous avons utilisé les techniques d'IRM pour suivre les infections rénales. Comme le montre la figure 1 , l'IRM offre la possibilité de surveiller de manière non invasive les infections rénales au fil du temps. Une autre approche pour le suivi des infections par E. coli est le marquage fluorescent de la bactérie. 11 , 18 Cependant, l'imagerie fluorescente est moins efficace dans ce modèle de rat (par opposition aux modèles de souris) en raison de l'absorption de la lumière par le tissu, ce qui entraîne une sensibilité de détection fortement réduite. Par conséquent, l'IRM fournit des moyens plus sensibles pour suivre les infections à E. coli à leur stade précoce et fournir des informations régionales sur l'étendue de l'infection en trois dimensions.
Les mécanismes de l'UTI / la pathophysiologie aiguë de la pyélonéphrite et la progression de la fibrose rénale sont mal compris. Les agents infectieux, les sousLa réponse immunitaire de l'hôte et les réactions inflammatoires jouent un rôle essentiel, mais la signification de chacun est inconnue. L'amélioration de l'administration ciblée de bactéries au rein en utilisant cette procédure d'injection directe a le potentiel d'augmenter la reproductibilité de la pyélonéphrite aiguë dans les modèles de rongeurs et peut-être d'évaluer plus précisément les interventions thérapeutiques au stade précoce pour le traitement de l'UTI. Cette méthode a d'abord été développée comme une approche pour optimiser la livraison des bactéries au rein, mais a également une application pour la délivrance d'autres réactifs et agents pathogènes. Cette méthode peut également offrir des avantages aux études de cystite, de pyélonéphrite, d'UTI et de maladie rénale diabétique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbing Pad | Fisher | 14-127-47 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisher | 22-415-469 | |
| Latex Surgical Gloves | Henry Schein Animal Health | 21540 | |
| Curved Mayo Scissors | Fisher | S17341 | |
| Straight Blunt Foreceps | Fisher | 08-895 | |
| Scalpel Handle | Fisher | 08-913-5 | |
| Sterile Scalpel Blades | Fisher | 53220 | |
| 1 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 309628 | For bacterial injections |
| 20 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 301031 | For saline wash |
| Hemostat | Seneca Medical | 240267 | |
| 23 G 3/4 in. Needle | BD Biosciences | 305143 | |
| 30 G 1 in. Needle | BD Biosciences | 305128 | |
| U-100 Insulin Syringe | Exel International | 25846 | For medication injections |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Xylazine | Henry Schein Animal Health | 33197 | Inject IP |
| Ketamine | Patterson Vetrinary | 07-881-9413 | Inject IP |
| Yohimbine (Atipamezole) | Patterson Vetrinary | 07-867-7097 | Inject IP after surgery |
| Bupivacaine (Marcaine) | Patterson Vetrinary | 07-890-4584 | Inject SQ at site of incision |
| 4-0 Chromic Gut Suture | Ethicon Inc. | U203H | |
| 4-0 Braided Vicryl Suture | Ethicon Inc. | J304H | |
| 1 ml SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| E. coli UTI89 or CFT073 | ATCC | 700928 | |
| Surgicel Absorbable Hemostat | Ethicon Inc. | ETH1951CS | |
| Biospec 9.4T MRI | Bruker | 94/20 USR |
References
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