Introduction
Nagetier-Modelle wurden verwendet, um zahlreiche menschliche Erkrankungen Manifestationen, einschließlich Pyelonephritis und Harnwegsinfektionen (UTI) zu studieren. UTIs sind ein globales Gesundheitsproblem und können Kinder, Männer und Frauen aller Altersstufen beeinflussen. 1 , 2 , 3 Die anfängliche Manifestation von UTIs umfasst Zystitis, und wenn die Infektion entlang des Harnleiters steigt, kann eine Niereninfektion (Pyelonephritis) folgen. Gleichzeitig nähert sich die Prävalenz von Diabetes 400 Millionen Menschen weltweit. 4 , 5 Wichtig ist, dass die UTI-Inzidenz bei Patienten, die fettleibig sind oder einen Typ-2-Diabetes mellitus haben, bis zu 4-mal höher sein kann, was zu einem erhöhten Risiko einer rezidivierenden UTI-Infektion (RUTI), Sepsis, Nierenfibrose aus Pyelonephritis und Blasenfunktionsstörungen führt. 6 , 7 , 8 NagetierModelle sind wichtig für das Studium von UTIs, da aktuelle Antibiotika-Therapien eine nachhaltige, präventive Reaktion nur in einer Teilmenge von UTI-Patienten produzieren. Zur Verbesserung der klinischen UTI-Pflege sind die wichtigsten Schritte, um den Mechanismus von RUTI und seine pathophysiologischen Prozesse von akuten Infektionen bis hin zur Entzündung der Fibrose sowie die Auswirkungen von Typ-2-Diabetes mellitus zu verstehen.
Das Ziel der Verbesserung der Tiermodelle ist die Entwicklung von Techniken, die eine genauere Bewertung der Krankheitsprogression und therapeutische Interventionen ermöglichen. Es wurden verschiedene Ansätze verwendet, um Pyelonephritis bei Ratten und / oder Mäusen zu induzieren, um die Pathophysiologie der Nierenschäden, die Wirkung der Antibiotika-Behandlung und andere Aspekte des natürlichen Verlaufs von UTIs zu untersuchen. Eine gemeinsame Herangehensweise, um retrograde UTI zu etablieren, ist die transurethrale Katheterisierung. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> Diese Methode führt Bakterien über die Harnröhre in die Harnblase der betäubten Tiere ein. Während diese Technik die menschliche Pyelonephritis genau simuliert, kann die tatsächliche Inzidenz und Größe der Pyelonephritis-Infektion sehr variabel sein, da mehrere Faktoren, einschließlich des Mangels an spontanem ureterischem Reflux oder Harnverhalten während oder unmittelbar nach der Inokulation. 11 Als Ergebnis kann die experimentelle Variabilität bei der Induktion einer aufsteigenden Pyelonephritis-Infektion den Nutzen dieses Modells einschränken, um Niereninfektionen sowie therapeutische Strategien zu untersuchen.
Dieser Bericht beschreibt ein chirurgisches Pyelonephritis-Rattenmodell, bei dem E. coli direkt in die Rattenniere injiziert wird. Trotz dieses Rattenmodells, das invasiv ist, kann die Menge an E. coli, die an die Niere abgegeben wird, effektiv kontrolliert werden, was eine robuste Niereninfektion und eine Entzündung ermöglicht. 14 In diesem Verfahren beschreiben wir auchWie diese induzierten Niereninfektionen in Längsrichtung mit in vivo Magnetresonanztomographie (MRT) überwacht werden können.
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Protocol
Alle Tierstudien wurden nach den genehmigten Protokollen des örtlichen Tierpflege- und -nutzungsausschusses (IACUC) an der Case Western Reserve University durchgeführt. Die Dauer des nachstehend beschriebenen chirurgischen Verfahrens beträgt ca. 45-60 min. Die MRT-Prozedur selbst beträgt ca. 15 min für jeden Zeitpunkt.
1. Anästhesie
- Anästhesieren Sie die Ratte in der Isoflurankammer, die auf 2% Isofluran eingestellt ist, um mit dem Tier gemischt zu werden, um die Tierbehandlung und die Zurückhaltung zu erleichtern, bevor die injizierbare Anästhesie intraperitoneal verabreicht wird.
- Nach 3-5 min Exposition gegenüber Isofluran ist zu prüfen, ob das Tier anästhesiert ist und keine Reaktion auf Zehenknecht zeigt.
- Weitere sedierte Ratte mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus Xylazin und Ketamin: 75 mg / kg Ketamin / 10 mg / kg Xylazin. Bei der Durchführung von intra-peritonealen Injektionen, ziehen Sie die Nadel zurück, um sicherzustellen, dass Teile des Darms oder anderer lebenswichtiger Organe nicht punktiert wurden.
- ich2 mg / kg Bupivacain subkutan an der Stelle des Einschnitts injizieren, um eine topische Schmerzlinderung zu liefern.
2. Vorbereitung des chirurgischen Bereichs
- Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente und Vorräte, bevor sie für die Chirurgie verwendet werden und legen Sie auf dem chirurgischen Pad für Sterilität. Die meisten Instrumente und Zubehör können autoklaviert und wiederverwendet werden.
- Verwenden Sie sterile Handschuhe für alle chirurgischen Eingriffe.
- Verwenden Sie ein elektrisches Rasiermesser, um das Fell von der rechten Seite des Tieres zu rasieren. Rasiere das Tier von der Unterseite des Brustkorbes bis zur Oberseite des Hinterbeins, was einen großen haarfreien Bereich für den Schnitt bietet.
- Lege das Tier auf eine sterile chirurgische Auflage, um den desinfizierten Bereich von den umliegenden Gebieten zu isolieren.
- Die Haut mit einem Desinfektionsmittel wie Povidonjod oder Betadin scheuern. Starten Sie das Schrubben in der Mitte des chirurgischen Geländes und bewegen Sie sich kreisförmig nach außen. Wiederholen Sie mindestens dreimal mit einem neuen Tuch von Povidon Jod oder Betadin. Schrubben Sie die chirurgische Stelle mit 70% Alkoholtupfern, bis die Haut klar ist, da Jod giftig ist, wenn es absorbiert wird.
3. Chirurgische Vorgehensweise
- Halten Sie diese Vorgehensweise unter aseptischen Bedingungen ein.
- Das anästhesierte Tier auf ein warmes Heizbett in der linken seitlichen Dekubitusposition bringen, wobei die rechte Flanke nach oben zeigt.
HINWEIS: Es ist darauf zu achten, dass die Kerntemperatur des Tieres bei 35-37 ° C gehalten wird, um eine Unterkühlung zu verhindern. Dieses Erwärmungsbett sollte auch nach Bedarf sterilisiert werden, um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten. - Fühlen Sie sich für den Brustkorb und machen Sie einen kleinen 2-3 cm rechten dorsalen retroperitonealen Einschnitt mit einer sterilen Größe 10 Skalpell Klinge beginnend am unteren Rand des Brustkorbes.
- Lege sterile Gaze in Längsrichtung auf beiden Seiten des Schnittes.
- Das subkutane Gewebe, Fett und Muskeln zerlegen, um die Bauchhöhle zu visualisieren und zugänglich zu machen. Verwenden Sie eine gekrümmte Mayo-Schere, um tieferes Penet zuzulassenRation in Wunde und schneiden dicke Gewebe.
- Sobald die Leber deutlich sichtbar und zugänglich ist, verwenden Sie stumpfe Pinzette, um die Leber nach oben zurückzuziehen.
- Mit einem anderen Paar von stumpfen Pinzetten in der anderen Hand, stellen Sie die richtige Niere, so dass es sitzt gerade außerhalb der Bauchhöhle.
- Benutze den Zeiger Finger und Daumen der linken Hand, um die Niere in Position zu halten. Mit der rechten Hand langsam und stetig 0,1 ml UTI89 E. coli- Lösung (Konzentration zwischen 1 x 10 8 -1 x 10 9 ) aus einer sterilen Spritze in das Nierenbecken (das als weiße Blase erscheint) einspritzen 15 .
HINWEIS: Den Bakterientiter wie in Referenz 15 beschrieben vorbereiten. - Legen Sie einen Streifen absorbierbaren Hämostat über die Nadel, um den Ausfluss des Inokulums in das Peritoneum zu verhindern. Ziehen Sie langsam die Nadel aus dem Nierenbecken.
HINWEIS: Es ist darauf zu achten, dass die umlaufenden Gewebe nicht durchbohrt oder infiziert werden, was zu einem Ziel-Infecti führtOns und / oder komplikationen. - Verwenden Sie eine größere Spritze, um die Niere gründlich mit normaler Kochsalzlösung zu spülen, bevor Sie sie wieder in die Bauchhöhle legen.
4. Nähte
Anmerkung: Naht, die in Geweben begraben wird, sollte 4-0 nicht resorbierbare geflochtene Nähte sein. Für Körperoberflächen können absorbierbare oder monofile Nähte verwendet werden.
- Setzen Sie die Nähte gleichmäßig und so nah wie möglich an die Gewebekante, um eine Verstopfung des Blutflusses zu verhindern. Typischerweise ist nicht mehr als 0,3 cm von der Kante notwendig.
- Fassen Sie die Haut an und verjüngen Sie sie leicht mit einem Paar feiner Zahnpinzette und drehen Sie den Nadelhalter in eine pronierte Position in Vorbereitung für das Durchstechen der Haut.
- Führen Sie die Nadel durch die volle Dicke der Haut, indem Sie das Handgelenk anspannen, um die Nadel zu drehen und es durch die Haut zu führen.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Hautkante, die dem Einzelnen am nächsten liegt.
- SpannenDie Nähte genug, um den Gewebekanten entgegenzutreten. Je enger wird die Blutversorgung versperren, langsame Wundheilung und kann zu Dehiszenzen führen.
- Binden Sie die Naht mit quadratischen Knoten, als ob es eine einfache unterbrochene Stich wäre, außer dass nur der kurze Strang geschnitten wird, so dass ein 3-4 mm Schwanz.
- Nachdem die erste Masche abgebunden ist, bereite ich mich vor, um eine zweite Masche ca. 3 mm von der ersten weg zu setzen und die laufende Naht fortzusetzen.
- Sobald das Ende des Einschnitts erreicht ist, ziehen Sie nicht die letzte Stich vollständig durch. Verwenden Sie stattdessen die Schlaufe, die mit dem Nadelhalter hier als Kurzstrang gehalten wird, um das distale Ende des Nahtverschlusses zu verkleben.
- Mit Instrumentenbindungen, binden Sie die Naht mit quadratischen Knoten. Dies führt dazu, dass 3 Stränge aus dem fertigen Knoten am distalen Ende aufstehen.
5. Tierrückgewinnung
- Injizieren Sie 2,1 mg / kg Yohimbin intra-peritoneal nach der Operation, um die Anästhesie umzukehren. EINNimals wird erwartet, um vollständig von der chirurgischen Prozedur nach 3-5 Stunden zu erholen.
- Halten Sie das Tier auf einem Heizkissen (um Hypothermie zu vermeiden) und saugfähige weiche Bettwäsche nach der Operation.
- Rehydrierung mit oralen oder parenteralen Flüssigkeiten bereitstellen, bis es zur normalen Fütterung zurückkehren kann (innerhalb von 24 Stunden). Injektion von etwa 0,6 ml normaler Kochsalzlösung sofort nach der Operation, um die Dehydratationseffekte zu begrenzen.
- Bereitstellung von Analgesie, wie im IACUC zugelassenen Tierpflege- und Verwendungsprotokoll beschrieben. 5 mg / kg Carprofen subkutan zur Schmerztherapie injizieren.
- Überwachen Sie die Schnitte regelmäßig auf Schwellungen, Exsudate, Schmerzen oder Dehiszenzen.
6. Validierung mittels Magnetresonanztomographie
- Führen Sie i n vivo MRT-Experimente auf Hochfeld-Kleintier-MRT-Scannern durch.
- Anästhesie mit 3% Isofluran in Sauerstoff induzieren und das Tier mit der rechten Niere bei Isocenter im MRT-Scanner positionieren und entsprechendeAte Hochfrequenzspule. Bereitstellung von Tieren mit 1-2% Isofluran-Anästhesie kontinuierlich während des Imaging-Verfahrens über einen Nosecone.
HINWEIS: Für die in Fig. 1 gezeigten in vivo- MRI-Bilder wurde eine Rattenvolumenspule (Innendurchmesser = 72 mm) verwendet. - Verwenden Sie ein Tierüberwachungs- und Kontrollsystem, um die Atmungsrate jedes Tieres (40-60 Atemzüge / min) und die Kernkörpertemperatur (35 ± 1 ° C) aufrechtzuerhalten.
- Verwenden Sie eine Multi-Slice-, Multi-Echo-Spin-Echo-MRT-Erfassung, um hochauflösende, axiale T2-gewichtete Bilder sowohl der infizierten als auch der Kontroll-Nieren zu erhalten. Typische MRT-Erfassungsparameter sind Wiederholungszeit = 5.000 ms, Echozeit = 40 ms, Scheibendicke = 2,0 mm, flache Raumauflösung = 200 μm, 3 Signaldurchschnitte und eine Erfassungszeit von 8 min.
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Representative Results
Medizinische Bildgebungsverfahren bieten die Möglichkeit, die UTI und die therapeutische Wirksamkeit nicht invasiv zu beurteilen. Daher wurde MRT verwendet, um die Induktion einer akuten Infektion nach der Injektion von 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli zu validieren und die Veränderungen in der Niere vor und nach der Operation zu visualisieren. Abbildung 1a-b zeigt eine zunehmend zunehmende Region der Niereninfektion (gelbe Pfeile). MRT-Bilder, die für jedes Tier an den Tagen 1 und 4 nach der Infektion erhalten werden, charakterisieren das Wachstum der akuten Pyelonephritis-Infektion.
Abbildung 1: Axiale T1-gewichtete MRT-Bilder aus einem E. coli- induzierten Nagetiermodell der Pyelonephritis bei ( a ) Tag 1 und ( b ) Tag 4 nach der Infektion (gelbe Pfeile).
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Discussion
Aufsteigende akute Pyelonephritis bei Nagetieren (dh Mäusen und Ratten) kann durch transurethrale Katheterisierung hergestellt werden. 16 , 17 , 18 Diese transurethrale Infektionsmethode ist insofern vorteilhaft, als sie nicht invasiv ist und die menschliche Pathophysiologie der aufsteigenden Infektion nachahmt. 17 , 18 , 19 , 20 Allerdings kann dieses Verfahren auch unter unregelmäßigen Infektionsraten und variablen E. coli- Dosierung an der Niere aufgrund physiologischer Einschränkungen wie Leere und anatomischer Variation leiden. 11 Fierer et al. (1971) berichteten 6 von 40 (15%) Rattennieren, die nach der Infusion von E. coli in die Blase einen Nachweis von Pyelonephritis zeigten. 15 Weiterhin wurden wiederholte Infusionen von E. coli mehrmals pro Woche benötigt, um zuzuhörenPyelonephritis produzieren 15 , 19
In diesem Bericht beschreiben wir ein alternatives Nagetierpyelonephritis-Modell, das chirurgisch direkt E.Ci direkt in das Nierenbecken einführt. Der primäre Vorteil des chirurgischen Modells der Pyelonephritis-Technik ist die Verabreichung einer konsistenten Dosis von E. coli- Konzentration zwischen 1 x 10 8 - 1 x 10 9 sowie die Injektion der Bakterien an der gleichen anatomischen Stelle (rechtes Nierenbecken) für jeden Tier. 15 Diese direkte Injektion vermeidet die Anforderung an Reflux, die eine zuverlässigere Infektion sowie eine genauere Bestimmung der injizierten Dosis bietet. Insgesamt bietet dieses chirurgische Pyelonephritis-Modell eine alternative Option für Studien, die eine konsistente, reproduzierbare Infektion mit minimalen Auswirkungen des Harnröhren-Reflux erfordern.
Die Optimierung des Erfolgs dieser chirurgischen Technik umfasst:1) Erreichen einer tiefen Anästhesie zur Begrenzung der Atembewegung und ausreichende Arbeitszeit; 2) Rasieren des Bereichs der chirurgischen Inzision, um eine Kontamination von nicht vorgefertigten Bereichen zu verhindern; 3) Sterilisation zur Verhinderung der Verunreinigung; 4) sorgfältige Injektion einer bekannten Dosis von E. coli in das Ratten-Nierenbecken; 5) gründliche Kochsalzlösung Spülung der Niere nach der Injektion; 6) enge Annäherung der Wundränder über Nähte; Und 7) Überwachung von intraoperativen und postoperativen Komplikationen wie Hypothermie und systemischen Nebenwirkungen. Obwohl ein Heizkissen verwendet wurde, um den Tierkomfort zu verbessern, kann dieses Protokoll weiter optimiert werden, indem ein rektaler Temperatursensor verwendet wird, um die Kernkörpertemperatur aufrechtzuerhalten. Ein wichtiger Schritt bei der Erreichung einer erfolgreichen Überlebenschirurgie ist die richtige Anästhesie und die Überwachung der Tieratmung. Wenn dies nicht der Fall ist, führt dies zu einer erweiterten chirurgischen Zeit, um die Anästhesie des Tieres zu stabilisieren und unerwünschte Verletzungen durch übermäßiges Risiko zu begrenzenBewegung. Kompromittierte Sterilität des Arbeitsbereichs und / oder unbeabsichtigte Infektion des Peritoneums mit E. coli- Bakterien sind auch häufige Komplikationen im Zusammenhang mit dem chirurgischen Modell. Daher ist eine adäquate Vorbereitung, um chirurgische Werkzeuge zu autoklavieren, den gesamten Arbeitsraum zu sterilisieren, und prozedurale Bemühungen, zusätzliche E. coli- Infektionen zu begrenzen, unterstützen alle die Minimierung der Tiersterblichkeit sowie fehlerhafte Infektionsergebnisse.
Trotz der Vorteile der direkten Injektion des E. coli in die Niere hat dieses chirurgische Modell der Pyelonephritis auch mehrere Einschränkungen im Vergleich zur transurethralen Verabreichungsmethode. Der größte Nachteil bei der Verwendung der direkten chirurgischen Injektion Ansatz ist die inhärente Invasivität der Technik. Allerdings ist die Mortalität bei der Implementierung einer ordnungsgemäßen Steriltechnik und der Verwendung eines adäquaten Schmerzmanagements, der Temperaturkontrolle über Heizkissen und der weichen, saugfähigen Bettwäsche nach der Operation erheblich geringSorgen für eine schnelle Erholung. Darüber hinaus ist das Autoklavieren von chirurgischen Werkzeugen für die Sterilisation eine äußerst zuverlässige und kostengünstige Methode zur Sterilisation. Die gesamte chirurgische Zeit Engagement ist in der Regel weniger als 1 Stunde. Darüber hinaus sorgt die Verabreichung der Anästhesie sowie die örtliche und systemische Verabreichung von Schmerzmittel, die auf Körpergewicht kalibriert sind, für eine genaue Dosierung und Fachsicherheit. Eine weitere potentielle Einschränkung im chirurgischen Modell ist, dass die chirurgischen Techniken bei Mäusen aufgrund der kleineren anatomischen Größen schwieriger sind. Im Gegensatz zu der transurethralen Methode, die sowohl bei Ratten als auch bei Mäusen implementiert werden kann, erhöht die Anforderung, Rattenmodelle für das chirurgische Modell zu verwenden, die Gesamtkosten der Studie und kann Einschränkungen für die Untersuchung verschiedener genetischer Veränderungen, die leichter verfügbar sein können, beeinträchtigen Und kostengünstig bei Mausmodellen. Wie oben erwähnt, ist eine weitere signifikante Einschränkung des chirurgischen Verfahrens, dass es keine menschliche Pyelonephritis darstellt alsGenau wie die transurethrale Methode.
Hier haben wir MRT-Techniken verwendet, um die Niereninfektionen zu verfolgen. Wie in Abbildung 1 gezeigt , bietet das MRT-Scannen die Möglichkeit, die Niereninfektionen im Laufe der Zeit nicht-invasiv zu überwachen. Ein alternativer Ansatz zur Verfolgung von E. coli- Infektionen ist die fluoreszierende Markierung der Bakterien. 11 , 18 Allerdings ist die Fluoreszenzabbildung bei diesem Rattenmodell (im Gegensatz zu den Mausmodellen) aufgrund der Lichtabsorption durch das Gewebe weniger wirksam, was zu einer stark reduzierten Detektionsempfindlichkeit führt. Daher bietet die MRT ein empfindlicheres Mittel, um E. coli- Infektionen in ihren frühesten Stadien zu verfolgen und regionale Informationen über das Ausmaß der Infektion in drei Dimensionen zu liefern.
Die Mechanismen der UTI / acute Pyelonephritis Pathophysiologie und die Progression zur Nierenfibrose sind schlecht verstanden. Die infizierenden Mittel, die unterLiegende immunologische Wirtsreaktion, und entzündliche Reaktionen spielen eine ganzheitliche Rolle, aber die Bedeutung von jedem ist unbekannt. Die Verbesserung der gezielten Verabreichung von Bakterien an die Niere mit Hilfe dieses Direktinjektionsprozesses hat das Potenzial, die Reproduzierbarkeit der akuten Pyelonephritis bei Nagetiermodellen zu erhöhen und vielleicht die Therapie der frühen Therapie für die Behandlung von UTI genauer zu beurteilen. Diese Methode wurde zunächst als Ansatz zur Optimierung der Abgabe von Bakterien an die Niere entwickelt, hat aber auch die Anwendung auf die Lieferung von anderen Reagenzien und Pathogenen. Diese Methode kann in ähnlicher Weise Vorteile für Studien von Zystitis, Pyelonephritis, UTI und diabetischen Nierenerkrankungen bieten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbing Pad | Fisher | 14-127-47 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisher | 22-415-469 | |
| Latex Surgical Gloves | Henry Schein Animal Health | 21540 | |
| Curved Mayo Scissors | Fisher | S17341 | |
| Straight Blunt Foreceps | Fisher | 08-895 | |
| Scalpel Handle | Fisher | 08-913-5 | |
| Sterile Scalpel Blades | Fisher | 53220 | |
| 1 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 309628 | For bacterial injections |
| 20 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 301031 | For saline wash |
| Hemostat | Seneca Medical | 240267 | |
| 23 G 3/4 in. Needle | BD Biosciences | 305143 | |
| 30 G 1 in. Needle | BD Biosciences | 305128 | |
| U-100 Insulin Syringe | Exel International | 25846 | For medication injections |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Xylazine | Henry Schein Animal Health | 33197 | Inject IP |
| Ketamine | Patterson Vetrinary | 07-881-9413 | Inject IP |
| Yohimbine (Atipamezole) | Patterson Vetrinary | 07-867-7097 | Inject IP after surgery |
| Bupivacaine (Marcaine) | Patterson Vetrinary | 07-890-4584 | Inject SQ at site of incision |
| 4-0 Chromic Gut Suture | Ethicon Inc. | U203H | |
| 4-0 Braided Vicryl Suture | Ethicon Inc. | J304H | |
| 1 ml SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| E. coli UTI89 or CFT073 | ATCC | 700928 | |
| Surgicel Absorbable Hemostat | Ethicon Inc. | ETH1951CS | |
| Biospec 9.4T MRI | Bruker | 94/20 USR |
References
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